单分子荧光能量转移是一种用于追踪核糖体蛋白质合成过程中tRNA动态变化的方法。通过追踪单个核糖体，可以识别出非均质的群体，从而揭示其作用机制。该方法也可广泛用于追踪生物分子的构象变化，以阐明多种复杂生物系统中动态特性与功能之间的关系。单分子方法能够观测到传统系综方法因平均效应而无法捕捉的非限速步骤以及低丰度的关键中间态。
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摘要
摘要
核糖体是一种大型的核糖核蛋白复合物，能够沿着mRNA模板连续组装蛋白质。核糖体的直径约为20 nm，以容纳位于A位、P位和E位的大分子tRNA底物。因此，核糖体的动力学过程会自然地迅速失相。单分子方法可以单独检测每一个核糖体，并区分非均质群体，这对于揭示多组分系统的复杂机制至关重要。我们报道了一种基于尼康Ti2倒置显微镜的单分子FRET（smFRET）方法的详细步骤，用于研究核糖体蛋白L27与tRNA之间的动力学关系。L27在其唯一的Cys 53位点进行标记，并重组到经基因工程改造而缺失L27的核糖体中。tRNA则在其肘部区域进行标记。在延伸循环过程中，随着tRNA在核糖体内移动至不同位置（如转位前和转位后），FRET效率和动力学表现出差异，提示存在多个亚群。这些亚群无法通过系综方法检测到。基于全内反射荧光（TIRF）的smFRET显微镜构建于手动或电动倒置显微镜之上，并配备自行搭建的激光照明系统。核糖体样品通过超速离心纯化后，加载至自行设计的多通道样品池中，再通过倏逝波激光场进行激发。反射激光光斑可用于实现完美焦面的反馈控制。荧光信号由电动滤光轮分光后，由两台数字CMOS相机采集，信号强度通过NIS-Elements软件提取。
引言
核糖体是一种 ø 20 nm大小的核糖核蛋白复合物，由大亚基（50S）和小亚基（30S）组成。它沿mRNA模板协同且连续地组装长肽链。核糖体30S与fMet-tRNA结合fMet mRNA 启动蛋白质合成，随后 50S 亚基结合形成 70S 起始复合物。tRNA 在 A 位点（氨酰-tRNA 结合位点）将氨基酸带入核糖体，而延伸中的肽链则由 P 位点（肽酰-tRNA 结合位点）上的 tRNA 携带。在前移位复合物中，肽链被转移至 A 位点的 tRNA，同时增加一个氨基酸，而 P 位点的 tRNA 则失去肽链成为脱酰 tRNA。随后，A 位点和 P 位点的 tRNA 分别移位至 P 位点和 E 位点，形成后移位复合物，其中 E 位点为 tRNA 的退出位点。在此状态下，肽酰-tRNA 重新回到 P 位点。随着核糖体在 mRNA 上每次移动一个密码子，延伸循环在前移位和后移位构象之间持续进行。1核糖体通过不同功能位点的高度协调，使该过程高效且准确，例如亚基间的旋转运动2tRNA杂交波动3GTP酶活化4L1茎区开闭5因此，核糖体会因每个分子以各自的速度运动而迅速失相。传统方法只能推导出表观平均参数，而低丰度或短寿命的组分将在平均效应中被掩盖
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方案
1. 用于FRET检测的标记核糖体和tRNA的制备
- 分离不含L27的核糖体 E. coli 根据标准方案对菌株 IW312 进行处理20,21. 从常规核糖体中提取 E. coli 菌株 MRE600
- 将带有C端His标签的L27的rpmA基因克隆至pET-21b(+)质粒中，并在BL21(DE3)pLysS细胞中进行转化与表达15通过预装的葡聚糖凝胶柱纯化蛋白质。
- L27的标记
- 在室温（RT）下，将20-100 μM纯化的L27与2-10倍过量的TCEP（Tris-2-carboxyethyl-phosphine）在100 μL体系中孵育30分钟。随后将溶液置换至PBS缓冲液（10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，2.7 mM KCl；0.137 M NaCl）中，使用nap-5柱进行脱盐。加入10倍摩尔过量的Cy5-马来酰亚胺单反应性染料（溶于DMSO），避光室温孵育2小时。
- 将上述标记的蛋白质溶液（500 μL）上样至Nap-5柱，以去除过量染料。确保蛋白质在第一有色条带中洗脱，游离染料则在第二条带中洗脱。用1 m....
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结果
单分子FRET实验中，核糖体在tRNA转运的中间位置进行标记，以区分tRNA从A位到P位的转位过程（图1）15。L27标记残基到A位或P位tRNA的距离分别为52 Å和61 Å，对应的FRET效率为0.47和0.65。图像采集完成后，从供体和受体通道中提取荧光强度，并以时间序列形式绘图（图1）。FRET效率通过公式 Iacceptor/(Iacceptor+Idonor) 计算。一个自制程序可识别供体/受体的单步漂白事件，并对漂白前的数据进行拟合，以避免由噪声导致的FRET计算误差。供体漂白后，两条轨迹均趋近于基线，因为受体无法被直接激发（图2A）。受体漂白后，供体荧光强度上升，因为更少的反应途径消耗激发能（图2B,C）。
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讨论
smFRET 对背景信号敏感。首先，需要用 0.05% Tween 对样品腔室进行包被，然后与核糖体溶液同时加入，以阻断核糖体与表面的非特异性结合。为了观察到受体 Cy5 发射的荧光，必须使用除氧淬灭剂混合液（脱氧葡萄糖和 Trolox 溶液）。若无此溶液，受体通道的漂白速度过快，无法获得有效信息。对于核糖体实验而言，另一个关键步骤是在玻璃表面进行 PEG 包被。核糖体活性对表面环境敏感，因此需要使用长链刷状聚合物以屏蔽不利的表面效应。
如果样品台距离焦平面过远，自动聚焦系统将无法工作。若发生此情况，请关闭自动聚焦，同时通过观察反射的激光光斑手动调节物镜位置。这是自制全内反射照明系统的一个优势，因为激光光斑可见。当物镜接近焦点时，入射和反射的激光光斑应并排出现，且反射光斑会随物镜位置的调节而移动。当这两个光斑接近时，自动聚焦系统即可恢复工作。
smFRET 的一个局限性在于其浓度范围非常低。为了避免产生抑制性的背景噪声，荧光标记底物的浓度最高只能达到 50 nM。尽管表面固定的样品可以在同一分子上进行长时间采集，但其时间分辨率.......
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披露
Y. Wang 声明不存在利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R01GM111452）和威尔奇基金会（E-1721）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨基硅烷 | Laysanbio | MPEG-SIL-5000 | |
| 生物素-PEG | Laysanbio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| BL21(DE3)pLysS 细胞 | Novagen | 71403 | |
| 过氧化氢酶 | millipore sigma | C3515 | |
| CS150FNX 微型超速离心机 | nuaire | ||
| Cy3/C5-马来酰亚胺 | ApexBio | A8138/A8140 | |
| ECLIPSE Ti2 倒置显微镜 | Nikon | ||
| EdgeGARD 层流罩 | Baker | ||
| 葡萄糖氧化酶 | millipore sigma | G2133 | |
| Histrap HP 柱（预装 Sepharose 柱） | Cytiva | 17524701 | |
| 显微镜盖玻片 | VWR | 48393-230 | |
| 显微镜载玻片 | VWR | 470235-792 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 相机 | Hamamatsu | ||
| PEG (5,000) | Laysanbio | MPEG-SVA-5000 | |
| pET-21b (+) 质粒 | Novagen | 69741 | |
| 超声波破碎仪 | VWR | CPX-952-518R | |
| TCEP | Apexbio | B6055 | |
| 抗坏血酸盐（Trolox） | millipore sigma | 238813 |
参考文献
- Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
- Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793....
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