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方法文章

单分子荧光能量转移研究核糖体蛋白质合成

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DOI：

10.3791/62664

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2021年7月6日

1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

本文内容

摘要

单分子荧光能量转移是一种用于追踪核糖体蛋白质合成过程中tRNA动态变化的方法。通过追踪单个核糖体，可以识别出非均质的群体，从而揭示其作用机制。该方法也可广泛用于追踪生物分子的构象变化，以阐明多种复杂生物系统中动态特性与功能之间的关系。单分子方法能够观测到传统系综方法因平均效应而无法捕捉的非限速步骤以及低丰度的关键中间态。

摘要

核糖体是一种大型的核糖核蛋白复合物，能够沿着mRNA模板连续组装蛋白质。核糖体的直径约为20 nm，以容纳位于A位、P位和E位的大分子tRNA底物。因此，核糖体的动力学过程会自然地迅速失相。单分子方法可以单独检测每一个核糖体，并区分非均质群体，这对于揭示多组分系统的复杂机制至关重要。我们报道了一种基于尼康Ti2倒置显微镜的单分子FRET（smFRET）方法的详细步骤，用于研究核糖体蛋白L27与tRNA之间的动力学关系。L27在其唯一的Cys 53位点进行标记，并重组到经基因工程改造而缺失L27的核糖体中。tRNA则在其肘部区域进行标记。在延伸循环过程中，随着tRNA在核糖体内移动至不同位置（如转位前和转位后），FRET效率和动力学表现出差异，提示存在多个亚群。这些亚群无法通过系综方法检测到。基于全内反射荧光（TIRF）的smFRET显微镜构建于手动或电动倒置显微镜之上，并配备自行搭建的激光照明系统。核糖体样品通过超速离心纯化后，加载至自行设计的多通道样品池中，再通过倏逝波激光场进行激发。反射激光光斑可用于实现完美焦面的反馈控制。荧光信号由电动滤光轮分光后，由两台数字CMOS相机采集，信号强度通过NIS-Elements软件提取。

引言

核糖体是一种 ø 20 nm大小的核糖核蛋白复合物，由大亚基（50S）和小亚基（30S）组成。它沿mRNA模板协同且连续地组装长肽链。核糖体30S与fMet-tRNA结合fMet mRNA 启动蛋白质合成，随后 50S 亚基结合形成 70S 起始复合物。tRNA 在 A 位点（氨酰-tRNA 结合位点）将氨基酸带入核糖体，而延伸中的肽链则由 P 位点（肽酰-tRNA 结合位点）上的 tRNA 携带。在前移位复合物中，肽链被转移至 A 位点的 tRNA，同时增加一个氨基酸，而 P 位点的 tRNA 则失去肽链成为脱酰 tRNA。随后，A 位点和 P 位点的 tRNA 分别移位至 P 位点和 E 位点，形成后移位复合物，其中 E 位点为 tRNA 的退出位点。在此状态下，肽酰-tRNA 重新回到 P 位点。随着核糖体在 mRNA 上每次移动一个密码子，延伸循环在前移位和后移位构象之间持续进行。1核糖体通过不同功能位点的高度协调，使该过程高效且准确，例如亚基间的旋转运动2tRNA杂交波动3GTP酶活化4L1茎区开闭5因此，核糖体会因每个分子以各自的速度运动而迅速失相。传统方法只能推导出表观平均参数，而低丰度或短寿命的组分将在平均效应中被掩盖6单分子方法可通过单独检测每个核糖体，进而通过统计重构识别不同种类，从而突破这一限制7. 已采用不同的标记位点来研究核糖体动力学，例如tRNA与tRNA之间的相互作用8EF-G-L119L1- tRNA10此外，通过分别标记大亚基和小亚基，可观察亚基间的旋转动力学及其与因子的协同作用11,12同时，smFRET 方法在其他核心生物学过程中具有广泛应用，且多色 FRET 技术正在不断发展。13.

此前已开发出一种新型的核糖体FRET探针对14,15。重组核糖体蛋白L27已被表达、纯化并标记，随后重新整合至核糖体中。该蛋白与tRNA在空间上靠近，有助于稳定转位后复合物中的P位点tRNA。当tRNA从A位点移动至P位点时，该蛋白与tRNA之间的距离缩短，这一变化可通过smFRET信号加以区分。通过统计学方法和定点突变技术已鉴定出多种核糖体亚群，这些亚群在转位前复合物中可发生自发互换，但在转位后复合物中则不能，表明核糖体在沿mRNA移动前具有更高的柔性，而在解码过程中则更为刚性16,17,18。这些构象变化对核糖体功能至关重要。本文方案详细描述了核糖体/tRNA的标记、其在核糖体中的整合、smFRET样品制备以及数据采集与分析流程19。

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方案

1. 用于FRET检测的标记核糖体和tRNA的制备

  1. 分离不含L27的核糖体 E. coli 根据标准方案对菌株 IW312 进行处理20,21. 从常规核糖体中提取 E. coli 菌株 MRE600
  2. 将带有C端His标签的L27的rpmA基因克隆至pET-21b(+)质粒中，并在BL21(DE3)pLysS细胞中进行转化与表达15通过预装的葡聚糖凝胶柱纯化蛋白质。
  3. L27的标记
    1. 在室温（RT）下，将20-100 μM纯化的L27与2-10倍过量的TCEP（Tris-2-carboxyethyl-phosphine）在100 μL体系中孵育30分钟。随后将溶液置换至PBS缓冲液（10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，2.7 mM KCl；0.137 M NaCl）中，使用nap-5柱进行脱盐。加入10倍摩尔过量的Cy5-马来酰亚胺单反应性染料（溶于DMSO），避光室温孵育2小时。
    2. 将上述标记的蛋白质溶液（500 μL）上样至Nap-5柱，以去除过量染料。确保蛋白质在第一有色条带中洗脱，游离染料则在第二条带中洗脱。用1 mL TAM缓冲液收集洗脱的蛋白质10 缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 7.5），10 mM Mg(OAc)₂）2，30 mM NH4Cl，70 mM KCl，0.5 mM EDTA 和 7 mM BME（2-巯基乙醇）。
  4. 用 L27 重建核糖体。将标记的 L27 蛋白与等量的 IW312 核糖体在 TAM 中混合10 缓冲液中37 °C孵育1小时。通过蔗糖垫超速离心（100,000 x g，过夜），使核糖体在离心管底部形成蓝色沉淀。
  5. 标记tRNA苯丙氨酸 根据先前已发表的报告22首先，将tRNA（10 A260 在1 mL水中的100 μL NaBH4 （100 mM 储备液，逐滴加入），在 0 °C 下反应 1 小时。将 tRNA 从未反应的 NaBH 中释放出来4 通过加入1/10体积的3 M KAc（pH 5.0）和2.5倍体积的乙醇，进行三次乙醇沉淀。在最小体积（约20 μL）的0.1 M甲酸钠缓冲液（pH 3.7）中，将还原的tRNA与1 μL Cy3-NHS荧光染料溶液（1 mg溶于10 μL DMSO）于37 °C孵育2小时。孵育结束后，使用小型G25 Sephadex柱去除未反应的染料，随后通过两次乙醇沉淀去除游离染料。

2. 核糖体复合物的制备

  1. 使用标准方法表达并纯化带有 His 标签的 IF1、IF2、IF3、EF-G、EF-Tu、EF-Ts 和 tRNA 合成酶蛋白15。
  2. 在 TAM10 缓冲液中加入以下组分，于 37 °C 孵育 15 分钟，制备起始混合物：1 µM 标记核糖体；IF1、IF2 和 IF3 各 1.5 µM；2 µM 生物素标记的 mRNA（编码前两个氨基酸 MF）；4 µM 负载的 fMet-tRNAfMet；以及 1 mM GTP。
  3. 在 TAM10 缓冲液中加入以下组分，于 37 °C 孵育 15 分钟，制备 EF-Tu_G 混合物：4 µM EF-Tu、0.4 µM EF-Ts、2 µM EF-G、4 mM GTP、4 mM PEP 和 0.02 mg/mL 丙酮酸激酶。
  4. 参照步骤 2.3 制备 EF-Tu_NoG 混合物，但不添加 EF-G。
  5. 在无核酸酶的水中加入以下组分，于 37 °C 孵育 15 分钟，制备 Phe 混合物：100 mM Tris（pH 7.5）、20 mM MgAc2、1 mM EDTA、4 mM ATP、7 mM BME、2 mM 苯丙氨酸特异性合成酶、2 A260/mL 标记的 tRNAPhe 和 50 μM 苯丙氨酸。
  6. 将起始混合物、EF-Tu_NoG 混合物和 Phe 混合物按 1:2:2 的比例混合，在 37 °C 孵育 2 分钟，制备前转位复合物（PRE）。孵育后，通过 1.1 M 蔗糖垫在 100,000 x g 条件下超速离心过夜，纯化 PRE。
  7. 将起始混合物、EF-Tu_WG 混合物和 Phe 混合物按 1:2:2 的比例混合，在 37 °C 孵育 10 分钟，制备后转位复合物（POST）。孵育后，通过 1.1 M 蔗糖垫在 100,000 x g 条件下超速离心过夜，纯化 POST。

3. 样品载玻片的制备

  1. 清洗载玻片（75 mm × 25 mm），其上含有六对孔（直径为 1 mm），每对孔构成样品室的一个进样-出样通道。确保每个进样-出样孔之间的距离为 13 mm，两个通道中心之间的距离为 6 mm。将六片载玻片放入玻璃坩埚中。
  2. 向坩埚中加入丙酮，超声处理 5 分钟。倾去丙酮，用超纯水冲洗载玻片三次。再次向坩埚中加满水，并加入 1 mL 的 10 M KOH。超声处理 20 分钟。
  3. 用超纯水冲洗载玻片三次。再次向坩埚中加入乙醇，超声处理 5 分钟。彻底倾去溶剂，将载玻片置于通风橱中自然干燥。
  4. 清洗显微镜盖玻片（#1.5 厚度，24 mm × 40 mm）。清洗步骤同 3.1–3.3 步所述。
  5. 将清洗后的载玻片和盖玻片在 300 °C 下烘烤 3 小时。随后关闭炉温，让其在炉内过夜自然冷却。
  6. 用氨基硅烷（aminosilane）对盖玻片进行包被。在盛有盖玻片的坩埚中，加入甲醇混合液（100 mL 甲醇、5 mL 水、0.5 mL HAc 和 1 mL 氨基硅烷）。将坩埚置于水浴中加热 10 分钟，超声处理 10 分钟，再继续在水浴中加热 10 分钟。倾去甲醇混合液，用三份洁净的水充分冲洗盖玻片。用连接针头的干燥氮气流吹扫表面。
  7. 在层流通风罩中对盖玻片进行生物素-聚乙二醇（biotin-PEG）包被。
    1. 配制 PEG 溶液：将 98 mg PEG 和 2–3 mg 生物素-PEG 溶于 200 μL 的 100 mM NaHCO3 溶液中。
    2. 将一片盖玻片平放于台面，在其顶部边缘小心滴加 60 μL PEG 溶液。然后将另一片盖玻片覆盖其上，利用毛细作用使溶液均匀分布于两片盖玻片之间，确保无气泡产生。
    3. 重复步骤 3.7.2，再处理两对盖玻片。共包被六片盖玻片用于生物素修饰。若需更多盖玻片，应相应增加 PEG 和生物素-PEG 的用量以配制更多 PEG 溶液。
    4. 将这些盖玻片置于装有水的空枪头盒中，避光孵育 3 小时。
    5. 3 小时后，将盖玻片分开，依次在三个连续的坩埚中用水冲洗，并用干燥氮气流吹扫。将包被后的盖玻片放置于陶瓷架上，并标记有包被的一面。
  8. 组装样品室19。
    1. 将尖锐的移液器头穿过玻璃载玻片上的孔，直至紧密贴合。刮除尖端部分，使其完全与玻璃表面齐平。将移液器头的另一端剪至约 5 mm，用于样品加载。
    2. 裁剪带有通道图案的双面胶带（25 mm × 40 mm）。
    3. 将双面胶带粘贴在玻璃载玻片的平整面上。
    4. 将包被好的盖玻片贴附在双面胶带上，轻轻按压以确保样品室密封良好，并确保包被面朝向内侧。

4. 单分子FRET成像

  1. 打开计算机。
  2. 打开显微镜电源开关。
  3. 启动激光控制界面并打开激光器。按下激光控制盒上的启用按钮，使激光器预热。
  4. 打开相机。
  5. 启动与显微镜配套的软件程序。点击上方快门关闭，然后点击光源开启。
  6. 通过将10 μL的5% Tween-20加入1 mL TAM10缓冲液中，配制TAM10_WT缓冲液。
  7. 取一小离心管，称取3 mg葡萄糖氧化酶，用于配制去氧溶液。加入45 μL过氧化氢酶，轻轻涡旋使固体溶解。在微量离心机中以20,000 × g离心1分钟，取上清液。
  8. 配制30%葡萄糖水溶液和200 mM Trolox的DMSO溶液。
  9. 用无核酸酶水配制0.5 mg/mL的链霉亲和素溶液。
  10. 在TIRF物镜上滴加一滴成像油。
  11. 将样品腔室放置在物镜上。
  12. 向腔室内加入10 μL链霉亲和素溶液，静置1分钟。
  13. 用30 mL TAM10_WT缓冲液冲洗腔室，并用折叠的滤纸收集流出液。静置1分钟。
  14. 用TAM10_WT缓冲液将核糖体复合物（PRE或POST）稀释至10–50 nM浓度。
  15. 将20 μL核糖体样品加入通道中，静置2分钟。
  16. 配制成像缓冲液（50 μL TAM10缓冲液，分别加入0.5 μL去氧溶液、葡萄糖溶液和Trolox溶液），充分混匀。
  17. 用30 μL成像缓冲液冲洗腔室。
  18. 设置相机参数为100 ms/帧、16位、4 × 4 binning。
  19. 点击上方快门开启，并关闭光源关闭。
  20. 开始相机采集，将图像分至三个窗口，分别代表两个独立相机图像及叠加图像。
  21. 点击自动对焦，微调以获得最佳焦距。
  22. 选择一个方法，设置视野点、文件存储路径和循环次数。
  23. 点击运行。
    注意：将弹出一个新窗口显示实时成像画面，时间序列和视野序列的进度显示在窗口顶部。
  24. 图像采集完成后，关闭弹出窗口。
  25. 打开ND文件（采集所得文件）。
  26. 点击ROI/简单ROI编辑器，选择圆形选项。
  27. 在图像上选择感兴趣区域（ROI），完成后点击完成。
  28. 点击测量/时间测量，以图表或电子表格形式显示数据。
  29. 打开导出选项卡，设置导出参数。
  30. 点击导出以保存强度数据。

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结果

单分子FRET实验中，核糖体在tRNA转运的中间位置进行标记，以区分tRNA从A位到P位的转位过程（图1）15。L27标记残基到A位或P位tRNA的距离分别为52 Å和61 Å，对应的FRET效率为0.47和0.65。图像采集完成后，从供体和受体通道中提取荧光强度，并以时间序列形式绘图（图1）。FRET效率通过公式 Iacceptor/(Iacceptor+Idonor) 计算。一个自制程序可识别供体/受体的单步漂白事件，并对漂白前的数据进行拟合，以避免由噪声导致的FRET计算误差。供体漂白后，两条轨迹均趋近于基线，因为受体无法被直接激发（图2A）。受体漂白后，供体荧光强度上升，因为更少的反应途径消耗激发能（图2B,C）。

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讨论

smFRET 对背景信号敏感。首先，需要用 0.05% Tween 对样品腔室进行包被，然后与核糖体溶液同时加入，以阻断核糖体与表面的非特异性结合。为了观察到受体 Cy5 发射的荧光，必须使用除氧淬灭剂混合液（脱氧葡萄糖和 Trolox 溶液）。若无此溶液，受体通道的漂白速度过快，无法获得有效信息。对于核糖体实验而言，另一个关键步骤是在玻璃表面进行 PEG 包被。核糖体活性对表面环境敏感，因此需要使用长链刷状聚合物以屏蔽不利的表面效应。

如果样品台距离焦平面过远，自动聚焦系统将无法工作。若发生此情况，请关闭自动聚焦，同时通过观察反射的激光光斑手动调节物镜位置。这是自制全内反射照明系统的一个优势，因为激光光斑可见。当物镜接近焦点时，入射和反射的激光光斑应并排出现，且反射光斑会随物镜位置的调节而移动。当这两个光斑接近时，自动聚焦系统即可恢复工作。

smFRET 的一个局限性在于其浓度范围非常低。为了避免产生抑制性的背景噪声，荧光标记底物的浓度最高只能达到 50 nM。尽管表面固定的样品可以在同一分子上进行长时间采集，但其时间分辨率...

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披露

Y. Wang 声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R01GM111452）和威尔奇基金会（E-1721）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氨基硅烷LaysanbioMPEG-SIL-5000
生物素-PEGLaysanbioBiotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS 细胞Novagen71403
过氧化氢酶millipore sigmaC3515
CS150FNX 微型超速离心机nuaire
Cy3/C5-马来酰亚胺ApexBioA8138/A8140
ECLIPSE Ti2 倒置显微镜Nikon
EdgeGARD 层流罩Baker
葡萄糖氧化酶millipore sigmaG2133
Histrap HP 柱（预装 Sepharose 柱）Cytiva17524701
显微镜盖玻片VWR48393-230
显微镜载玻片VWR470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 相机Hamamatsu
PEG (5,000)LaysanbioMPEG-SVA-5000
pET-21b (+) 质粒Novagen69741
超声波破碎仪VWRCPX-952-518R
TCEPApexbioB6055
抗坏血酸盐（Trolox）millipore sigma238813

参考文献

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