多模态相变卟啉液滴的合成与表征

摘要

本方案概述了多模态相变卟啉液滴的合成与表征方法。

摘要

相变液滴是一类可转化为具有回声特性的微泡的超声造影剂 原位 通过施加足够的声能，液滴的尺寸比微泡更小且更稳定。然而，传统的超声造影剂无法通过声学反馈测量以外的手段进行追踪，这使得造影剂的生物分布或蓄积量难以定量 离体 困难。研究人员可能不得不依赖荧光或光学吸收型伴随诊断颗粒来推断生物分布情况。本实验方案的目的是详细描述采用冷凝法制备多模态相变卟啉液滴的步骤。卟啉是一类具有独特吸收带的荧光分子，可共价连接至脂质并整合入液滴中，从而扩展液滴的多功能性，在保留声学特性的同时实现更可靠的生物分布。本研究制备了七种不同卟啉脂质与基础脂质含量的配方，以研究微泡和液滴的粒径分布。方案中还描述了适用于含卟啉结构的表征方法，以展示其在溶液中的分析多功能性。粒径分析显示，冷凝后液滴的平均直径比前体群体小1.72至2.38倍。吸收光谱表征显示，完整组装体的Q带峰值为700 nm，而破裂样品的吸收峰位于671 nm。荧光表征显示，含30%卟啉脂质的完整组装体呈现荧光淬灭（>97%），并在破坏后实现荧光恢复。声致爆破实验表明，卟啉液滴在较低压力下无回声信号，但在足够高的压力下可转化为具有回声信号的微泡。这些表征结果表明，卟啉液滴有望消除在递送或治疗应用中依赖吸收光或荧光检测的伴随诊断策略，以量化超声造影剂体内分布的需求。 体内 或 离体.

引言

超声成像是一种利用声波的非侵入性、非电离型医学成像技术。尽管超声扫描仪具有更高的便携性并能提供实时图像，但超声成像可能存在对比度低的问题，使得超声医师难以可靠地区分回声特性相似的病理特征。为克服这一局限，可向机体注射微泡以提高血管对比度。微泡是一种微米级的充气型对比剂，对声波具有高度回声性，可显著增强血管对比度^1,2。微泡的外壳和气体核心可根据不同应用需求进行设计，例如用于成像、溶栓、细胞膜通透性增强或短暂性血管开放²。

微泡的一个缺点是其血液循环半衰期较短。例如，临床上可用的全氟丁烷脂质微球的半衰期仅为1.3分钟³。对于长时间的成像过程，需要多次注射微泡。微泡的另一个缺点是其直径较大。尽管全氟丁烷脂质微球的直径约为1至3 µm，足够小以在血管系统中循环，但它们仍过大，无法外渗并被动积聚到目标组织（如肿瘤）中⁴。克服这些局限性的一种策略是将气核微泡压缩为更小的液核液滴^5,6。虽然液滴在其液态下不具备回声特性，但当暴露于足够高峰值负压的超声波时，可被汽化为微泡，从而恢复其产生对比的能力。这种方法使得液滴能够利用小尺寸液核更优越的药代动力学特性 ，同时在受到超声辐照时仍能提供对比效果，且不改变其化学组成^4,7。

全氟丁烷是一种理想的全氟碳化合物，可在气态与液态之间发生相变^5,6,7。全氟丁烷仅需降低温度即可使微泡冷凝成液滴，而密度较低的全氟碳化合物则需要额外加压⁵。这种温和的方法可在冷凝过程中最大限度地减少微泡的破坏^7,8,9。由于液滴核心呈液态，因此无回声性，在超声下不可见。然而，当施加足够的声能或热能时，液态核心可再次汽化为气态，形成具有回声性的微泡⁸。这种汽化过程使得微泡的生成时间和空间位置得以控制。

虽然液滴适用于被动富集， 原位 汽化，或提高细胞通透性⁴液滴（及其碎片）无法被成像或定量 离体因此，可量化的伴随诊断试剂，例如荧光^4,10,11，磁性 颗粒¹²，光吸收剂¹³，被用作模拟物以评估液滴向目标组织的递送情况。例如，Helfield 等人采用荧光纳米微珠共注射方法，对小鼠器官的组织学图像进行定量分析 因为无法通过荧光检测到液滴⁴伴随诊断试剂的缺点在于，可追踪组分可能根据其自身的药代动力学特征独立于液滴发挥作用。

幸运的是，微泡和液滴的外壳可以进行定制。例如，Huynh 等人展示了具有卟啉-脂质外壳的超声造影剂，从而制备出多模态微泡¹⁴。卟啉是一类具有芳香族大环结构的有机化合物^14,15。它们具有光吸收性、荧光性，并可与多种金属螯合，用于放射治疗、基于放射性核素的成像或基于痕量金属的定量分析¹⁴。一种典型的卟啉是焦脱镁叶绿酸（pyropheophorbide, Pyro）。通过将 Pyro 与脂质偶联，并将 Pyro-脂质整合到微泡或液滴中，可实现通过多种模式对其进行成像和追踪：声学、荧光以及吸收光谱¹⁴。这种多模态造影剂可用于追踪和定量其富集情况。由于可定量组分已直接偶联在外壳上，因此可无需额外的伴随诊断试剂，从而实现更精确的递送定量¹⁶。

本文概述了一种制备多模态相变卟啉液滴的实验方案。由于超声造影剂可作为将药物递送至特定组织（如肿瘤）的平台，^2,4，将其检测范围扩展到超声之外可能有助于量化递送效率。这些液滴的目的是提供可追踪的超声造影剂，能够被动富集 体内, 原位 汽化与声学，以及定量分析生物分布或累积的潜力 离体 无需依赖次级传感器即可实现器官定位。文中还概述了表征方法，以展示卟啉液滴作为生物分布传感器的潜力。同时讨论了壳层中吡咯脂质负载量（摩尔比0%至50%）的影响。

方案

1. 脱水脂质膜

1. 计算所需每种壳组分的质量（参见补充文件“脂质计算表”）。
   注意：本方案中，壳的组成为：10 摩尔% 的 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000] 铵盐（DSPE-PEG5K）、x 摩尔% 的焦脱镁叶绿酸偶联的 1-硬脂酰基-2-羟基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（Pyro-SPC），以及 (90 - x) 摩尔% 的 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC）。Pyro-SPC 的用量将在 7 种壳组成中变化（x = 0, 1, 10, 20, 30, 40, 50）。请核对库存瓶上 DSPE-PEG5K 的分子量。
   1. 可根据需要按比例缩放脂质总体积，最小体积为 1 mL。本方案中，所有制剂均采用总脂质体积为 10 mL、总脂质浓度为每毫升 1 mg 的条件。辅料溶液组成为：10% 丙二醇、10% 甘油和 80% 磷酸盐缓冲液（PBS, 1X, pH 7.4）（体积比）（参见步骤 2.3 和“脂质计算表”）。
      注意：Pyro-脂质的合成方案详见补充文件“其他方案与数据”中的步骤 S1 至 S1.19，该方案改编自 Zheng 等人的研究¹⁵。
2. 根据计算出的质量（参见步骤 1.1 和“脂质计算表”），称取每种非 Pyro-脂质，并转移至一个大小合适的带螺口盖的硼硅酸盐玻璃小瓶中。
3. 盖紧瓶盖，标记瓶身和瓶盖，并用铝箔包裹脂质小瓶的底部和瓶壁。在本方案后续步骤中，该小瓶将被称为“脂质小瓶”。将脂质小瓶储存于阴凉、干燥、避光处。
4. 若配方中含有 Pyro-SPC，则将 10 mg 的 Pyro-SPC 干膜（参见“其他方案与数据”）溶解于 1 mL 氯仿中。涡旋 5 秒，测定吸光度，并计算需加入脂质小瓶的 Pyro-SPC 体积。
   注意：氯仿具有健康危害性，为刺激性有毒物质。操作时应穿戴防护实验服、护目镜、手套，并避免吸入蒸气。
   ​注意：由于 Pyro-SPC 对光敏感，操作时应尽可能降低工作区域的光照强度。不使用时应保持 Pyro-SPC 密封并遮光保存。
   1. 在紫外-可见分光光度计上设置波长扫描范围为 800 nm 至 300 nm，步长 0.5 nm，使用兼容的 1 cm 光程比色皿，加入 2000 µL 纯甲醇测定基线。
      注意：甲醇具有健康危害性，为刺激性、有毒且易燃物质。操作时应穿戴防护实验服、护目镜、手套，并避免吸入蒸气。远离火花和热源。
   2. 将 2 µL 氯仿中的 Pyro-SPC 加入 2000 µL 甲醇中，涡旋 30 秒。转移至洁净的兼容 1 cm 比色皿中，测定吸光度。若 667 nm 处的吸光度峰值超出紫外-可见分光光度计的检测范围，应调整稀释倍数。
      注意：每次转移氯仿或甲醇时，建议使用洁净的玻璃注射器或正排量移液器，而非机械移液器，以提高准确性。
   3. 重复步骤 1.4.2 两次，共获得三组吸光度数据。
   4. 取 667 nm 处吸光度峰值的平均值，并使用以下公式计算脂质小瓶所需的氯仿中 Pyro-SPC 体积^14,15：
      
      其中 V 为所需氯仿中 Pyro-SPC 的体积，m 为所需 Pyro-SPC 的质量（参见步骤 1.1 和“脂质计算表”），M 为 Pyro-SPC 的分子量（1040.317 g·mol^-1），A 为 667 nm 处的平均吸光度，d 为基于甲醇与氯仿中 Pyro-SPC 体积的稀释倍数（步骤 1.4.2），L 为比色皿光程（1 cm），ε 为 Pyro-SPC 在 667 nm 处的摩尔衰减系数（45000 L·mol^-1·cm^-1）。
      ​注意：该公式的分母为比尔-朗伯定律，用于描述溶液中分析物浓度与其在一定距离内测得的光学吸光度之间的关系。
   5. 使用洁净的玻璃注射器将上一步计算出的氯仿中 Pyro-SPC 体积加入脂质小瓶（图 1A），然后盖紧并包裹小瓶。
      注意：图 1 仅展示 30% Pyro-脂质配方。
   6. 若氯仿中仍有剩余的 Pyro-SPC：在通风橱中打开步骤 1.4 中的 Pyro-SPC + 氯仿小瓶，将小瓶部分倾斜至一侧，并尽可能轻柔地持续通入氮气。旋转小瓶，利用氮气流吹干氯仿，使 Pyro-SPC 均匀涂布于小瓶内壁。确保无飞溅，且溶液不洒出。
   7. 当 Pyro-SPC 脂质膜看起来已干燥并均匀涂布于瓶壁后，关闭氮气流。盖紧瓶盖，用石蜡膜密封瓶口，并将小瓶于 -20 °C 黑暗条件下储存。
5. 配制 90% 氯仿和 10% 甲醇（体积比）的溶液，取 5 mL 加入脂质小瓶中。盖紧脂质小瓶，轻轻旋转混匀内容物（图 1B）。
   注意：若配方中含有磷脂酸类脂质（如 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐（DSPA）），则应改用 60% 氯仿、32% 甲醇和 8% 超纯水（体积比）加入脂质小瓶。可能需要更剧烈的旋转以充分溶解脂质。
6. 在通风橱中打开脂质小瓶，将小瓶部分倾斜至一侧，并尽可能轻柔地持续通入氮气。旋转脂质小瓶，利用氮气流吹干溶液，使脂质膜均匀涂布于小瓶内壁。确保无飞溅，且溶液不洒出。
7. 当脂质看起来已干燥并均匀涂布于小瓶内壁（图 1C）后，关闭氮气流，用铝箔包裹脂质小瓶的底部和瓶壁，并用针在铝箔上扎几个小孔后覆盖瓶口以利于通气（图 1D）。
8. 标记后将包裹好的脂质小瓶放入真空干燥器中，继续干燥至少 24 小时，但不超过 72 小时。
   ​注意：本方案可在 24 至 72 小时后继续进行。

2. 脂质水合

1. 将水浴超声仪中注满水，并加热至 70 °C。开启超声功能以帮助混匀水温。
   注意：水和超声仪处于高温状态，请避免接触水和超声仪。佩戴护目镜、防护实验服和防护手套。
2. 当水浴超声仪温度达到 70 °C 后，从真空干燥器中取出脂质小瓶。如有可能，降低工作区域的光照强度。
3. 配制赋形剂溶液：10% 丙二醇、10% 甘油、80% PBS（% v/v/v），取 10 mL 加入脂质小瓶中（参见步骤 1.1.1 及“脂质配方表”）。
   注：若使用标准空气置换式移液器，在处理丙二醇和甘油等黏稠溶剂时需格外小心。吸液和排液时应缓慢操作，并等待残留液体完全流至移液器吸头底部。转移液体时动作应缓慢，确保液体不附着在移液器吸头外壁。
4. 盖紧脂质小瓶瓶盖，去除铝盖，将小瓶轻轻置于开启超声功能的水浴中超声 15 分钟，以溶解脂质。确保脂质小瓶的瓶颈部分高于水面。操作过程中应不时检查瓶盖是否密封牢固。
   1. 可偶尔将脂质小瓶从水浴中取出，短暂置于光源下观察内容物是否完全溶解（图 1E）。
   2. 若脂质小瓶内容物未完全均一化，将其从水浴超声仪中取出，确保瓶盖紧固后更剧烈地涡旋混匀，再放回水浴超声仪中。
5. 将脂质小瓶从水浴超声仪中取出，并关闭水浴超声仪。用纸巾擦干脂质小瓶外壁，重新标记脂质小瓶。
6. 用铝箔包裹脂质小瓶，并在阴凉、避光、干燥的环境中室温冷却 10 分钟。
7. 分装脂质小瓶中的内容物：每支 3 mL 硼硅酸盐玻璃透明血清小瓶（内口直径 7 mm，外口直径 13 mm）中分装约 2 mL 脂质溶液。
   注：某些实验方案可能在 3 mL 小瓶中使用 1.5 mL 脂质溶液⁷。
8. 使用冻干级灰色氯丁基橡胶塞（内口直径 7 mm，外口直径 13 mm）密封血清小瓶，并用可撕式铝盖（外口直径 13 mm）和压盖器固定橡胶塞（图 1F）。
9. 对每支血清小瓶中的脂质溶液进行抽真空、脱气和再加压处理^4,5,7（图 2）。
   注：有关气体交换装置的组装说明及更多细节，请参阅“其他实验方案与数据”。
   1. 关闭压力阀 A 至气体钢瓶阀之间的所有阀门（包括两端阀门）（图 2）。将血清小瓶连接至歧管针头，打开相应的歧管阀门，随后打开真空阀 A 和真空阀 B，在 -90 kPa（-13 psi，-900 mbar）条件下抽真空 5 分钟以去除空气。切勿将液体抽走（参见“其他实验方案与数据”步骤 S3 至 S3.1.5）。
      注意：若操作不当，真空泵可能发生爆裂。请勿将真空泵用于有机物、酸性或碱性化学品。
   2. 保持真空状态，用手握住一支血清小瓶（防止其摆动），用笔或记号笔快速轻敲以进行脱气。持续轻敲直至不再产生气泡且瓶内无可见气泡。切勿让液体被抽出。必要时可暂停敲击。对所有连接的血清小瓶重复此操作。完成所有血清小瓶脱气后，关闭真空阀 A 和真空阀 B，并关闭真空泵（参见“其他实验方案与数据”步骤 S3.2 至 S3.2.3）。
   3. 保持血清小瓶连接在针头上，且真空泵处于关闭状态，缓慢逆时针旋转气体钢瓶阀 1/16 至 1/8 圈（约 22.5 至 45°），部分打开，然后打开 T 型手柄阀，再缓慢顺时针旋转空气调节阀至 3 psi（20.7 kPa）表压。随后打开压力阀 A 和压力阀 B（参见“其他实验方案与数据”步骤 S3.3 至 S3.3.21）。
      注意：十氟丁烷气体钢瓶处于高压状态，受热可能发生爆炸。应远离热源和撞击。十氟丁烷气体可能导致氧气置换并引发窒息。操作时应佩戴适当的护目镜，并在通风橱中进行。若操作不当，可能导致气体钢瓶被抽真空，从而引发快速减压和内爆。将气体钢瓶阀开启超过 1/8 圈可能损坏空气调节器。
   4. 加压 30 秒后（表压应仍为 3 psi（20.7 kPa）），关闭所有连接血清小瓶的歧管阀门，断开血清小瓶连接，套上针头保护套，并关闭气体钢瓶阀。
   5. 通过部分打开一个歧管阀门释放积聚的压力，直至空气调节器表针回到静止位置。随后关闭歧管阀门至 T 型手柄之间的所有阀门。
10. 标记血清小瓶，并将其在 4 °C、避光条件下储存。确保所有气体交换装置的阀门均已关闭，且真空泵已关闭。
    注：在此条件下，血清小瓶内容物可稳定保存长达 4 个月。本实验方案可在最多 4 个月后继续进行。

3. 十氟丁烷小瓶

1. 使用洁净、空的 3 mL 硼硅酸盐玻璃透明血清瓶（内口直径 7 mm，外口直径 13 mm），用冻干级灰色氯丁基橡胶塞（内口直径 7 mm，外口直径 13 mm）封口，并用可撕式铝盖（外口直径 13 mm）和压盖器固定橡胶塞^4,7,8。
2. 按照步骤 2.9.1 抽除瓶内大气空气（参见“其他实验方案与数据”中的步骤 S3.1 至 S3.1.5）。
3. 跳过脱气步骤，直接进行步骤 2.9.3 至 2.9.5，对血清瓶重新加压（参见“其他实验方案与数据”中的步骤 S3.3 至 S3.3.21）。
4. 标记十氟丁烷气瓶，并于 4 °C 避光保存。确保所有气体交换器的阀门均已关闭，之后关闭真空泵。
   ​注意：用于液滴冷凝实验的十氟丁烷气体填充血清瓶在此条件下可稳定保存长达 4 个月。本步骤完成后，实验可在最多 4 个月后继续进行。

4. 液滴形成

1. 从冰箱中取出一个含有水合脂质溶液的血清小瓶（来自步骤 2.10）。
2. 使用去盖器去除血清小瓶的铝制密封盖，并将 1 mL 脂质溶液沿内壁缓缓流入 1.85 mL 硼硅酸盐玻璃样品小瓶（带酚醛螺旋盖）中。避免产生气泡。
   1. 如果血清小瓶中仍有残留脂质溶液，请按照步骤 2.9 至 2.10 对血清小瓶进行脱气和重新加压后储存（参见“其他方案与数据”中的步骤 S3 至 S3.3.21）。
3. 使用气体交换装置，将十氟丁烷气体缓慢通入 1.85 mL 样品小瓶的顶空部分（具体阀门名称见图 2）。
   1. 确保气体交换装置上的所有阀门均已关闭，且泵已关闭。
      警告：若操作不当，可能导致真空抽吸气体钢瓶，引发快速减压和内爆。
   2. 打开一个歧管阀门，并小心地将对应的针头从歧管中拔出。
      警告：针头为锐器，避免接触或刺伤。
   3. 打开压力阀 A 和压力阀 B，逆时针旋转气体钢瓶阀门 1/16 至 1/8 圈（约 22.5 至 45°），部分开启，然后打开 T 型手柄阀。
      警告：切勿过度开启气体钢瓶阀门，否则可能损坏空气调压器。
   4. 取下含脂质溶液样品小瓶的盖子，将其移动至歧管针头位于瓶内液-气界面之上，并保持该位置。
   5. 缓慢顺时针旋转空气调压阀，直至空气调压表指针略微偏离静止位置，全氟碳气体开始从歧管针头轻柔流出。让十氟丁烷气体轻柔流入小瓶顶空部分 30 秒。避免产生气泡。必要时可调节空气调压阀。
      注：十氟丁烷气流应轻微扰动液-气界面。由于此时系统处于开放状态，空气调压表无法准确读取压力。
   6. 30 秒后，小心且迅速地重新盖上样品小瓶，尽量减少移动。
   7. 关闭气体钢瓶阀门（顺时针）、T 型手柄阀、空气调压阀（逆时针）、压力阀 A、压力阀 B 和歧管阀。
   8. 小心地将针头重新套入保护鞘中。
   9. 标记样品小瓶，并顺时针方向用石蜡膜密封瓶口（图 3A 和 3B）。
      注：图 3B 至 图 3F 仅展示 30% Pyro-脂质配方。
4. 将样品小瓶避光保存于 4 °C 环境中，至少 10 分钟，最长可达 24 小时。
   注：此步骤后可暂停实验流程，最长暂停时间为 24 小时。
5. 在保温容器中放入约 100 g 干冰（二氧化碳），另取一保温容器放入普通冰块。准备步骤 3 中所述的十氟丁烷血清小瓶、两根 3.81 cm（1.5 英寸）20 号针头、一支 1 mL 塑料注射器（使用前松动活塞）、一个 200 mL 容器、金属钳和一支温度计（-20 至 100 °C）。
   注：若仅制备微泡，则无需异丙醇、干冰和冰块。
6. 将含脂质溶液的样品小瓶放入机械振荡器中，振荡 45 秒（图 3C）。
7. 机械振荡结束后，将样品小瓶正立放置，避光，并开始 15 分钟倒计时，以冷却小瓶并对微泡进行粒径筛选^8,17。
   1. 当倒计时进行至第 10 分钟（剩余 5 分钟）时，向容器中加入约 200 mL 异丙醇，并用金属钳夹取干冰将其冷却至 -20 °C。
      注：目标温度为 -15 至 -17 °C，但在处理微泡过程中异丙醇会逐渐升温。
      警告：异丙醇易燃，远离热源和火花。干冰可造成皮肤损伤，需使用钳子操作。佩戴手套、护目镜和防护实验服。
8. 微泡粒径筛选 15 分钟后，观察样品小瓶内已筛选出的微泡层（图 3D）。
9. 保持样品小瓶正立，小心打开瓶盖，使用连接 1 mL 塑料注射器的 1.5 英寸 20 号针头吸取底部约 0.7 mL 的微泡层。确保不吸取上层液体。切勿轻弹注射器以排除气泡。
10. 将另一根 20 号针头插入十氟丁烷血清小瓶（针头靠近小瓶顶部）用于排气，然后将装有粒径筛选后微泡的针头-注射器插入该小瓶。
11. 缓慢转移粒径筛选后的微泡。倾斜小瓶并调整注射器角度，使液体沿十氟丁烷血清小瓶内壁滑下。
12. 当所有粒径筛选后的微泡溶液转移完毕后，拔出针头和注射器，但保留排气针头以释放负压（图 3E）。
    1. 若仅制备粒径筛选后的微泡，至此停止操作。保持排气针头插入且位于小瓶顶部附近，将小瓶避光并室温保存。
13. 向异丙醇浴中添加少量干冰或室温异丙醇，确保浴液温度维持在 -15 至 -17 °C 之间。
14. 将 20 号排气针头插入血清小瓶顶部附近，将小瓶放入异丙醇浴中，保持微泡液面低于异丙醇液面，而瓶口高于液面，并间歇性轻轻旋转小瓶 2 分钟，以冷凝微泡。
    注：此步骤改编自 Sheeran 等人的研究⁶。
    1. 切勿持续在异丙醇中旋转血清小瓶，且避免溶液冻结。每次旋转约 5 秒后，将小瓶从异丙醇中取出。检查是否有冰晶形成，若出现冰晶，则在空气中轻轻旋转小瓶直至冰晶消失。
15. 2 分钟冷凝结束后，将血清小瓶从异丙醇浴中取出，并拔除排气针头。
    注：微泡应已冷凝为液滴，表现为透光性变化（对于 30% Pyro-脂质配方，参见 图 3E 与 图 3F 的对比）。
16. 擦拭血清小瓶，标记标签，并将其置于避光保温容器内的冰块上，直至使用。未开封（铝封完整）的液滴在此状态下可稳定保存最多 6 小时，前提是融化的冰需根据需要及时更换。
17. 使用前，用去盖器去除铝制密封盖。未使用时，液滴（包括已开封小瓶）应始终置于冰上并避光保存。微泡应避光并在室温下保存。

5. 形态学与光学表征

1. 制备1% Triton：将5 mL Triton X-100加入500 mL PBS（1×，pH 7.4）中，并用磁力搅拌子搅拌至均匀¹⁴。
   注意：Triton X-100黏度很高。若使用标准空气置换式移液器，操作时需格外小心。吸取和排出液体时应缓慢进行，并等待残留液体完全流至移液器吸头底部。转移液体时动作应缓慢，确保液体不会附着在移液器吸头外壁。
2. 制备液滴（步骤4）。若同时需表征微泡，应在冷凝前（步骤4.9）收集少量经尺寸筛选的微泡。
3. 使用库尔特计数器（CC）对0.2至6 µm范围内的微泡或液滴进行粒径分析，以获得粒径分布和浓度（图4）。
   1. 取一支洁净的20 mL比色皿，加入10 mL经0.2 µm孔径聚醚砜膜过滤的CC电解液。在库尔特计数器上连续测量三次，获取基线值。
   2. 在相同电解液中加入5 µL微泡或液滴样品，轻轻混匀。
      注意：可根据样品浓度加入2至20 µL样品。
   3. 将样品在库尔特计数器上运行三次，减去平均基线值，计算粒径分布和浓度（每毫升颗粒数）。
4. 使用紫外-可见光谱法测定液滴的吸光度（图5）。
   注意：图5仅显示30% Pyro-脂质配方的结果。
   1. 在紫外-可见分光光度计上设置吸光度测量参数：波长范围为800 nm至300 nm，步长0.5 nm，并启用基线校正功能。
   2. 使用一支洁净的1 cm光程比色皿，装入PBS，进行基线测量。确保液体体积足够高，能够覆盖分光光度计的光路。
   3. 将Pyro-脂质液滴用PBS稀释（建议将2 µL至5 µL液滴加入2000 µL稀释液中），并通过移液操作混匀。
      注意：切勿涡旋，否则会导致组装结构破坏。
   4. 将稀释后的液滴转移至洁净的比色皿中，测量吸光度。必要时调整稀释倍数。
   5. 重复步骤5.4.1至5.4.4，但使用1% Triton代替PBS。稀释后，将样品转移至可密封/带盖小瓶中，涡旋30秒后再进行测量。
5. 测定微泡或液滴的荧光强度（图6）。
   注意：图6仅显示30% Pyro-脂质配方的结果。
   1. 在荧光分光光度计上设置激发波长为410 nm，发射波长范围为600至750 nm，步长1 nm。
   2. 使用与荧光分光光度计兼容的比色皿，测量PBS稀释液的荧光信号，获得基线值。
   3. 将Pyro-脂质微泡或液滴用PBS稀释（建议将0.5 µL至10 µL液滴加入2000 µL稀释液中），并通过移液操作混匀。
      注意：切勿涡旋，否则会导致组装结构破坏。
   4. 将稀释后的样品转移至已清洁并完成基线校正的比色皿中，测量荧光信号。必要时调整稀释倍数，避免信号饱和。
   5. 重复步骤5.5.1至5.5.4，但使用1% Triton代替PBS。将样品在1% Triton中稀释后，转移至可密封/带盖小瓶中，涡旋30秒后再进行测量。加入足够体积，确保涡旋产生的气泡位于激光光路之上。
      注意：由于荧光去猝灭效应，样品在Triton中的荧光信号将显著高于在PBS中的信号（图6）。

6. 气化成像

1. 用适当大小的水箱装入去离子水，并静置24小时，使水中的气体与大气达到平衡。
2. 制备液滴并置于冰上避光保存，直至使用。
3. 按照Pellow等人的方法¹⁸，用2%琼脂制备流动体模管，将体模浸入加热至37 °C的水箱中。
4. 将PBS预热至37 °C，并使其流经体模。
5. 使用临床前超声系统和21 MHz线性阵列换能器（见材料表），将成像视野对准流动体模，设置为B模式成像，设定输出压力，并在每个压力下采集视频或图像以获取基线数据。
6. 将20 µL液滴稀释于50 mL 37 °C的PBS中，轻轻混匀。将溶液转移至30 mL塑料注射器中，并推动溶液通过琼脂体模。
7. 保持与步骤6.5相同的成像对准状态，逐步增加输出压力，直至观察到液滴发生汽化（体模中出现明亮的斑点，参见图7）。
   注意：图7显示的是30% Pyro-脂质液滴样品。这种商用的21 MHz线性阵列换能器兼具成像和液滴汽化功能。

结果

对预缩合、尺寸筛选的微泡样品（n = 3）和缩合后的液滴样品（n = 3）使用孔径为10 µm的库尔特计数器（CC）进行粒径分析。10 µm孔径的一个局限性是无法测量小于200 nm的颗粒，这可能导致平均粒径和浓度出现偏差。图4展示了每种Pyro-脂质含量配方的粒径分析数据。表1列出了基于粒径数据的统计结果。通过比较缩合前后平均直径的比值，结果显示0% Pyro-脂质配方的平均直径变化最小，为1.72 ± 0.02；50% Pyro-脂质配方的平均直径变化最大，为2.38 ± 0.08。1% Pyro-脂质液滴样品的浓度最高，达到(2.71 ± 0.13) × 10¹⁰ /mL，而40% Pyro-脂质液滴样品的浓度最低，为(7.36 ± 0.81) × 10⁹ /mL。粒径分析数据显示，10% Pyro-脂质液滴样品的峰值粒径最小，为261 ± 13 nm，而50% Pyro-脂质液滴样品的峰值粒径最大，为390 ± 55 nm。总体而言，随着Pyro-脂质含量的增加，浓度降低，平均粒径增大。由于缩合后的样品基于前体微泡样品，该趋势在两种类型的超声造影剂中均存在。随着Pyro-脂质含量的增加，开始出现一个微泡亚群（峰值粒径约为2000 µm）。该次级峰在0% Pyro-脂质微泡样品中不存在，在40%和50% Pyro-脂质样品中最为明显。

图5 显示了30% Pyro-脂质液滴样品的代表性吸光度测量结果。完整样品在PBS中的吸收峰为700 nm，而在Triton中破坏后的样品吸收峰则移至671 nm。这表明完整的组装结构与单独的、未组装的脂质组分具有不同的光学特性。

图6A 显示了预凝聚微泡样品的代表性荧光测量结果，而 图6B 显示了含30% Pyro-脂质的凝聚后液滴样品。在PBS中，完整样品的荧光峰位于704 nm，而破坏后的形式峰位于674 nm。将完整曲线下的面积减去破坏后曲线下的面积，再将差值除以破坏后曲线下的面积，即可得到淬灭效率，对于含30% Pyro-脂质的微泡样品和液滴样品，其淬灭效率分别为98.61%和98.07%。

为了展示液滴转化为微泡的过程，将稀释后的液滴置于37 °C的流动体模中，使用超声系统进行成像并诱导其汽化。图7展示了在不同压力下成像的30% Pyro-脂质液滴样品的代表性超声图像。在低压条件下（图7A），信号非常微弱，仅观察到由琼脂合成过程中残留的空气泡产生的背景信号。这是因为液滴本身无回声性，不能散射超声波。当功率稍升高时，出现了少量微泡（图7B），表现为明亮的斑点信号。随着压力进一步增加，生成的微泡数量增多（图7C和7D）。该结果同时表明，在37 °C条件下，液滴不会自发发生汽化。

图1：制备30% Pyro-lipid溶液各步骤的图像。A) 脂质粉末与Pyro-SPC溶于氯仿中。B) 加入溶解液。C) 脂质薄膜干燥后附着于小瓶内壁。D) 脂质小瓶用铝箔包裹（外层铝箔用胶带固定以便重复使用）。E) 水合后的脂质溶液。F) 血清小瓶中的脂质溶液。请点击此处查看该图的高清版本。

图2：10通气体交换多通管系统。 协议中提到的阀门均已标注。有关气体交换装置的组装说明，请参见补充文件《其他协议与数据》。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3： A) 7种配方（0% 至 50% Pyro-SPC）的脂质溶液在样品小瓶中的状态。图B 至 D 展示了制备30% Pyro-脂质液滴的各步骤图像。B) 样品小瓶中的30% Pyro-脂质溶液。C) 振荡后。D) 经15分钟粒径筛选后。E) 下层部分转移至十氟丁烷小瓶中。D) 冷凝后。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：不同Pyro-脂质壳含量的尺寸筛选微泡和液滴样品的库尔特计数器（CC）粒径数据（n = 3）。 实线绿色曲线代表微泡，虚线青色曲线代表液滴。A) 0% Pyro-SPC。B) 1% Pyro-SPC。C) 10% Pyro-SPC。D) 20% Pyro-SPC。E) 30% Pyro-SPC。F) 40% Pyro-SPC。G) 50% Pyro-SPC。H) 基于壳中Pyro-SPC含量，库尔特计数器测得的微泡和液滴样品的总观测浓度。所有误差线表示标准偏差。所有测量均使用10 µm孔径进行，其粒径检测范围为200 nm至6000 nm。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：在PBS和1% Triton中稀释后的浓缩后30% Pyro-脂质液滴样品在300至800 nm范围内的代表性紫外-可见（UV-Vis）光谱吸光度测量结果。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：在410 nm激发下，600至750 nm范围内的代表性荧光发射。A经尺寸筛选的、预先浓缩的含30%焦磷酸脂质微泡样品，分别置于PBS和1% Triton中。 B在 PBS 和 1% Triton 中预浓缩的 30% 热解脂质液滴样品 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 7：使用临床前 21 MHz 线性阵列换能器在 B 模式下（参见材料表）获取的 37 °C 琼脂流动体模的代表性超声图像。 左侧一列（图 A、C、E、& G）显示 PBS 对照组。右侧一列（图 B、D、F、& H）显示将 20 µL 冷凝后的 30% Pyro-脂质液滴样品稀释至 50 mL 37 °C PBS 中的结果。每一行代表由 Sheeran 等人研究估算得出的自由场峰值负压⁸。黄色三角形表示聚焦深度。请点击此处查看此图的放大版本。

方法	试剂	热解壳层 %	0	1	10	20	30	40	50
CC	气泡	浓度 [/mL]	(2.76 ± 0.28) × 10^10	(3.04 ± 0.15) × 10^10	(2.02 ± 0.11) × 10^10	(1.91 ± 0.22) × 10^10	(1.47 ± 0.05) × 10^10	(8.47 ± 0.95) × 10^9	(9.89 ± 0.15) × 10^9
CC	气泡	峰值 [nm]	329 ± 6	297 ± 15	305 ± 21	273 ± 14	310 ± 40	266 ± 33	393 ± 89
CC	气泡	平均值 [nm]	609 ± 2	603 ± 15	635 ± 6	690 ± 8	812 ± 1	935 ± 22	950 ± 55
CC	气泡	中位数 [nm]	450 ± 6	421 ± 6	414 ± 6	432 ± 5	490 ± 2	596 ± 37	695 ± 41
CC	液滴	浓度 [/mL]	(2.18 ± 0.07) × 10^10	(2.71 ± 0.13) × 10^10	(1.75 ± 0.18) × 10^10	(1.72 ± 0.13) × 10^10	(1.09 ± 0.01) × 10^10	(7.36 ± 0.81) × 10^9	(7.38 ± 0.28) × 10^9
CC	液滴	峰值 [nm]	292 ± 0	297 ± 17	261 ± 13	280 ± 9	268 ± 17	287 ± 38	390 ± 55
CC	液滴	平均值 [nm]	353 ± 5	350 ± 5	347 ± 1	347 ± 4	397 ± 1	399 ± 6	400 ± 7
CC	液滴	中位数 [nm]	318 ± 4	318 ± 4	310 ± 1	315 ± 2	340 ± 0	367 ± 5	370 ± 9

表1：通过库尔特计数器（CC）测得的不同Pyro-SPC含量的微泡和液滴样品的粒径数据统计（n = 3）。所有误差均表示标准偏差。

补充信息 - 脂质分子式表： 请点击此处下载该文件。

补充信息 - 其他实验方案与数据： 请点击此处下载该文件。

讨论

将所有脂质组分加入后（步骤 1.2 和 1.4.5，图 1A），加入氯仿和甲醇溶液（如果存在如 DSPA 等磷脂酸类脂质，则还需加入水），以确保 Pyro-脂质与非 Pyro-脂质组分充分均质化（步骤 1.5， 图 1B）。为防止形成脂质组成不均一的脂质体，将溶解的脂质进行干燥，并在小瓶内壁上形成一层均匀的薄膜（图 1C）。该成膜过程（步骤 1.6）还可增加干燥脂膜的表面积，从而有利于后续水化步骤的进行（步骤 2.1 至 2.4）。干燥（步骤 1.6，图 1C）和真空处理（步骤 1.8，图 1D）的目的是确保氯仿和甲醇完全蒸发，因为这些化学物质可能干扰微泡的形成。尽管该方案可按比例缩小至制备低至 1 mL 的脂质溶液，但使用较大体积有助于减少不同小瓶之间的差异。虽然未使用时可能存在 Pyro-SPC 降解的风险，但脂质溶液的储存条件（步骤 2.9 至 2.10）旨在降低该风险。使用气体交换器进行脱气的步骤（步骤 2.9.2，图 1F 和 图 2）旨在尽可能去除氧气，以防止氧化反应的发生。不建议在大气气体仍溶解于溶液中时储存含卟啉-脂质的脂质溶液（图 1E）。

在步骤2.10中，脂质溶液置于带有加压顶空的血清瓶中，类似于临床批准的超声造影剂全氟丁烷脂质微球的销售形式（见图1F）。内部研究表明，若瓶盖为橡胶塞等软质材料，在存在Pyro-脂质的情况下，无法通过机械震荡生成稳定的微泡。因此，将脂质溶液转移至带有非橡胶酚醛盖的样品瓶中（步骤4.1至4.4，图3A和3B）。当十氟丁烷气体通入样品瓶（步骤4.1至4.4）时，密度更高的十氟丁烷应能置换样品瓶顶空中的大气。目前尚不清楚Pyro-脂质为何无法在使用橡胶塞时形成微泡。在不含Pyro-脂质的情况下，可直接在带橡胶塞的血清瓶中制备稳定的微泡^4,7。因此，建议对不含Pyro-脂质的配方使用气体交换装置对血清瓶进行脱气和重新加压，然后直接震荡血清瓶本身^4,5,6,7（参见"其他方案与数据"）。能够在血清瓶中直接进行机械震荡的优势在于，可通过将血清瓶倒置实现顶空加压和微泡尺寸筛选⁸。在本方案中，0% Pyro-脂质配方也被转移至样品瓶（步骤4.1至4.4），以保持与含Pyro-脂质配方操作的一致性。此外，较长的酰基链脂质由于具有更强的范德华相互作用，可形成更稳定的液滴¹⁹。脂质壳的组成选择基于市售可得的材料，所有脂质类型均采用18碳酰基链长度。所有配方中均加入了DSPE-PEG5K（步骤1.1），因为聚乙二醇链的存在可通过排斥性空间位阻防止结构融合¹⁹。在脂质水化过程中，水浴超声仪的温度设定为70 °C（步骤2.1），该温度足以完全分散18碳酰基链长度的脂质膜¹⁸。对于更长的酰基链，需要更高的温度。

较高的焦卟啉脂质（Pyro-lipid）载量会增加光学吸收和荧光组分的浓度，这在某些需要最大化卟啉载量的应用中可能是有利的。然而，随着焦卟啉脂质含量的增加，可观察到的液滴浓度降低，而液滴直径增大（图4 和 Table 1）。这表明在光学荧光和吸收性能与液滴浓度及直径之间存在权衡。对于需要优先考虑小直径以通过微小渗漏血管实现 in vivo 聚集，或需要注射高浓度液滴的研究人员而言，增加焦卟啉脂质载量可能并不值得，因其会导致液滴直径增大或液滴浓度下降。如果高液滴浓度和/或小液滴直径至关重要，则应考虑使用尺寸相似的其他伴随诊断试剂而非焦卟啉脂质。尽管含1%焦卟啉脂质的液滴未导致浓度降低或尺寸增大，但1%的载量可能过低，难以从组织背景荧光中可靠地检测。然而，卟啉基团的结构灵活性提供了多种功能化选择，可实现更适合低浓度应用的其他定量手段。例如，焦卟啉脂质可螯合铜-64用于正电子发射断层成像和γ计数²⁰，或螯合钯用于质谱法进行痕量金属定量，或螯合锰用于磁共振成像¹⁴。

尽管某些实验可能仅需少量液滴溶液，但填充1.85 mL样品瓶需要1 mL脂质溶液。Goertz等人证明，操作方式、顶空压力、液气比甚至瓶体形状的改变均会影响微泡的数量分布¹⁷。振荡和尺寸筛选过程中瓶体的温度也会影响粒径分布。因此，对于经终端用户优化的方法，在制备液滴时必须尽可能保持操作的一致性。未开启的液滴可冷冻（-20 °C）并在后续使用时解冻，但这会影响粒径分布。

将脂质溶液激活为微泡的震荡过程并不能产生形态均一的微泡群体（步骤 4.6）；相反，样品中包含微泡、多层囊泡、脂质体和胶束^18,21,22。尽管微泡的尺寸分布在微米和纳米范围内，其他结构的尺寸大多小于 800 nm²³。所使用的粒径检测技术无法区分这些不同结构，因此震荡后的微泡样品（步骤 4.6，图 3C）和冷凝后的液滴样品（步骤 4.14，图 3F）必须被视为混合物。超声不敏感的组装结构（多层囊泡、脂质体和胶束）在冷凝后可能得以保留，且由于其不具备可相变的核心，尺寸不会发生变化。由于库尔特计数器无法区分这些不同的超分子组装体，因此对冷凝后群体尺寸变化的解读应基于以下假设：部分纳米级结构不可转化，并会贡献于该尺寸区域所观测到的群体信号。此外，这些结构也会影响样品的光谱和荧光特征¹⁴。胶束、脂质体/囊泡和液滴的荧光与吸收特征均相似，包括其荧光猝灭程度¹⁴。因此，必须注意到图 3C 至 3F、图 4、图 5 中 PBS 稀释的样品以及图 6 中 PBS 稀释的样品均含有多种组装体的混合物。

在尺寸筛选后、凝聚前（步骤4.9），可通过离心微泡样品，根据浮力差异分离出具有浮力的微泡与无浮力的聚集体，从而去除非气泡状聚集体，具体方法如Feshitan等所述。²¹ 分离程度可通过调节离心力和持续时间来控制。然而，对经尺寸分离后样品进行的微泡冷凝实验表明，采用尺寸分离方法筛选出的较大前体微泡群体可产生更大的液滴（见 "其他方案与数据" 步骤S5用于纺丝后气泡和液滴的尺寸测定）。由于本方案生成的液滴尺寸远小于微泡，其预期应用之一是作为可通过被动渗出并在靶部位积聚的递送平台^4,8，希望获得尽可能小的液滴群体。因此，本方案使用了经震荡后的微泡样品，且未通过离心进行尺寸分离，即使这意味着最终溶液中可能含有对超声不敏感的胶束、脂质体和囊泡。这确实意味着生物分布的定量分析将包含所有注射结构的信号，并不仅限于液滴。然而，由于这些尺寸相似的结构最可能通过主要由尺寸决定的被动机制积累，因此预计不会影响利用该平台所能得出的主要推论 体内尽管所有这些方面都应根据该平台可能应用的具体情境分别予以考虑。可通过设置含超声与不含超声的实验组进行对照测试，以确认任何生物分布的变化均由超声敏感性液滴引起，因为溶液中仅全氟碳核心聚集体对超声产生响应。

振荡后，将小瓶静置15分钟，观察到瓶内出现分层现象（图3C 与 3D 对比）。通过浮力进行尺寸筛选是一种简单的方法，可从活化的微泡溶液中去除较大的结构或气泡^8,17。 在本实验中，经过尺寸筛选后，直径大于5 µm的颗粒大部分被去除（图4）。通过调节尺寸筛选的时间，可调控尺寸筛选的程度¹⁷。Sheeran 等人已证明，若不进行尺寸筛选，所产生的微泡可能导致血管阻塞⁸。

全氟碳化合物的优点在于其生物学惰性⁷。尽管十氟丁烷的沸点为 -1.7 °C，高于体温，但在暴露于 37 °C 时，液滴并不会立即汽化（图 7B）。由于这些液滴在 37 °C 下处于亚稳态，因此需要额外的声学能量才能使其汽化为微泡^7,9。Poproski 等人已通过加压方式实现了卟啉液滴的冷凝²²。当使用密度较低的全氟碳化合物时，这是一种可行甚至必要的方法，但高压过程可能破坏部分气泡。八氟丙烷（C₃F₈）的沸点为 -36.7 °C，因此液滴冷凝需要同时进行冷却和加压。然而，较轻的全氟碳化合物会导致液滴稳定性降低。十二氟戊烷（C₅F₁₂）的沸点为 28 °C，可形成更稳定的液滴。但其在室温下为液态，需要更强的声学能量才能实现汽化。因此，超声造影剂中所含气体的选择，除了考虑制备参数外，还应结合其预期生物学应用的具体条件进行权衡。在本实验方案中，用于冷凝的异丙醇浴温度设定为 -15 至 -17 °C（步骤 4.7.1 和步骤 4.13），而其他方案则使用了 -10 °C ^5,6。即使采用相同的十氟丁烷核心，冷凝温度也可能因辅料组成、总脂质浓度以及脂质壳组成的不同而有所变化。若使用其他配方，可能需要进行优化，以确保液滴充分冷凝的同时避免溶液冻结。

由于这些液滴比其微泡前体更小且更稳定⁷，因此能够更有效地利用被动蓄积机制渗出至特定目标组织，例如某些肿瘤类型的增强渗透性和滞留效应^4,24。结合荧光、光学吸收以及声学检测方法¹⁴，可利用单一制剂对摄取量进行定量分析。此外，该平台还可用于研究液滴的声致相变是否能够使递送的试剂比例超过被动递送水平¹⁶。为了在注射后定量分析试剂在目标组织和器官中的生物分布，应向动物体内注射已知剂量的Pyro-脂质液滴，根据对照组设置决定是否施加超声，动物应在预设的时间点被处死，并取出器官称重。随后将器官组织匀浆、过滤，并用表面活性剂（去垢剂）稀释以实现去细胞化处理，最后通过荧光或紫外-可见光光谱法对Pyro信号进行定量，计算各器官单位质量所含注射剂量的百分比。在步骤5.4.5（图5）和步骤5.5.5（图6）中，使用了Triton X-100表面活性剂（去垢剂）来破坏样品，因其在410 nm处无荧光，且其吸收波长与Pyro的吸收波长无重叠。

未使用紫外-可见光吸收对微泡进行表征。由于紫外-可见分光光度计的激光源与检测器处于平行位置，任何较大的气泡都可能将光线散射出检测器范围，导致其表现出更高的光学吸收性¹⁴。与紫外-可见分光光度计不同，荧光分光光度计的检测器应与激光源呈垂直排列，以防止光源对检测器造成干扰。本研究使用紫外-可见光谱法测定完整和破坏后的液滴样品的吸光度（步骤5.4，图5）。选择300至800 nm作为吸光度检测波长范围，因为焦脱镁叶绿酸脂（pyro-lipid）的两个主要吸收带——Soret带（340至500 nm）和Q带（640至730 nm）——均位于该范围内¹⁴。当焦脱镁叶绿酸脂组装成液滴（或其他超分子结构）时，其Q带吸收峰从671 nm红移至700 nm（图5）。当该超分子结构被Triton等表面活性剂破坏时，吸收峰又回移至671 nm^14,15。根据这一峰位移动，可判断焦脱镁叶绿酸脂处于组装状态还是解离状态。两个吸收峰的比值可用于估算超分子组装体随时间的降解程度。

对于荧光测量（步骤 5.5，图 6），选择 410 nm 的激发波长，因为该波长对应于未组装 Pyro-lipid¹⁴ 的 Soret 带峰值。发射波长范围选定为 600 至 800 nm，因为完整组装体在 PBS 中以及在 Triton 中解聚的 Pyro-lipid 的荧光峰均位于此范围内。完整样品（PBS 中 704 nm）与解聚样品（Triton 中 674 nm）之间出现的荧光红移和增强（图 6）是由于结构诱导的荧光淬灭所致。在组装状态下，Pyro-lipid 分子紧密堆积，导致生成的光子被邻近的 Pyro-lipid 分子吸收。这一点在完整与解聚状态下的淬灭效率对比中表现明显。因此，必须将样品稀释于表面活性剂（如 1% Triton X-100）中，以解除淬灭效应，从而最大化生物分布定量时的信号强度¹⁴。

为简化操作，使用同一线性阵列超声换能器进行液滴汽化与成像（步骤 6.5 和 6.7，图7）。该超声换能器（材料表）能够达到汽化液滴所需的足够峰值负压⁸。将自来水中的去离子水注入水箱时，会产生溶解于水中的气体（步骤 6.1）。为尽量减少水中溶解气体对液滴汽化和成像的干扰，将水在水箱中静置 24 小时，使水中气体与大气达到平衡（步骤 6.1）。或者，也可使用足够大且可密封的容器连接足够强的真空泵对去离子水进行脱气处理。超声图像显示，液滴成功发生了冷凝，在低压力下无法观察到液滴或表现为无回声（图7B）。只有在较高输出压力下，液滴才汽化为可观察到的、具有回声特性的微泡（图7D、7F、7H）。尽管冷凝后的液滴样品中含有胶束以及脂质体/囊泡，但这些结构均无回声特性，只有液滴可汽化为具有回声的微泡。通过向模体中灌注 PBS 对照液以获取基线图像（图7A、7C、7E、7G）。随着 PBS 中压力升高，并未产生任何对比信号。这表明仅靠换能器产生的高压不足以在水性介质中引发自发性空化，因此所有其他产生的对比信号均可归因于所使用的超声造影剂。若输出压力过高，生成的微泡可能被破坏。通过逐步增加压力并观察所产生的对比信号，可确定最佳压力值⁸。类似地，可通过在特定时间间隔汽化液滴并观察随时间变化的对比信号强度，来测定液滴的循环半衰期⁷。

综上所述，采用冷凝法制备了具有不同Pyro-lipid含量的多模态相变液滴。粒径分析显示，Pyro-lipid载量与微泡/液滴浓度之间存在权衡关系。表征结果显示，完整态与破裂态在吸收光谱和荧光特性方面均存在差异。超声成像表明，这些液滴在37 °C时无回声信号，但在足够高的压力下可被汽化为具有回声信号的微泡。表征结果还表明，Pyro-lipid液滴有望替代伴随诊断试剂，用于液滴生物分布或蓄积试验。后续研究将探讨溶液中汽化阈值、溶液稳定性以及在裸鼠体内的in vivo循环时间。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-5000]（铵盐）	Avanti Polar Lipids	880220	又称 "DSPE-PEG5K"
1-十八烷酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱	Avanti Polar Lipids	855775	又称 "DSPC"
铝箔	任何品牌
铝制密封盖，可撕型	VWR	16171-840	标准铝，13 mm 外径
超声波清洗机	任何品牌		能够  超声处理并加热至70 °C,
Bio-Stor 螺口瓶	国家科学	BS20NABP	塑料，2 mL 带裙边，带O型圈
硼硅酸盐玻璃透明血清瓶	VWR	16171-285	3 mL，内口直径 7 mm，外口直径 13 mm
带酚醛树脂螺旋盖的硼硅酸盐玻璃样品瓶	VWR	66011-020	1.85 mL，短型，外径 12 mm，高度 35 mm，8-425 盖帽规格
带螺口盖的硼硅酸盐玻璃小瓶	任何品牌		尺寸将取决于所需的体积
氯仿	任何品牌
库尔特计数器电解质稀释液	任何品牌		与库尔特计数器兼容
十氟丁烷（C4F10）	FluoroMed	355-25-9
去离子水	任何品牌
干冰（二氧化碳）	任何品牌
动态光散射（DLS）粒径分析仪	任何品牌		具备温度控制功能
E-Z Crimper，13 mm	Wheaton	W225302	13 mm 标准铝制封口膜
E-Z Decapper，13 mm	Wheaton	W225352	13 mm 标准铝制封口膜
荧光分光光度计	任何品牌		可检测400至600 nm激发光及300至800 nm发射光，检测器位于激光源垂直方向
荧光分光光度计兼容比色皿	任何品牌		可容纳至少 2 mL，适用于 300 至 800 nm，四面透光  光学窗口
气体交换器	自制		参见补充信息 - "其他方案与数据" 有关组装说明。
玻璃注射器	任何品牌		尺寸将取决于所需的体积
GLWR 定制孔径管 10 μm	贝克曼库尔特	B42812	10 µm孔径，适用于Beckman Coulter MultiSizer 4e
甘油	任何品牌
带盖绝缘泡沫塑料容器	任何品牌
异丙醇	任何品牌
冻干式橡胶塞	VWR	71000-060	内径7 mm，外径13 mm，双翼，氯化丁基橡胶塞
膜片式真空泵	赛多利斯斯泰迪姆	16694-1-60-06	可调节压力
金属镊子	任何品牌
甲醇	任何品牌
MS250 21 MHz 线阵超声探头	VisualSonics		21 MHz，支持B模式和非线性成像。
MultiSizer 4e	贝克曼库尔特		可测量粒径范围为 0.2µ米到6 µm
Nalgene Rapid-Flow 无菌一次性真空过滤装置	赛默飞世尔科技	567-0010	聚醚砜（PES）膜，0.1μm孔径，1000 mL体积。由于Isoton II为非无菌溶液，滤器单元可多次使用
常规针头	BD	305176	20号，1.5英寸长度
氮气	任何品牌		确保有调节阀和管路来引导气流。具体装置设置将取决于品牌和来源。
Parafilm	任何品牌		称为 "石蜡膜" 在方案中。
磷酸盐缓冲液（PBS）	任何品牌		1X，pH 7.4
移液器	任何品牌		尺寸将取决于所需的体积
移液器吸头	任何品牌		尺寸将取决于所需的体积
塑料注射器	任何品牌		1 mL、3 mL 和 30 mL，带鲁尔锁扣连接
聚醚砜（PES）膜滤器	任何品牌		0.2 µm 孔径大小
丙二醇	任何品牌
原卟啉-叶绿酸a共轭的1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	自制		又称 "Pyro-SPC"。参见 "补充信息——其他实验方案与数据" 用于合成。
温度计	任何品牌		-20 至 100 °C)
Triton X-100	任何品牌		又称 "2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇"
超纯水	任何品牌		1型纯度
紫外线–可见光（紫外-可见）分光光度计	任何品牌		可检测 300 至 800 nm 范围内的吸光度，分辨率至少为 0.5 nm
紫外线–兼容紫外-可见（UV-Vis）分光光度计的比色皿，1 cm 光程长度	任何品牌		可容纳至少 2 mL，适用于 300 至 800 nm 范围
真空干燥器	任何品牌
Vevo 2100 超声成像平台	VisualSonics		临床前超声成像系统
Vialmix	百时美施贵宝		称为 "机械搅拌器" 在方案中。振荡45秒。
涡旋混合器	任何品牌