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方法文章

一种经济高效且可自制的平台 果蝇 行为学研究及幼虫线粒体呼吸测定的配套方案

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DOI：

10.3791/62669

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2021年9月24日

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

本文内容

摘要

我们为具备“创客文化”理念的人士提供实验方案，指导其通过3D打印多种必要设备，构建用于定量分析黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）多种行为参数的果蝇实验室。此外，我们还描述了一种利用幼虫进行高分辨率呼吸测定的实验方案，以整合行为学与线粒体代谢数据。

摘要

该方法的实用性 果蝇 作为研究人类疾病、行为和基础生物学的模式生物，其重要性毋庸置疑。尽管具有实用性， 黑腹果蝇 发展中国家对科研的兴趣尚不普遍，可能源于一种误解，即认为建立实验室并利用这些微小昆虫开展相关实验难度较大，且需要昂贵的专业设备。本文介绍如何构建一个经济实惠的果蝇实验室，用于定量分析多种行为参数 D. melanogaster通过3D打印许多必要的实验设备部件，我们提供了用于构建实验室自制小瓶架、求偶行为实验装置、运动能力检测装置等的实验方案，可用于果蝇的常规饲养以及利用成虫和幼虫开展行为学实验。我们还提供了使用更复杂系统的技术方案，例如利用高分辨率氧电极仪测定果蝇幼虫样本中线粒体耗氧量，并展示在线粒体异源表达替代氧化酶（AOX）后，幼虫线粒体功能变化与其行为改变之间的关联。AOX的表达可提高幼虫活动能力及线粒体泄漏呼吸，同时在低温条件下加速发育，这与该酶具有产热功能的假说相一致。我们希望这些实验方案能够激励研究人员，尤其是来自发展中国家的研究人员，采用并推广这些方法 果蝇 将行为学与线粒体代谢数据便捷整合，有助于揭示可能调控人类生理功能和疾病状态的基因和/或环境因素。

引言

黑腹果蝇 100 多年前，果蝇被引入科学界，作为一种具有巨大潜力的模式生物。这种潜力已在生物和生物医学科学的多个领域得到充分验证，包括遗传学、进化、发育生物学、神经生物学以及分子与细胞生物学。因此，已有六项诺贝尔生理学或医学奖授予了十位 果蝇 在遗传学、诱变、先天免疫、昼夜节律、嗅觉及发育等领域对人类认知作出重大贡献的研究人员1也许更重要的是， D. melanogaster 并未停止为我们提供人类生物学和疾病的新模型，正如在PubMed上使用检索词进行快速搜索所揭示的，仅在过去5年内就发表了近600篇相关文献 "果蝇模型" (2，截至2021年2月）。在美国，其中 果蝇 在生物医学领域，果蝇是一种广泛应用的模式生物，2015年美国国立卫生研究院（NIH）资助的R01研究项目中，约有2.2%的项目专门用于果蝇研究。 果蝇 研究人员3. 在中国台湾，另一方面，在圣保罗研究基金会（FAPESP）网站上搜索该州所有科学领域最重要的研究资助机构目前资助的项目，结果显示仅有24项资助和奖学金项目涉及 果蝇 作为主要研究对象4. 考虑到圣保罗研究基金会（FAPESP）目前资助的全部13205个项目5，截至2021年2月，这24个 果蝇 项目所占比例不到总项目数的0.2%，比美国国立卫生研究院（NIH）低近12倍。如果剔除旨在研究 果蝇 从生态学和/或进化角度进行的研究，以及假设其余项目将该生物作为研究人类健康与疾病状态下生物学过程的模型，这一比例下降至惊人的约0.1%。

事实上，有必要进行一项适当的研究以揭示其原因 果蝇 巴西/圣保罗的研究在资助项目数量上似乎并不显著。培养 果蝇 并不昂贵6,7,8 而且相对简单，因为与脊椎动物不同，果蝇实验无需获得生物伦理委员会的许可。9,10. 但在巴西，需要获得使用转基因果蝇品系的许可11，增加了所有涉及转基因生物的工作所固有的官僚程序。然而，这可能并不会阻止感兴趣的科研人员建立果蝇实验室。我们推测，对果蝇模型研究能力的误解，以及对建立果蝇实验室和开展有意义实验所需高昂成本的误传，是影响这一决策的重要因素。与大多数科研设备和耗材一样，用于常规果蝇饲养和行为分析的适当装置必须从北美、欧洲或其他地区进口到巴西，这一过程既昂贵又极为耗时12,13.

近年来，随着3D打印机变得越来越经济实惠且易于获取，个人用户包括 果蝇 发展中国家的研究人员。在过去的10年中，3D打印技术已被该领域的研究人员广泛使用 "创客文化"，其理念在于实现自给自足，而非完全依赖公司生产的产品14这种观念一直存在于全球各地的学术研究实验室中，因此3D打印机在许多地方已成为实验室的标准设备15,16多年来，我们一直通过3D打印果蝇试剂瓶架、交配场、攀爬装置以及其他设备，其成本仅为品牌同类产品的几分之一。打印和组装自制实验设备的成本降低，典型代表是FlyPi系统，其构建成本低于 €100.00，可用作透射光显微镜和荧光显微镜 能够利用复杂的光遗传学和热遗传学刺激手段来研究具有可遗传操作性的斑马鱼。 果蝇 和线虫15在此，我们为所有有意开展果蝇研究的人员提供一系列实验方案 果蝇 研究人员（或在扩展其现有果蝇实验室时）可通过3D打印获得许多必需的实验材料。通过投入时间并掌握一定技术，读者甚至能够优化本文所提供的方案，以打印出更符合自身研究需求的实验装置。

然而，果蝇实验室并非仅适用于"廉价"设备的地方，尤其是当研究者希望将行为学分析与潜在的代谢现象关联起来时。我们也一直关注线粒体在调控Drosophila行为模式中的作用，因为这些细胞器通过多种代谢途径产生大部分组织中的ATP，而这些途径的产物最终汇聚于氧化磷酸化（OXPHOS）。以分析线粒体耗氧量的方式来理解线粒体代谢，需要使用氧电极仪（oxygraph），这是一种较为复杂的设备，遗憾的是目前尚无法通过3D打印制备。由于OXPHOS几乎影响所有细胞过程，其依赖于细胞内一系列放能的氧化还原反应17,18，因此根据提供给线粒体的可氧化底物所测得的耗氧速率，有助于揭示该细胞器功能的变化是特定行为的原因还是结果。因此，我们在此也提供了一种用于测量幼虫样品中线粒体耗氧量的实验方案，因为我们意识到绝大多数已发表的方案均集中于成虫样品的分析。我们发现，在低温胁迫下，通过转基因表达海鞘（Ciona intestinalis）替代性氧化酶（AOX）所诱导的线粒体呼吸变化，可导致幼虫运动能力增强。这种效应极有可能源于产热作用，因为AOX是一种不泵送质子的末端氧化酶，能够绕过OXPHOS复合体III和IV（CIII和CIV）的功能，而不参与线粒体膜电位（ΔΨm）的建立和ATP的生成19,20,21。包括Drosophila在内的任何昆虫或脊椎动物均不天然拥有AOX21,22,23，但在多种模式系统中成功表达了AOX24,25,26,27,28,29，并证实其在普遍性线粒体呼吸应激（尤其是由CIII和/或CIV过载引起）条件下具有治疗潜力。AOX可赋予生物体对毒性浓度的抗霉素A24和氰化物24,25的抗性，并缓解多种与线粒体功能障碍相关的表型24,25,30,31,32。AOX表达能够改变幼虫行为及线粒体功能这一事实，为深入研究该酶在后生动物细胞与组织代谢和生理中的作用提供了依据33,34。

我们希望本文能够帮助提升巴西等发展中国家科学界对利用黑腹果蝇（D. melanogaster）所具备的优良遗传工具的认识，结合高效且经济的自制行为分析装置，可相对快速地获得有关重要生物学过程的基础研究数据，并产生显著的转化研究价值，从而支持临床研究中未来的治疗学探索。建立此类共享理念将极大惠及果蝇研究者、医学研究人员以及生物与生物医学科学领域。更重要的是，这将使社会整体受益，因为公共资金可更有效地用于理解与治疗人类疾病。

本文提供的用于3D打印果蝇实验装置的方案，是基于可在35获取的Prusa I3 DIY模型的RepRap 3D打印机而设计的。我们使用1.75毫米白色聚乳酸（PLA）耗材（SUNLU）作为打印原材料，采用Tinkercad平台36进行模型设计，并使用Repetier-Host软件37将STL文件转换为G代码，这是向打印机提供坐标所必需的步骤。如果读者希望使用其他设备、材料或软件，则需要对本方案进行进一步优化。

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方案

1. 3D 模型设计

注意：3D 打印的工作流程包含三个基本步骤：（1）3D 建模；（2）将模型导入切片软件；（3）选择合适的耗材，配置打印机，最后进行打印。以下展示了一个小型果蝇培养管架/托盘建模的基本方案；该支架适用于标准果蝇培养管，其直径约为 2.5 cm，高度为 9.8 cm。对于新模型的设计，Tinkercad 软件提供的工具可根据个人需求，轻松操作三维结构，创建出不同形状、尺寸和厚度的部件。对于首次尝试 3D 打印的果蝇研究者而言，即使遵循以下详尽的方案，仍可能面临挑战，因此我们强烈建议先熟悉该软件，以获得最佳效果。

  1. 登录 Tinkercad 在线平台38（图 1A）。需使用个人信息预先注册，方可免费访问该平台。
  2. 点击 创建新项目 以开始新设计，并在窗口右上角相应位置重命名项目。按下 Enter 键，进入项目的操作平面（图 1B）。
  3. 通过鼠标左键点击右下角的 编辑网格（图 1B 中红框），确认操作平面尺寸是否为 200 mm × 200 mm。在弹出窗口（图 1C）中，确保 "单位"为毫米，"预设"为默认值。在 "宽度"和 "长度"字段中均输入 200.00，然后点击 更新网格 以保存更改。
  4. 确认 对齐网格 是否设置为 1.0 mm（图 1B 中红框）。若未设置，点击下拉菜单并选择 1.0 mm。
  5. 在右侧的“基本形状”菜单中（图 1B 中蓝框 2），选择一个实心方块并将其拖至操作平面中心。
  6. 使用鼠标左键点击操作平面上方块的任意位置，以显示其边和顶点。点击任一顶点（该顶点将变为红色），以显示方块的尺寸（图 1D 中红框）。使用鼠标左键依次点击每个尺寸，分别输入长度（L）130 mm、宽度（W）130 mm 和高度（H）40 mm。通过拖动方块将其重新居中至操作平面中央。
  7. 点击屏幕右上角的 标尺 工具（图 1E 中红框 1）。立即点击方块的左下顶点（如 图 1E 中红框 2 所示），以设定三维笛卡尔坐标系的原点（x = 0, y = 0, z = 0）。注意，所选顶点与坐标原点之间的距离将显示出来（图 1F 中红框），其中 "A"、"B" 和 "C" 分别表示到 x、y 和 z 轴的距离（本例中应为零）。
  8. 接下来，从右侧的 基本形状 菜单中（图 1B 中蓝框 2）选择一个空心（孔状）方块并拖至操作平面。将其尺寸设为 30 mm（L）× 30 mm（W）× 40 mm（H），并通过在空心方块右下角绿色箭头旁的文本框中输入 "2.00"，将其抬高 2 mm（图 1G 中红框）。通过在方块左下角绿色箭头旁的文本框中输入 "2.00"，将空心方块置于实心方块内，距离 x、y 坐标原点 2 mm 处（图 1H 中红框；与 图 1G 对比）。
  9. 保持空心方块选中状态，按下键盘上的 Ctrl+D 键执行 "复制" 命令，创建一个尺寸完全相同的新的空心方块。通过在沿 y 轴的绿色箭头旁的文本框中输入 "34.00"，并在其余两个绿色箭头旁的文本框中输入 "2.00"，将新空心方块放置在实心方块内，紧邻第一个空心方块（图 1I 中红框）。
  10. 重复此步骤，根据与坐标原点的正确距离进行调整，直至整个实心方块内布满彼此相距 2 mm 的空心方块（图 1J）。
  11. 使用鼠标左键点击并拖动以选中所有方块（实心和空心）。按下键盘上的 Ctrl+G 键执行 "组合" 命令，生成一个包含 16 个用于放置果蝇小瓶的空腔的单一方块（图 1K）。此即小瓶架的最终设计。
  12. 点击 Tinkercad 窗口右上角的 导出。在弹出的窗口（图 1L）中，选择 包含 旁边的 设计中的全部内容，并在 用于 3D 打印 下选择 .STL 作为文件类型。为设计文件命名，并保存至计算机的适当位置。

2. 3D 打印

注意：在本节中，我们将介绍如何使用在步骤1中创建的STL文件，并将其转换为包含3D打印机打印指令的G代码文件。此过程称为切片，我们使用Repetier-Host软件完成该步骤。

  1. 下载补充文件1，并将其保存在计算机的适当位置。该文件为 .rcp 格式，包含下文将使用的打印机配置。如需了解 .rcp 文件类型的更多信息，请访问39。
  2. 打开 Repetier-Host 软件，该软件应已根据37中的说明安装在计算机上。按下键盘上的Ctrl+O键，以打开在方案1中创建的计算机上的 STL 文件。
  3. 打开后，单击设计好的小瓶架，并按下键盘上的R键，以在屏幕右侧打开编辑菜单（图2A中的红色方框1）。在对象放置选项卡中，单击标有红色方框2（图2A）的居中对象按钮，将对象在打印平台上居中。
  4. 单击对象放置选项卡旁边的切片选项卡（图2B中的红色方框1），然后单击下方的配置按钮（图2B中的红色方框2）。注意，左侧将打开一个新窗口，可在其中定义打印参数，如速度、层厚和支撑结构（详见下文讨论部分）。
  5. 单击导入按钮（图2E中的红色方框3），从文件中选择补充文件1，然后按Enter键。请注意，此 .rcp 文件（在步骤2.1中下载）提供了我们为该小瓶架优化的打印机自动配置参数。
  6. 为完成打印参数配置，在右侧菜单中（图2E中的红色方框4）将支撑类型设置为无，因为该部件的打印无需支撑结构以防止弯曲或其他变形。在填充密度（图2E中的红色方框5）中，选择20%，以形成坚固的结构（有关这些参数的更多细节，请参见下文讨论部分）。
  7. 单击屏幕右上角的使用 CuraEngine 切片，以运行切片程序并生成 G-Code，其中包含打印机打印该部件所需的必要信息。请注意，在右侧菜单中的打印预览选项卡下（位于切片选项卡旁边），将显示完成该打印任务所需的时间和材料用量信息（图2F中的红色方框1）。
  8. 单击保存至SD卡用于打印，将 G-Code 文件保存到 SD 卡中（图2F中的红色方框2）。请注意，G-Code 包含了将设计部件按层切片后的三维坐标，以确保打印机正常工作。
  9. 将 SD 卡插入 RepRap 3D 打印机，然后根据打印机屏幕上显示的信息，选择从 SD 卡进行打印。
  10. 选择小瓶架的 G-Code 文件。请注意，打印机将自动预热并开始打印设计部件，整个过程需数小时。打印任务完成后，该支架（图3A）即可立即投入使用。

3. 行为分析装置

注意：使用适当的调整后，可重复协议 1 和协议 2 中描述的步骤，以打印所需实验室设备的多个部件。然而，我们意识到对于 Tinkercad 的初学者用户而言，设计新部件可能具有挑战性且耗时，因此我们并未提供设计所有模型的逐步操作协议，而是提供了我们创建的多个设计模型的 STL 文件供下载（见补充文件 2-11）。

  1. 下载补充文件2，以获取一种小型漏斗的模型（图3B），该漏斗在果蝇实验室中常规使用，可帮助将成年果蝇转移至新的试管或瓶子中，避免果蝇沿容器内壁爬行逃逸。
  2. 下载补充文件3，以获取敲击垫支架（图3C）的设计文件，该支架可用于固定乙烯-醋酸乙烯酯泡沫垫或厚棉垫，当将果蝇倾倒至装有新鲜培养基的新容器时，可用玻璃试管或瓶子在此垫上轻敲 。
  3. 下载补充文件4和补充文件5，以获取我们命名为Stalker的相机支架模型（图3D）。
    注意：该装置可将任意相机（专业相机、网络摄像头、手机等）固定于底座上方，便于对含有幼虫或成年果蝇的培养皿进行成像或视频记录。Stalker可确保动物行为在水平面上被拍摄，且始终与培养皿保持相同距离，从而避免因在不同日期进行记录或相机在记录间隔被用于其他用途而引入实验测量的变异性。该装置采用模块化设计，使用方便，只需将底座和顶部部件从补充文件4打印，侧部部件从补充文件5打印后即可轻松组装。底座上的1 cm2方格可用永久性记号笔标出，有助于追踪个体动物的移动距离。建议使用白色耗材打印该装置（至少底座部分），以确保背景与动物之间有足够的对比度，便于追踪软件识别每只果蝇。
  4. 下载补充文件6，以获取果蝇旅馆（Fly Motel）的可打印设计（图3E），该装置包含十个求偶与交配区域（房间），布局设计便于同时对十对独立的交配果蝇进行视频记录。请注意，果蝇旅馆基于已发表文献40中描述的装置设计，其在行为学研究中的详细使用方法可在该文献中找到。除3D打印部件外，该装置还需12个螺钉（3 × 8 mm）用于固定上部与下部结构以增强整体稳定性，一块亚克力板（60 × 60 × 3 mm）以及一个密封拉链袋。由于果蝇旅馆结构较为复杂，我们还提供了一段教学视频（补充文件7），展示在所有必要组件和螺丝刀齐备的情况下如何正确组装该装置。
  5. 下载补充文件8，以获取T型迷宫（T-Maze）的模型（图3F），该装置用于成年果蝇的记忆实验。T型迷宫如何用于使果蝇将厌恶性气味刺激与其趋光行为相关联的详细说明，见于原始出版物41。该装置还需使用两个常见的半透明15 mL锥形管，将其连接至中央部件两侧的直径2 cm圆形开口处。请注意，打印T型迷宫时需要添加支撑结构（详见图2图注）。在完成上述步骤2.1–2.6后，选择支撑类型为"全方位"（图2E中的红色方框4）。
  6. 下载补充文件9和补充文件10，以获取我们版本的快速迭代负向趋地性（RING）实验装置的可打印部件设计（图3G），该装置可用于同时对多种基因型或不同环境条件下的成年果蝇进行攀爬实验，从而以更标准化和高通量的方式获得实验结果42。RING装置同样采用模块化设计，除3D打印部件外，还需其他可在线或五金店低成本购得的组件：两根Φ8 × 300 mm的精密光轴、四个Φ8 mm直线轴承、橡皮筋（或绳子段）、一块240 × 60 × 20 mm的木制底座，以及八个木螺钉（8 mm）用于将打印部件固定于木制底座上。下载补充文件11以获取在所有部件打印或采购完成后组装该装置的详细说明。RING装置的使用方法详见原始出版物42。

4. 幼虫运动能力检测

注意：我们对本方案进行了优化，原始方案基于 Nichols 等人42 的研究，旨在分析 AOX 表达对果蝇（Drosophila）在低温胁迫下发育的影响。以 3xtubAOX25 和 w1118 品系分别作为表达 AOX 和对照组幼虫的示例，根据 Saari 等人34 的方法，在标准培养基24 上于 12 °C 条件下培养。我们推荐本方案用于分析在任何感兴趣的遗传背景和环境条件下培养的幼虫样本的运动能力。

  1. 通过将相应量的琼脂在去离子水中煮沸，倒入 Φ90 × 15 mm 的培养皿中，并在室温下使其凝固，制备 2% 琼脂平板。对于每个最终体积为 20 mL 的培养皿，使用 0.4 g 琼脂。
  2. 使用圆头镊子或毛刷小心地从培养管/瓶壁收集游走期 L3 幼虫，并将个体放入盛有去离子水的 Φ90 × 15 mm 培养皿中，冲洗附着在体表的食物颗粒，时间少于 10 秒。
  3. 将单个幼虫转移至含有琼脂糖的培养皿中，静置 5 分钟，使动物适应环境。
  4. 将盛有单个幼虫的培养皿置于坐标纸（0.2 cm2 网格）上，记录幼虫在琼脂表面移动时 1 分钟内穿过的网格线数量。每穿过一条线代表移动了 2 mm 的距离。对同一个体重复该操作 10–15 次，以获得技术重复数据。
  5. 从不同时间培养的不同试管/烧瓶中至少选取 8–10 个个体，重复步骤 4.4，以获得同一条果蝇品系的生物学重复数据。
  6. 重复步骤 4.4 和 4.5，以获取其他果蝇品系（或所有拟分析品系）的相应数据。
  7. 在步骤 4.4–4.6 中使用的同一个个体育虫可用于进一步获取身体运动数据：将盛有个体育虫的琼脂培养皿置于体视显微镜下，记录体壁每分钟的蠕动收缩次数。获取技术重复和生物学重复数据，以估算各果蝇品系间的平均运动能力。
  8. 应用统计检验方法，计算这些幼虫运动参数在不同品系间存在差异的概率。由于此处仅比较两个品系的数据，可采用 Student's t 检验。

5. 使用幼虫匀浆进行线粒体呼吸测定

注意：以下方案已优化用于检测表达AOX的3x品系幼虫匀浆中的线粒体氧消耗tubAOX 和对照组 w1118，于12°C培养，但我们同样推荐将其用于任何遗传背景和环境条件下的幼虫样本。我们意识到，进行此类实验不应被纳入 "经济实惠的" 目标为一个 "自制" flylab，与本文提供的所有其他方案不同，实验室需要投入较高的初始成本来购置高分辨率氧检测仪。本方案需配合Oroboros Instruments公司生产的Oxygraph-2k（O2k）及DatLab软件使用，因此若读者拟采用其他设备，则需进行进一步优化。

  1. 打开 O2k 并启动连接氧电极的计算机上的 DatLab 软件。检测室内的磁力搅拌子应自动开始旋转。从检测室中移除乙醇保存液。
  2. 用 100% 乙醇清洗检测室至少 3 次，再用超纯水清洗 3 次。
  3. 在 DatLab 中，O2k 控制窗口将自动打开。在 阻断温度 [°C] 中输入 12 °C（或 2–47 °C 范围内的所需温度），然后点击 确定。
  4. 随后将自动打开第二个窗口 编辑实验。根据将在 A 和 B 检测室中添加的样品，在 样品 字段中输入样品名称，然后点击 保存。
  5. 向每个检测室中加入 1800 µL 检测缓冲液（120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM Hepes、1 mM EGTA、1 mM MgCl2、2% BSA，pH 7.4），并部分关闭检测室，仍允许与外界空气进行氧气交换。等待氧浓度和氧通量信号稳定，至少 10 分钟内波动极小。此步骤将实现实验当天仪器与外界空气的校准（有关实验校准的更多细节，请参见步骤 6.3 和 6.4）。
  6. 在空气校准期间，开始样品制备：使用镊子或小号画笔小心从培养管/瓶中收集 20 只适当基因型的游动幼虫。
  7. 用去离子水或 1× PBS（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na2HPO4 和 2 mM KH2PO4）快速但彻底地冲洗每只幼虫，并将其转移至冰上含有 500 µL 冰冷分离缓冲液（250 mM 蔗糖、5 mM Tris HCl、2 mM EGTA，pH 7.4）的 1 mL 玻璃匀浆器中。
  8. 用 5 次冲程匀浆整个幼虫，然后将匀浆液倒入冰上的 1.5 mL 微离心管中。
  9. 向玻璃匀浆器中加入 300 µL 分离缓冲液，再用 3 次冲程进一步研磨残留幼虫组织，再次将匀浆液倒入同一冰上的微离心管中。
  10. 向玻璃匀浆器中加入 200 µL 分离缓冲液，再用 2 次冲程进一步研磨残余幼虫组织，再次将匀浆液倒入同一冰上的微离心管中。
  11. 轻轻倒置管子 2 次以混匀最终匀浆液（约 1 mL），并在处理第二个样品前保持冰上放置。
  12. 重复步骤 5.6–5.11，以获得另一基因型的幼虫匀浆液。
  13. 打开氧电极检测室 A 和 B，将每种匀浆液各 200 µL 转移至各检测室的检测缓冲液中（此时缓冲液温度必须精确为 12 °C）。完全关闭检测室，等待氧浓度和氧通量信号稳定约 10 分钟。
  14. 通过向每个检测室加入 5 µL 的 2 M 丙酮酸和 2 M 脯氨酸溶液（最终浓度均为 5 mM）以及 7.5 µL 的 0.4 M 苹果酸溶液（1.5 mM），开始氧消耗测量。等待至少 5 分钟以使信号稳定。注意，此时线粒体将被可氧化底物饱和，以启动三羧酸（TCA）循环反应。氧消耗信号的任何增加可能归因于解偶联蛋白的功能（或其他解偶联现象），可用于计算一般性解偶联呼吸（也称为无腺苷酸存在时的漏呼吸，LN——详见代表性结果部分）。
  15. 向每个检测室加入 4 µL 的 0.5 M ADP 溶液（1 mM），并等待至少 5 分钟以使信号稳定。通常会立即观察到氧消耗信号显著上升，代表氧化磷酸化（OXPHOS）呼吸。该 OXPHOS 呼吸的绝大部分由复合体 I（CI）驱动。
  16. 向每个检测室加入 2 µL 的 0.05 M 抗霉素 A 溶液（0.05 mM）以抑制 CIII，并等待至少 5 分钟以使信号稳定。w1118 对照样品的氧消耗信号应下降至添加丙酮酸、脯氨酸和苹果酸前的基线水平。表达 AOX 的幼虫线粒体呼吸对抗霉素 A 具有部分抗性，因为电子此时可转向 AOX。CIII 抑制后，总 OXPHOS 呼吸的约 40% 应保留，且完全由 AOX 支持。
  17. 向每个检测室加入 4 µL 的 0.1 M 丙基没食子酸（0.2 mM）以抑制 AOX，并等待至少 15 分钟以使信号稳定。表达 AOX 的幼虫样品的氧消耗水平现在应下降至添加丙酮酸、脯氨酸和苹果酸前的基线水平。这一下降证明此前观察到的抗抗霉素 A 呼吸确实由 AOX 功能介导。
  18. 向每个检测室加入 1 µL 的 0.01 M 鱼藤酮溶液（0.005 mM）以抑制 CI，并等待至少 5 分钟以使信号稳定，从而获得不依赖线粒体呼吸的样品氧消耗信号。该信号通常与添加丙酮酸、脯氨酸和苹果酸前观察到的信号一样低。
  19. 保存实验并关闭 DatLab 软件。

6. 线粒体呼吸测定数据处理

注意：耗氧量值是通过测定特定时间段内氧气通量信号的平均值得出，表示为每秒每毫克样品总蛋白所消耗的皮摩尔氧气（pmol O2）。该数值首先根据实验当天实验温度下测定的缓冲液中最大氧气浓度（即空气饱和度）和最小氧气浓度进行校正；最小氧气浓度是通过在每个检测室中向测定缓冲液添加连二亚硫酸钠（Na2S2O4）预先确定的（参见43以获取制造商关于零氧校准的指南）。此外，数值还根据加入各检测室缓冲液中的幼虫匀浆所含总蛋白量进行归一化处理。

  1. 使用 Bradford 法测定每个样品的总蛋白浓度44。在 DatLab 软件中重新打开已保存的实验，点击顶部菜单中的Experiment，然后选择Edit。在弹出的窗口中，在Unit部分选择mg，并在Amount部分输入加入每个腔室的 200 µL 样品中所含的蛋白量。软件将根据总腔室体积 2 mL 自动计算浓度。点击Save按钮。
  2. 点击顶部菜单中的Graph，然后选择 Select plots。在弹出的窗口中，为两个图（分别为腔室 A 和 B 对应的图 1 和图 2）均选择Flux per mass。点击Ok。此时实验结果已根据样品的蛋白浓度进行归一化处理（单位为 pmol O2/s/mg 总蛋白）。
  3. 在主实验结果页面的每个图（图 1 和图 2）右上角，点击O2 Concentration。沿 x 轴确定在样品加入腔室之前的一段时间范围，该范围内氧气浓度和通量信号非常稳定。
    1. 按住计算机键盘上的 Shift 键，用鼠标左键点击所选起始时间点，沿时间轴拖动光标以选择所需区域，然后松开鼠标按钮。对每个图分别执行此操作。
    2. 双击图表底部所选区域的蓝色条，输入"air"，以表明这些区域用于计算氧气空气饱和度。
  4. 点击顶部菜单栏中的Calibration，选择A: Oxygen, O2以校准腔室 A。在弹出的窗口中，确认已选择O2 Calib（呈黄色）。
    1. 对于Zero calibration，点击Copy from file，并选择先前完成的零氧校准文件（参见 43 中的制造商指南）。
    2. 对于Air calibration，在Select Mark列中选择air。点击Calibrate and copy to clipboard。
  5. 点击顶部菜单栏中的Calibration，选择B: Oxygen, O2，并重复步骤 6.4 以校准腔室 B。
  6. 在主实验结果页面的每个图（图 1 和图 2）右上角，点击O2 flux per mass。按住键盘上的 Shift 键，用鼠标左键点击并沿时间轴拖动光标，选择氧消耗信号中理想的稳定区域。在加入丙酮酸/脯氨酸/苹果酸和 ADP 之间的稳定区域代表LN；ADP 与抗霉素 A 之间的区域代表 OXPHOS；抗霉素 A 与没食子酸丙酯（CIII 抑制后）之间的区域代表抗霉素 A 抵抗性呼吸；没食子酸丙酯与鱼藤酮（CIII+AOX 抑制后）之间的区域代表残余呼吸；鱼藤酮加入后（CI+CIII+AOX 抑制后）代表残余非线粒体呼吸。双击图表底部所选区域的红色条，并输入相应的标签。
  7. 点击顶部菜单栏中的Marks，然后选择Statistics。在弹出窗口的Show选项卡中，仅保留勾选O2 flux per mass，其余选项取消勾选。在同一窗口的Select选项卡中，选择腔室 A 以获取第一个样品的呼吸数据。点击Copy to clipboard，并将数据粘贴至电子表格中。重复该过程以获取腔室 B 中第二个样品的数据。
  8. 在电子表格中，将所有呼吸值减去残余非线粒体呼吸值（即加入鱼藤酮后的数据）。对多个实验重复数据计算平均值，并按需绘制图表。

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结果

通过遵循方案1和方案2中的步骤，应能够设计一个简单的果蝇培养瓶架，并将模型的STL文件导入切片程序，以生成3D打印机所需的坐标。图3A展示了打印出的模型实物与其设计图的对比。我们还希望步骤1能够为使用者提供基本技能，使其能够利用Tinkercad平台中提供的基本几何形状，为实验室创建实用的装置。然而，掌握这些技能可能需要持续练习并经常参考Tinkercad帮助中心45。在方案3中，我们提供了自己设计的装置，这些装置是我们日常用于成虫或幼虫的常规果蝇饲养及行为学研究的工具。通过遵循方案2，研究人员应能够使用方案3中提供的补充文件2-6和8-10中的STL文件，打印出敲击垫支架、漏斗、Stalkers、Fly Motels、T型迷宫以及RING装置。图3B-G展示了模型设计图与实际打印组装后装置的并列图像。需要特别指出的是，每台打印机可能需要对打印参数进行微调以达到最佳效果；...

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讨论

本文提供的3D打印方案和STL文件旨在通过使用"自制"设备，帮助建立新的果蝇实验室，或扩充现有Drosophila行为学研究设施的仪器种类。这种3D打印策略在巴西等发展中国家可能尤为有用，因为在这些国家，以Drosophila作为研究人类生物学模型生物的研究尚显不足，且专用设备价格昂贵。我们的方案提供了如何制作塑料框架以及组装相对简单装置的说明，例如培养管架、记忆实验、求偶行为实验和攀爬实验装置，这些装置可能仅需额外添加一些简单的非打印部件即可实现完整功能。为获得理想的打印效果，用户可能需要根据自身打印机的情况调整若干打印参数。在图2B中，位于"速度与质量"（红色方框3）下的设置选项，包含可能决定最终打印件质量的关键参数。"打印速度"控制打印机挤出头形成3D部件时的工作速度范围；速度越低，最终质量越高，但完成任务所需的总时间也越长。在"第一层"设置中，应特别关注直接打印在打印平台上的那层的速度。该层打印速度应较慢（30 mm/s），因为第一层的任何缺陷都可能影响其上方所有层，导致...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Emily A. McKinney 对稿件的英文编辑。G.S.G. 获得了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 141001/2019-4）提供的博士后奖学金支持。M.T.O. 感谢圣保罗研究基金会（FAPESP，资助号 2014/02253-6 和 2017/04372-0）以及巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，资助号 424562/2018-9 和 306974/2017-7）提供的经费支持。C.A.C.-L. 感谢巴西西部保罗大学提供的内部财政支持。转基因果蝇品系的相关工作已获得贾博蒂卡巴尔农业与兽医学院地方生物安全委员会（CIBio）的批准，批准协议号为 001/2014 和 006/2014；同时亦获得国家生物安全技术委员会（CTNBio）的批准，批准协议号为 36343/2017/SEI-MCTIC、01200.706019/2016-45 和 5488/2017。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D打印机 RapRep一款基于 Prusa I3 DIY 模式的流行 3D 打印机，制作说明详见 https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/
3xtubAOX 果蝇品系Howy Jacobs´s 实验室，坦佩雷大学表达受组成型启动子调控的来自 C. intestinalis 的 AOX 基因的果蝇品系 α-微管蛋白启动子。该构建体在雄性和雌性中分别以5个和6个拷贝存在，分别为半合子和纯合子状态，分别位于X、2号和3号染色体上。
丙烯酸板60 x 60 x 3 mm
ADPSigma-AldrichA2754腺苷5′二磷酸钠盐（CAS号 20398-34-9）； ≥95%；分子量 = 427.20 g/mol；水中溶解度为 50 mg/ml
抗霉素ASigma-AldrichA8674抗霉素A（源自链霉菌属，CAS号 1397-94-0）；分子量约 548.63 g/mol；在95%乙醇中的溶解度为 50 mg/mL
琼脂生长K25-611001用于细菌学；粉末；凝固剂（12-20 g/L）
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7030热激组分，无蛋白酶，无脂肪酸，基本无球蛋白（CAS编号 9048-46-8）；pH 7 ≥98%；水中溶解度为40 g/mL
去离子水
EGTASigma-AldrichE4378乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（CAS号 67-42-5）； ≥97%；分子量 = 380.35 g/mol
乙醇 99.5%
乙烯-醋酸乙烯酯泡沫可用厚棉片替代
坐标纸0.2 cm² 网格
HepesSigma-AldrichH40344-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（CAS号 7365-45-9），BioPerformance 认证； ≥99.5%（滴定法），经细胞培养测试；分子量 = 238.30 g/mol
匀浆器赛多利斯手持式玻璃匀浆器（S型），1 mL；由硼硅酸盐玻璃制成的圆筒和S型柱塞组成；常用于简单的样品制备，例如组织样品的破碎。
KClAmresco0395-2氯化钾（CAS号 7447-40-7）； ≥99.0%；分子量 = 74.55 g/mol
KH2PO4Sigma-AldrichP5379磷酸二氢钾（CAS号 7778-77-0）；ReagentPlus；分子量 = 136.09 g/mol
线性轴承（LM8UU）8 mm，任何品牌
苹果酸Sigma-AldrichM1000L-(-)-苹果酸（CAS编号 97-67-6）； ≥95-100%；分子量 = 134.09 g/mol，水中溶解度：100 mg/mL。溶液的 pH 值调节至约 7.0。
MgCl2Amresco0288-1KG氯化镁六水合物（CAS号 7791-18-6）；纯度99%–102%；分子量 = 203.3 g/mol
微量离心管1.5 mL；每100刻度µL，可高压灭菌
Na2HPO4Amresco0348-1KG磷酸氢二钠七水合物（CAS号 7782-85-6）；纯度98-102%；分子量 = 268.07 g/mol
NaCl霍尼韦尔31434-1KG氯化钠（CAS编号 7647-14-5）； ≥99.5%；分子量 58.44 g/mol。仅限实验室使用。
Oxigraph-O2kOroboros10000-02系列 D-G；O2k 核心组件：包括带有不锈钢外壳的 O2k 主机单元、O2k 装配工具包、两个 OroboPOS（极谱式氧气传感器）及 OroboPOS 维护工具包、DatLab 软件、ISS-集成抽吸系统以及 O2k 滴定套装。
永久性记号笔优选黑色
培养皿90 × 15 毫米培养皿；常用于细菌培养
PLA 3D打印耗材Quantum3D 打印http://quantum3dprinting.com/高质量聚乳酸丝材（PLA），强烈推荐，（1.0 kg 卷装），任何品牌
脯氨酸Sigma-AldrichP0380L-脯氨酸（CAS号 147-85-3）；粉末；纯度99%；分子量 = 115.13 g/mol
没食子酸丙酯Sigma-AldrichP3130没食子酸丙酯（CAS号 121-79-9）；粉末； ≥98%；分子量 = 212.20 g/mol；在乙醇中溶解度为 50 mg/ml
丙酮酸Sigma-AldrichP2256丙酮酸钠（CAS编号 113-24-6）， ≥99%；分子量 = 110.04 g/mol；水中溶解度为 100 mg/mL
矫正轴8 × 300 毫米，任何品牌
RotenoneSigma-AldrichR8875鱼藤酮（CAS 号 83-79-4）； ≥95%，分子量 394.42 g/mol
橡皮筋可用一段字符串替换
螺丝刀组装部分3D打印装置
螺丝M3 × 8 mm
SD 卡至少 32Mb 大小；通常随 3D 打印机提供
软件 Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/出色的切片软件，免费提供
软件 TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.com免费的三维模型设计软件
体视显微镜LeicaM-80体视显微镜，变倍范围 7.5-60X + Leica cls 150 LED 光源
蔗糖默克107,651,000蔗糖（用于微生物学，CAS号 57-50-1）；
TrisAmersham Biosciences17-1321-01Tris（羟甲基）氨基甲烷（CAS号 77-86-1）；纯度99.8-100.1%；分子量121.14 g/mol
镊子斯塔克ST08710组织学镊子，直头，圆尖，12 cm，AISI-410不锈钢
w1118 果蝇品系Howy Jacobs´s 实验室，坦佩雷大学用于3XtubAOX的遗传背景对照果蝇品系
木板240 x 60 x 20 毫米
紧身连裤袜2 × 210 毫米，任何品牌

参考文献

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