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方法文章

测定紫外线辐射和化学物质对原代及永生化人角膜上皮细胞的毒性

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DOI：

10.3791/62675

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2021年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

本文内容

摘要

本文描述了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代细胞系和永生化细胞系毒性的实验步骤。

摘要

本文描述了测量紫外线（UV）辐射和眼毒性物质对原代（pHCEC）和永生化（iHCEC）人角膜上皮细胞培养物毒性的方法。将细胞暴露于UV辐射以及苯扎氯铵（BAK）、过氧化氢（H2O2）和十二烷基硫酸钠（SDS）的毒性剂量中。采用代谢检测法测定细胞代谢活性，使用多重白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测法测定炎症细胞因子的释放，并利用荧光染料评估细胞活力。

紫外线对iHCEC细胞的代谢活性和细胞因子释放产生损伤效应的时间为5分钟，对pHCEC细胞则为20分钟。iHCEC和pHCEC在暴露于BAK、H2O2或SDS后，其代谢活性下降的百分比相似，而细胞因子释放中最显著的变化出现在IL-6和IL-8。经荧光染色的iHCEC和pHCEC细胞在BAK暴露后的显微镜观察显示，在0.005% BAK暴露下即出现细胞死亡，尽管iHCEC中的碘化乙啶染色程度高于pHCEC。通过显微镜观察、代谢活性评估和细胞因子产生等多种方法评估毒性效应，可确定紫外线辐射及化学毒素对原代和永生化细胞系的毒性作用。

引言

体外毒理学研究用于预测化学物质及其他可能对细胞造成损伤的试剂的毒性效应。在角膜毒性评估中，人角膜上皮细胞（HCECs）已被用于评价这些效应的模型中1,2,3,4。这些模型通常评估生理效应，例如细胞代谢活性的变化、细胞增殖以及其他细胞功能，如炎症性细胞因子的产生和释放。在这些毒理学研究中，已选用来自不同来源的细胞来评估化学物质和紫外辐射对HCECs的损伤作用2,3。pHCEC细胞系可从提供成人供体组织来源细胞的公司获得。原代细胞可用dispase处理，并轻轻刮取角膜表面用于培养5。随后对细胞进行病毒和污染检测，再以10%二甲基亚砜冷冻保存后运输。

原代细胞系的优点在于其细胞与供体细胞在遗传上完全相同。这一点非常理想，因为 体外 模型应模拟 体内 尽可能多地利用组织。原代细胞系的缺点是其细胞分裂次数或传代次数有限6可用的细胞数量有限，限制了单次原代培养所能开展的实验数量，从而增加了实验成本。

永生化细胞系也已用于细胞培养毒性模型。然而，与从原代细胞系获得的细胞不同， 体内 组织，该永生化细胞系在遗传上已被改变。永生化细胞是通过将病毒基因整合到原代细胞的DNA中而获得的6,7,8筛选出成功整合病毒基因的细胞，以建立永生化细胞系。永生化的优势在于可实现无限快速增殖，从而提供数量无限的细胞，用于基于同一细胞系的多项实验。这有助于保证实验间的可重复性，并降低实验成本。

除了限制细胞增殖的基因发生变化外，具有关键功能的基因表达也可能发生改变9。因此，使用永生化细胞的一个缺点是，它们可能在对各种外界刺激的反应方面不再代表原始的体内细胞10。已有研究通过观察化学物质对原代人角膜基质细胞和永生化人角膜基质细胞的毒性作用进行比较11，以及对永生化人角膜上皮细胞（HCECs）和兔角膜上皮原代细胞的比较12。原代人角膜基质细胞与永生化角膜基质细胞在毒素作用下的比较显示，两者之间无显著差异11。通过本文详述的方法，将确定这些检测方法在评估紫外线辐射和眼毒性物质对pHCECs和iHCECs毒性作用方面的有效性。

三种常用的眼部毒素 体外 检测选用了BAK、H2O2，以及SDS。BAK是一种阳离子防腐剂，常用于眼科溶液中13,14，H2O2 常用于消毒隐形眼镜15，SDS 是一种阴离子表面活性剂，常见于洗涤剂和洗发水中14与眼毒性物质类似，紫外线辐射也会对人角膜上皮细胞（HCECs）造成显著损伤3此外，过度暴露于紫外线可导致一种称为光性角膜炎的眼部疾病，其症状包括流泪、畏光和异物感16.

可用于研究的原代细胞培养物种类无限，且已有多种永生化细胞系被开发出来。因此，本研究旨在比较原代人角膜上皮细胞（HCECs）与一种永生化HCEC细胞系，以明确使用这两类细胞的模型之间的相似性与差异性。

本研究采用显微镜技术评估pHCECs与iHCECs在细胞对紫外线及毒素的生理反应方面可能存在的差异。同时评价了紫外线辐射和化学物质对这两种细胞系的细胞代谢活性及炎症性细胞因子释放的影响。明确这两种细胞系之间差异的重要性在于，有助于理解在以下研究中如何最优地使用这些细胞系：1）评估紫外线辐射对细胞的影响；2）评估毒素对细胞的影响；3）为未来研究提供关于代谢、细胞活力及细胞因子释放变化的可靠依据。

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方案

1. pHCECs 和 iHCECs 的培养

  1. 在人眼表皮细胞培养基（HOEM）中培养pHCECs和iHCECs，添加以下成分：6 mM L-谷氨酰胺、0.002% 细胞培养基补充剂O（材料表）、1.0 µM 肾上腺素、0.4% 细胞培养基补充剂P（材料表）、5 µg/mL 重组人胰岛素、5 µg/mL 去铁转铁蛋白和100 ng/mL 氢化可的松半琥珀酸酯，置于经I型胶原包被的培养瓶中（75 cm2 培养瓶中加入18 mL培养基）。
  2. 当细胞生长至约80%融合度时，每2-3天更换一次培养瓶中的培养基。弃去旧培养基，加入不含酚红的消化液，于37 °C孵育直至细胞完全脱落。用含血清的DMEM/F12培养基中和消化液，随后以500 × g 离心细胞。弃去上清液，将细胞重悬于HOEM培养基中。

2. 使用共聚焦显微镜测定细胞大小

  1. 将原代角膜上皮细胞（pHCECs）和诱导性角膜上皮细胞（iHCECs）以 1 × 105 的密度接种于包被胶原的带有玻底盖玻片的培养皿中，每皿加入 1 mL HOEM 培养基。将 pHCECs 和 iHCECs 分别置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养，一组培养 24 小时，另一组培养 48 小时。
  2. 培养结束后，加入 500 µL 含钙黄绿素（4 µM）、碘化乙啶同型二聚体-1（8 µM）和 Annexin V（5 µL Annexin V-Alexa Fluor 647 偶联物溶于 500 µL 缓冲液）的染色缓冲液，于 37 °C 孵育 20 分钟进行染色。染色完成后，使用共聚焦激光扫描显微镜，调节显微镜参数以分别采集钙黄绿素-AM（488/515 nm）、碘化乙啶同型二聚体-1（543/600 nm）和 Annexin V（633/665 nm）的激发/发射波长图像。
  3. 获取图像并采集 Z 轴堆栈图像，以在三维水平评估细胞大小。
    1. 为获取二维（2D）和三维（3D）图像，使用 40x/1.2 水镜（复消色差物镜）找到待成像区域。使用氩离子激光（488 nm，第一扫描）、HeNe1 激光（543 nm，第二扫描）和 HeNe2 激光（633 nm，第三扫描），通过分光镜 HFT 488/543/633、NFT 635 Vis、NFT 545、LP560 和 LP505，在三个独立通道中分别进行扫描。
    2. 采用多通道顺序扫描模式以减少串扰。
      注意：LP505 用于第二通道配合 488 nm 激光，以采集钙黄绿素荧光的发射光；LP560 用于第三通道配合 543 nm 激光，以采集碘化乙啶同型二聚体-1 的发射光；NFT 635 与 633 nm 激光配合使用，以采集 Annexin V 的发射光。HFT 的作用是分离激发光与发射光；NFT 可将波长 < 设定值的光反射至一个通道，而使波长 > 设定值的光透过至另一通道；长通滤光片（LP）则阻断短于设定波长的光，允许更长波长的光通过。
    3. 为进行三维成像，将共聚焦显微镜设置为 Z 轴堆栈模式，并至少扫描 20 帧。

3. 细胞的紫外线辐射处理

  1. 将细胞以每毫升 HOEM 5 × 104 个细胞的密度接种于24孔胶原蛋白-1包被的培养板的每个孔中，在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。孵育结束后，将每孔培养基体积减少至300 µL。随后，在另一实验中，将细胞置于37 °C培养箱中，同时开启UVA（6.48 W/m2）和UVB（1.82 W/m2）光源，分别进行5分钟和20分钟的紫外辐射处理。
  2. 紫外辐射处理后，向每孔加入200 µL新鲜HOEM培养基，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育20小时。
  3. 孵育结束后，收集各孔中的细胞上清液，转移至无菌的2 mL聚丙烯管中，于-80 °C冷冻保存。为测定pHCECs和iHCECs在紫外线照射后释放的细胞因子水平，采用多重细胞因子检测试剂盒，按照说明书操作，定量检测以下四种细胞因子：IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α。
  4. 向各孔细胞中加入代谢检测试剂。
  5. 用DMEM/F12培养基配制10%的代谢检测试剂。将每孔中的培养基更换为1 mL上述10%代谢检测试剂溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育4小时。
  6. 使用荧光酶标仪在激发/发射波长530/590 nm条件下测定各孔溶液的荧光强度。

4. 细胞暴露于化学毒素

  1. 在24孔胶原蛋白-1包被的培养板中，每孔加入5 × 104/mL的HOEM培养基接种细胞，于37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。孵育结束后，吸除培养基，每孔加入1 mL化学毒素溶液（含BAK 0.001%、H2O2 0.01%和SDS 0.0025%的磷酸盐缓冲液（PBS）），分别作用5分钟和15分钟。
  2. 化学毒素处理后，吸除各孔中的毒素溶液，用1 mL PBS洗涤一次，每孔加入1 mL HOEM培养基。继续孵育20小时后，更换为1 mL 10%代谢检测试剂，于37 °C、5% CO2条件下孵育4小时，随后使用荧光多孔板读数仪在激发/发射波长530/590 nm下测定荧光值。
  3. 20小时孵育结束后，将各孔中的细胞上清液转移至独立的无菌2 mL聚丙烯管中，于-80 °C冷冻保存。定量分析pHCECs和iHCECs在化学物质刺激后释放的细胞因子。采用与检测UV照射细胞相同的多重检测平台，按照试剂盒说明书使用多重细胞因子检测试剂，定量以下四种细胞因子：IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α。

5. 暴露于不同浓度BAK的细胞的检测

  1. 将细胞以每毫升 HOEM 1 × 105 个的密度接种于 24 孔胶原蛋白-1 包被的培养板中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 24 小时。培养结束后，移除培养基，并向每孔加入 1 mL 化学毒素（含 0.001% BAK、0.005% BAK 或 0.01% BAK 的 PBS 溶液），作用 5 分钟。
  2. 处理结束后，移除化学毒素，用 1 mL PBS 洗涤各孔，随后每孔加入 1 mL HOEM。继续培养 20 小时后，每孔加入 500 µL 含钙黄绿素（4 µM）、乙啶同二聚体-1（8 µM）和 annexin V（5 µL annexin V-Alexa Fluor 647 偶联物溶于 500 µL 缓冲液）的染色缓冲液，于 37 °C 染色 20 分钟。调整显微镜参数，分别在激发/发射波长 630/675 nm、495/515 nm 和 528/617 nm 下检测 annexin V、钙黄绿素 AM 和乙啶-1 的荧光强度，使用荧光显微镜对细胞成像。

6. 数据分析

  1. 在进行方差分析（ANOVA）、Welch 方差分析或 Kruskal-Wallis 检验之前，先进行正态性检验和方差齐性检验。使用适当的事后检验方法对所测试的各组进行比较。设定 p < 0.05。

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结果

细胞大小
原代和永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）使用三种荧光染料进行观察，这些染料反映了细胞活性的三个不同阶段。活细胞呈绿色（钙黄绿素-AM），死细胞呈红色（乙啶同源二聚体-1），凋亡细胞呈黄色（膜联蛋白V，经计算机调整颜色以更好显示荧光信号）。活细胞的细胞质中含有酯酶，可将钙黄绿素-AM转化为钙黄绿素。死细胞的细胞膜对乙啶同源二聚体-1具有通透性。凋亡细胞的细胞膜上出现染色，这是因为磷脂酰丝氨酸被转运至细胞膜外层。

使用共聚焦显微镜对两种类型的人角膜内皮细胞（HCECs）在培养24小时和48小时后的细胞大小进行比较，结果如图1所示。在培养24小时后，iHCECs（图1A）为较小的细胞，大小范围为10 µm至20 µm，而pHCECs（图1B）的大小范围为20 µm至50 µm。在培养48小时后，iHCECs（图1C<...

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讨论

评估了两种类型 HCEC 在使用上的潜在差异。将细胞置于相同的培养基（HOEM）中，在细胞浓度相同的情况下，分别暴露于短时间和长时间的紫外辐射以及三种眼毒性物质。紫外辐射和化学物质的剂量选择基于其生理效应，这些效应对细胞造成的损伤足以产生可比较的中间反应。5 分钟和 20 分钟的紫外辐射暴露时间，以及 0.001% BAK、0.0025% SDS 和 0.01% H2O2 三种物质分别作用 5 分钟和 15 分钟，是能够显示细胞与未处理对照组之间显著差异反应的理想暴露时间和浓度。

HOEM 是一种无血清培养基，专为 HCEC 的培养优化。HOEM 可支持原代细胞和永生化细胞的生长。本研究所用的永生化细胞系是通过 SV408 实现永生化的。SV40 永生化细胞表达可干扰 Rb、p53 和 pp2a17 的癌基因蛋白，从而促进细胞周期进程。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）可结合并抑制 E2F 转录因子；当 E2F 不被抑制时，细胞即可推进细胞周期并进行分...

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披露

在过去三年中，作者Lyndon W. Jones通过CORE获得了以下公司的研究资助或讲座酬金：Alcon、Allergan、Allied Innovations、Aurinia Pharma、BHVI、CooperVision、GL Chemtec、i-Med Pharma、J&J Vision、Lubris、Menicon、Nature's Way、Novartis、Ophtecs、Ote Pharma、PS Therapy、Santen、Shire、SightGlass SightSage和Visioneering。Lyndon Jones还担任Alcon、CooperVision、J&J Vision、Novartis和Ophtecs的顾问和/或顾问委员会成员。其他作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者在本研究中未获得任何资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
75 cm2 透气培养瓶Corning354485此为 BioCoat 品牌，胶原蛋白包被
96 孔板costar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Annexin 染色缓冲液Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin VInvitrogen, Burlington, ON, Canada
配备 Zeiss 共聚焦激光扫描显微镜 510 系统的 Axiovert 100 显微镜Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 孔板Corning354505此为 BioCoat 品牌，胶原蛋白包被
Cytation 5BioTekCYT5MPV可检测 280 - 700 nm 范围内的荧光（本实验使用 540/590 nm）
胎牛血清HyconeSH30396.03
玻璃底盖玻片MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
人角膜上皮细胞渥太华大学N/A来自 M. Griffith 博士（加拿大渥太华眼科研究所，渥太华）的 SV40 永生化人角膜上皮细胞，已进行表征：Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. 利用细胞系构建功能性人角膜等效物. Science. 1999;286:2169-72.
含以下添加剂的人眼上皮细胞培养基（HOEM）：Millipore, Billerica, MA, USASCMC001Epigro 基础培养基添加 6 mM L-谷氨酰胺、0.002% EpiFactor O（文章中的细胞培养基补充剂 O）、1.0 μM 肾上腺素、0.4% EpiFactor P（文章中的细胞培养基补充剂 P）、5 μg/mL 重组人胰岛素、5 μg/mL 去铁转铁蛋白和 100 ng/mL 氢化可的松半琥珀酸酯，置于胶原蛋白-1 包被的培养瓶中（BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA）。
活/死细胞染色试剂（钙黄绿素和溴化乙啶同型二聚体）Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 仪器Rockville, MD, USA
MSD 人促炎因子 Panel II (4-Plex) V-Plex 检测试剂盒Rockville, MD, USA
青霉素-链霉素Gibco15140-122100 倍浓缩液，每 99 mL 培养基中加入 1 mL
原代角膜上皮细胞Millipore, Billerica, MA, USASCCE016
SpectraMax 荧光多孔板读板仪Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express（细胞解离溶液）Fisher Scientific12605036

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