本文描述了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代细胞系和永生化细胞系毒性的实验步骤。
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本文内容
摘要
摘要
本文描述了测量紫外线（UV）辐射和眼毒性物质对原代（pHCEC）和永生化（iHCEC）人角膜上皮细胞培养物毒性的方法。将细胞暴露于UV辐射以及苯扎氯铵（BAK）、过氧化氢（H2O2）和十二烷基硫酸钠（SDS）的毒性剂量中。采用代谢检测法测定细胞代谢活性，使用多重白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测法测定炎症细胞因子的释放，并利用荧光染料评估细胞活力。
紫外线对iHCEC细胞的代谢活性和细胞因子释放产生损伤效应的时间为5分钟，对pHCEC细胞则为20分钟。iHCEC和pHCEC在暴露于BAK、H2O2或SDS后，其代谢活性下降的百分比相似，而细胞因子释放中最显著的变化出现在IL-6和IL-8。经荧光染色的iHCEC和pHCEC细胞在BAK暴露后的显微镜观察显示，在0.005% BAK暴露下即出现细胞死亡，尽管iHCEC中的碘化乙啶染色程度高于pHCEC。通过显微镜观察、代谢活性评估和细胞因子产生等多种方法评估毒性效应，可确定紫外线辐射及化学毒素对原代和永生化细胞系的毒性作用。
引言
体外毒理学研究用于预测化学物质及其他可能对细胞造成损伤的试剂的毒性效应。在角膜毒性评估中，人角膜上皮细胞（HCECs）已被用于评价这些效应的模型中1,2,3,4。这些模型通常评估生理效应，例如细胞代谢活性的变化、细胞增殖以及其他细胞功能，如炎症性细胞因子的产生和释放。在这些毒理学研究中，已选用来自不同来源的细胞来评估化学物质和紫外辐射对HCECs的损伤作用2,3。pHCEC细胞系可从提供成人供体组织来源细胞的公司获得。原代细胞可用dispase处理，并轻轻刮取角膜表面用于培养5。随后对细胞进行病毒和污染检测，再以10%二甲基亚砜冷冻保存后运输。
原代细胞系的优点在于其细胞与供体细胞在遗传上完全相同。这一点非常理想，因为 体外 模型应模拟 体内 尽可能多地利用组织。原代细胞系的缺点是其细胞分裂次数或传代次数有限6可用的细胞数量有限，限制了单次原代培养所能开展的实....
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方案
1. pHCECs 和 iHCECs 的培养
- 在人眼表皮细胞培养基（HOEM）中培养pHCECs和iHCECs，添加以下成分：6 mM L-谷氨酰胺、0.002% 细胞培养基补充剂O（材料表）、1.0 µM 肾上腺素、0.4% 细胞培养基补充剂P（材料表）、5 µg/mL 重组人胰岛素、5 µg/mL 去铁转铁蛋白和100 ng/mL 氢化可的松半琥珀酸酯，置于经I型胶原包被的培养瓶中（75 cm2 培养瓶中加入18 mL培养基）。
- 当细胞生长至约80%融合度时，每2-3天更换一次培养瓶中的培养基。弃去旧培养基，加入不含酚红的消化液，于37 °C孵育直至细胞完全脱落。用含血清的DMEM/F12培养基中和消化液，随后以500 × g 离心细胞。弃去上清液，将细胞重悬于HOEM培养基中。
2. 使用共聚焦显微镜测定细胞大小
- 将原代角膜上皮细胞（pHCECs）和诱导性角膜上皮细胞（iHCECs）以 1 × 105 的密度接种于包被胶原的带有玻底盖玻片的培养皿中，每皿加入 1 mL HOEM 培养基。将 pHCECs 和 iHCECs 分别置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养，一组培养 24 小时，另一组培养 48 小时。
- ....
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结果
细胞大小
原代和永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）使用三种荧光染料进行观察，这些染料反映了细胞活性的三个不同阶段。活细胞呈绿色（钙黄绿素-AM），死细胞呈红色（乙啶同源二聚体-1），凋亡细胞呈黄色（膜联蛋白V，经计算机调整颜色以更好显示荧光信号）。活细胞的细胞质中含有酯酶，可将钙黄绿素-AM转化为钙黄绿素。死细胞的细胞膜对乙啶同源二聚体-1具有通透性。凋亡细胞的细胞膜上出现染色，这是因为磷脂酰丝氨酸被转运至细胞膜外层。
使用共聚焦显微镜对两种类型的人角膜内皮细胞（HCECs）在培养24小时和48小时后的细胞大小进行比较，结果如图1所示。在培养24小时后，iHCECs（图1A）为较小的细胞，大小范围为10 µm至20 µm，而pHCECs（图1B）的大小范围为20 µm至50 µm。在培养48小时后，iHCECs（图1C<.......
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讨论
评估了两种类型 HCEC 在使用上的潜在差异。将细胞置于相同的培养基（HOEM）中，在细胞浓度相同的情况下，分别暴露于短时间和长时间的紫外辐射以及三种眼毒性物质。紫外辐射和化学物质的剂量选择基于其生理效应，这些效应对细胞造成的损伤足以产生可比较的中间反应。5 分钟和 20 分钟的紫外辐射暴露时间，以及 0.001% BAK、0.0025% SDS 和 0.01% H2O2 三种物质分别作用 5 分钟和 15 分钟，是能够显示细胞与未处理对照组之间显著差异反应的理想暴露时间和浓度。
HOEM 是一种无血清培养基，专为 HCEC 的培养优化。HOEM 可支持原代细胞和永生化细胞的生长。本研究所用的永生化细胞系是通过 SV408 实现永生化的。SV40 永生化细胞表达可干扰 Rb、p53 和 pp2a17 的癌基因蛋白，从而促进细胞周期进程。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）可结合并抑制 E2F 转录因子；当 E2F 不被抑制时，细胞即可推进细胞周期并进行分.......
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披露
在过去三年中，作者Lyndon W. Jones通过CORE获得了以下公司的研究资助或讲座酬金：Alcon、Allergan、Allied Innovations、Aurinia Pharma、BHVI、CooperVision、GL Chemtec、i-Med Pharma、J&J Vision、Lubris、Menicon、Nature's Way、Novartis、Ophtecs、Ote Pharma、PS Therapy、Santen、Shire、SightGlass SightSage和Visioneering。Lyndon Jones还担任Alcon、CooperVision、J&J Vision、Novartis和Ophtecs的顾问和/或顾问委员会成员。其他作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者在本研究中未获得任何资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 75 cm2 透气培养瓶 | Corning | 354485 | 此为 BioCoat 品牌，胶原蛋白包被 |
| 96 孔板 | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin 染色缓冲液 | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| 配备 Zeiss 共聚焦激光扫描显微镜 510 系统的 Axiovert 100 显微镜 | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 孔板 | Corning | 354505 | 此为 BioCoat 品牌，胶原蛋白包被 |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | 可检测 280 - 700 nm 范围内的荧光（本实验使用 540/590 nm） |
| 胎牛血清 | Hycone | SH30396.03 | |
| 玻璃底盖玻片 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| 人角膜上皮细胞 | 渥太华大学 | N/A | 来自 M. Griffith 博士（加拿大渥太华眼科研究所，渥太华）的 SV40 永生化人角膜上皮细胞，已进行表征：Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. 利用细胞系构建功能性人角膜等效物. Science. 1999;286:2169-72. |
| 含以下添加剂的人眼上皮细胞培养基（HOEM）： | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro 基础培养基添加 6 mM L-谷氨酰胺、0.002% EpiFactor O（文章中的细胞培养基补充剂 O）、1.0 μM 肾上腺素、0.4% EpiFactor P（文章中的细胞培养基补充剂 P）、5 μg/mL 重组人胰岛素、5 μg/mL 去铁转铁蛋白和 100 ng/mL 氢化可的松半琥珀酸酯，置于胶原蛋白-1 包被的培养瓶中（BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA）。 |
| 活/死细胞染色试剂（钙黄绿素和溴化乙啶同型二聚体） | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 仪器 | Rockville, MD, USA | ||
| MSD 人促炎因子 Panel II (4-Plex) V-Plex 检测试剂盒 | Rockville, MD, USA | ||
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | 100 倍浓缩液，每 99 mL 培养基中加入 1 mL |
| 原代角膜上皮细胞 | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax 荧光多孔板读板仪 | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express（细胞解离溶液） | Fisher Scientific | 12605036 |
参考文献
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J.
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