本文中，我们描述了一种用于临床前研究的溶瘤单纯疱疹病毒的简单培养、纯化及滴定方法。
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摘要
摘要
溶瘤病毒（OVs），例如 的 溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）是癌症免疫治疗领域中一种快速发展的治疗策略。溶瘤病毒（OVs），包括oHSV，能够选择性地在癌细胞中复制并杀死癌细胞（同时保留健康/正常细胞），并诱导抗肿瘤免疫反应。由于这些独特性质，基于oHSV的治疗策略在临床前和临床研究中正被越来越多地用于癌症治疗，其中包括美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Talimogene laherparepvec（T-Vec）。在将任何溶瘤病毒（包括oHSV）用于实验研究之前，其生长、纯化和滴定是三项必不可少的实验室技术。本文介绍了一种在Vero细胞中扩增oHSV的简单、逐步的方法。随着oHSV的增殖，其在Vero细胞中引发细胞病变效应（CPE）。当90–100%的感染细胞出现CPE时，轻柔收集细胞，随后用苯并核酸酶和氯化镁（MgCl₂）处理2），过滤，并采用蔗糖梯度法进行纯化。纯化后，通过空斑形成单位（plaque-forming units，PFUs）测定具有感染性的oHSV数量。 "噬斑测定" 在Vero细胞中。本文所述方案可用于制备高滴度的oHSV病毒原液。 体外 细胞培养研究 体内 动物实验
引言
溶瘤病毒（OVs）是一种新兴且独特的癌症免疫疗法。OVs 可选择性地在肿瘤细胞内复制并裂解肿瘤细胞（同时保护正常/健康细胞）1 同时诱导抗肿瘤免疫反应2溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）是所有溶瘤病毒（OVs）中研究最为广泛的病毒之一。其在临床应用中进展最为领先，其中Talimogene laherparepvec（T-VEC）是首个且唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤病毒。3除了T-VEC外，许多其他基因工程改造的oHSV正在多种癌症类型中进行临床前和临床试验3,4,5,6,7,8目前先进的重组DNA生物技术进一步提高了构建编码治疗性转基因的新一代oHSV的可行性3,5一种高效的oHSV扩增、纯化及滴度测定体系，是在对任何（新开发的）oHSV进行测试之前的关键步骤 体外 和 体内 研究。本文描述了一种简单的oHSV增殖（在Vero细胞中）、纯化（通过蔗糖梯度法）和滴定（在Vero细胞中进行oHSV空斑实验）的逐步操作方法。图1可在任何生物安全二级（BSL2）实验室环境中轻松采用，以获得高质量的病毒原液用于临床前研究。
Vero 细胞系是一种非洲绿猴肾细胞系，是用于 oHSV 扩增最常用的细胞系9,10,11,12,13 由于Vero细胞的抗病毒干扰素信号通路存在缺陷14其他具有失活的干扰素基因刺激因子（STING）信号通路的细胞系也可用于oHSV增殖。12,13. 本方案采用Vero细胞用于oHSV的增殖 蚀斑试验。传代培养后，收集感染oHSV的细胞，裂解并进行纯化处理；首先用苯扎诺酶核酸酶处理裂解的细胞，以降解宿主细胞DNA，防止核酸-蛋白质聚集，并降低细胞裂解液的黏度。苯扎诺酶的充分激活通常需要Mg2+，1-2 mM MgCl2 在本方案中使用15经苯并核酸酶处理的细胞裂解液通过连续过滤进一步去除宿主细胞碎片，随后进行高速蔗糖梯度离心。使用黏稠的25%蔗糖溶液作为垫层有助于减缓病毒在蔗糖层中的迁移速率，使与宿主细胞相关的组分保留在上清液中，从而提高纯化效果并减少病毒在沉淀中的损失16纯化的oHSV随后在Vero细胞上进行滴定，并通过吉姆萨染色观察病毒蚀斑。17 或X-gal染色（用于编码LacZ的oHSV）18.
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方案
1) oHSV 增殖
注意：在使用oHSV之前，须确保获得机构生物安全委员会的批准。本研究是在已获批准的IBC方案编号18007下进行的。须保持BSL2级防护措施：所有与病毒接触过的移液管、枪头、试管及其他材料均需用漂白剂处理。在手离开BSL2级细胞培养操作台之前，须用70%异丙醇喷洒手套。每次操作病毒后，务必用肥皂水彻底清洗双手。
- 在第 -1 天，将低传代 Vero 细胞接种于 20 个 T-150 cm² 培养瓶中2 密度为 7-8 × 10 的培养瓶6 细胞/瓶中的常规Vero细胞培养基
注意：Vero 培养基通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活的胎牛血清（IFCS）制备而成。 - 第0天（细胞融合度为80–90%），将oHSV接种物加入Vero细胞中。
- 病毒接种物的制备
- 使用感染复数（MOI）为0.01（MOI可根据病毒的复制能力在0.01至0.1之间调整）进行病毒扩增。使用公式（1) 计算20个培养瓶所需的病毒量（mL）。
20 个培养瓶所需病毒量（mL）= 所需病毒量（pfu）/ 病毒储备液滴度（pfu/mL）1) - 使用含1% IFCS的高糖Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）配制病毒接种液（每T-150 cm²培养瓶7 mL）2 烧瓶，即每20个烧瓶约140 mL）。将所需量的oHSV加入140 mL高糖DPBS/1% IFCS溶液中，涡旋混匀1分钟，并将混合液置于一旁，准备加入Vero细胞。
- 使用感染复数（MOI）为0.01（MOI可根据病毒的复制能力在0.01至0.1之间调整）进行病毒扩增。使用公式（1) 计算20个培养瓶所需的病毒量（mL）。
- 洗涤 T-150 cm 培养瓶2 2个含高糖DPBS的培养瓶，每瓶加入1% IFCS（10 mL/次洗涤）。吸除DPBS/1% IFCS，每瓶加入7 mL病毒接种物/T-150 cm²2 烧瓶
- 轻轻摇动锥形瓶5分钟，使用锥形瓶摇床使接种物在Vero单层细胞上均匀分布，然后将锥形瓶置于37 °C培养箱中孵育1.5–2小时。确保培养箱内的架子处于水平状态。
- 移除接种物，加入含1% IFCS的DMEM（25 mL/瓶）。将培养瓶孵育2-4天。
- 病毒接种物的制备
- 每天检查培养瓶，观察是否出现90-100%的细胞病变效应（CPE）（参见 图2).
- 收获感染oHSV的Vero细胞。
- 从每个锥形瓶中收集培养上清液（约 20 mL），留约 5 mL 在瓶中，收集至 50 mL 圆锥形离心管或培养基容器中。
- 使用细胞刮轻轻刮取培养瓶底部的细胞。
注意：细胞应迅速从培养瓶上脱落。 - 向每个烧瓶中加入约 15 mL 培养上清液（步骤 1.4.1 中收集），使每瓶总体积约为 20 mL（即 20 个烧瓶共 400 mL），然后用 10 mL 无菌刻度吸管轻轻吹打烧瓶底部数次。
注意： 不 用力吹打。目标是保持所有细胞完整。 - 将细胞（连同培养基）收集到预冷的50 mL锥形离心管中，置于冰上（使用8个离心管分装从20个培养瓶中收获的400 mL细胞悬液）。
- 300 × g 离心细胞 g 4 °C下离心10分钟，吸除上清液。
- 向每个离心管中加入1.25 mL（50%）病毒缓冲液（VB）和1.25 mL（50%）培养上清液（于步骤1.4.1中收集），充分重悬每管沉淀。将来自八个50 mL离心管的重悬细胞转移至一个50 mL锥形离心管中。
注意：请参阅 VB 溶液的制备方法 表1使用培养基过滤除菌装置对 VB 溶液进行过滤除菌。每瓶 T-150 cm² 培养瓶使用 0.5 mL VB 溶液与 0.5 mL 上清液混合液2 用于重悬的烧瓶，例如，20 个烧瓶（20 mL），使用 10 mL VB 和 10 mL 培养上清液。 - 使用干冰/100%乙醇对重悬的细胞进行速冻，并于-80 °C保存。
2）oHSV 纯化
- 将细胞在干冰和100%乙醇中快速冷冻，随后在37 °C水浴中融化，再进行水浴超声处理1分钟，共重复3个冻融-超声循环，以确保细胞充分裂解，使病毒释放至 supernatant 中。
注意：使用40 kHz、120 V功率进行1分钟超声处理。若无调频型超声仪，可使用超声水浴仪。取50 μL样品用于第3节的滴定，有助于识别纯化过程中可能导致病毒损失的具体步骤。 - 用Benzonase核酸酶（175单位/mL）和2 mM MgCl2 （1 M储存液 = 2 µL/mL）处理细胞裂解物，涡旋混匀，在37 °C孵育30分钟。将管子置于冰上，并在4 °C下进行后续操作。
- 通过低速离心沉淀细胞碎片。
- 以300 g离心10分钟，收集上清液。
- 将上清液转移至新的50 mL锥形离心管中（将细胞沉淀用0.5 mL VB重悬，标记为pellet-1，4 °C保存，用于步骤2.3.5；见图1）。
- 将上清液（来自步骤2.3.2）再次以500 g离心10分钟。
- 将上清液转移至新的50 mL锥形离心管中（将细胞沉淀用0.5 mL VB重悬，标记为pellet-2，4 °C保存，用于步骤2.3.5；见图1）。
- 将重悬的pellet-1（来自2.3.2）和pellet-2（来自2.3.4）合并至新的1.7 mL离心管中，涡旋或水浴超声处理2次，然后以400 g离心10分钟。收集上清液，并与步骤2.3.4所得上清液合并（见图1）。
注意：使用40 kHz、120 V功率进行1分钟超声处理，以防止在步骤2.4的过滤前发生病毒聚集。取50 μL合并后的上清液用于第3节的滴定。
- 使用以下三步过滤法对合并后的上清液（约21 mL，即1.4.6中的20 mL、2.3.2中的0.5 mL和2.3.4中的0.5 mL）进行过滤。
- 使用10 mL注射器吸取21 mL上清液（每次5–7 mL，便于通过滤膜），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为TUBE 1）上的无菌5 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜滤器。
- 向步骤2.4.1中已清空的50 mL锥形离心管中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于TUBE 1上的同一5 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达22 mL）。进入步骤2.4.2。
- 从TUBE 1中吸取22 mL滤液（同2.4.1操作），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为TUBE 2）上的无菌0.8 μm混合纤维素酯（MCE）膜滤器。
- 向步骤2.4.2中已清空的TUBE 1中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于TUBE 2上的同一0.8 μm MCE滤器（使滤液体积总计达23 mL）。进入步骤2.4.3。
- 从TUBE 2中吸取23 mL滤液（同2.4.1操作），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为TUBE 3）上的无菌0.45 µm PVDF滤器。
- 向步骤2.4.3中已清空的TUBE 2中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于TUBE 3上的同一0.45 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达24 mL）。
注意：取50 μL滤液用于第3节的滴定。
- 向步骤2.4.3中已清空的TUBE 2中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于TUBE 3上的同一0.45 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达24 mL）。
- 使用10 mL注射器吸取21 mL上清液（每次5–7 mL，便于通过滤膜），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为TUBE 1）上的无菌5 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜滤器。
- 采用蔗糖梯度法进行高速离心
注意：本方案使用固定角转子F13-14x50cy。转子和离心机在进行以下步骤前必须预冷至4 °C。- 在新的50 mL锥形离心管中加入10 mL冰上预冷的、经无菌过滤的25%蔗糖溶液（将25 g蔗糖粉末溶于100 mL Hank's平衡盐溶液中制备）。
- 缓慢（3 mL/min）将24 mL病毒滤液（来自步骤2.4.3.1）加至蔗糖层上方，注意保持病毒滤液与蔗糖溶液分层清晰。
注意：最多可在10 mL蔗糖溶液上加入30 mL病毒层。 - 在4 °C下以22,620 g离心90分钟。
- 移除50 mL锥形离心管中的上清液和蔗糖层。
注意：病毒沉淀应呈乳白色。分别取50 μL上清液和50 μL蔗糖层样品用于第3节的滴定。
- 将沉淀重悬于10%甘油/PBS溶液中。
- 向50 mL锥形离心管中加入1 mL无菌10%甘油（用PBS稀释）以覆盖沉淀。
注意：重悬液体积可因沉淀大小而异（如0.8–1.2 mL）。体积越小，病毒浓度越高。 - 将50 mL锥形离心管置于冰上2–4小时。期间每15分钟进行一次30秒的超声或涡旋处理，以帮助沉淀脱离并重悬。
- 将重悬的沉淀（1 mL 10%甘油/PBS + 沉淀体积，总体积约1.3 mL）收集至2 mL微量离心管中。[可选：向同一50 mL锥形离心管中再加入0.3 mL 10%甘油/PBS，反复吹打以收集残留微量沉淀，合并至步骤2.6.3的重悬液中，使总体积达约1.6 mL。]
- 若步骤2.6.3中的悬液浑浊或不透明（因细胞碎片所致），以500 g离心10分钟，将上清液转移至新的2 mL微量离心管中，进入步骤2.6.4。
- 取50 μL样品用于第3节的oHSV滴定。将剩余溶液分装（每份250 μL）至带螺帽的无菌微量离心管中（密封良好以长期保存），快速冷冻后于-80 °C保存直至使用（待oHSV滴定值确定后即可用于实验研究）。
注意：所有接触病毒的材料在从生物安全柜中取出或丢弃前，必须经漂白或紫外线照射处理。
- 向50 mL锥形离心管中加入1 mL无菌10%甘油（用PBS稀释）以覆盖沉淀。
3. oHSV 滴定与空斑实验
- 种子 1.7-1.8 × 105 Vero 细胞/孔，接种于6孔细胞培养板中，使用Vero细胞培养基（含10% IFCS的DMEM；见步骤1.1）
注意：确保细胞均匀分布在孔内；不要摇晃培养板，以免导致细胞在孔中央聚集。为防止摇晃，应先用手缓慢地垂直轻摇培养板，再水平轻摇，然后轻轻将培养板放入培养箱中。 - 次日（当细胞达到70-80%汇合度时），吸除培养基，每孔加入1 mL含1% IFCS的高糖PBS。将培养板置于细胞培养超净台中，直至完成步骤3.3。
- 在5 mL聚丙烯管中用PBS/1% IFCS对病毒进行连续稀释（图3).
注意：使用步骤 2.6.4 中收集的 50 μL 等分试样进行连续稀释。在 1st 管（10-3 稀释），将2 μL病毒加入1998 μL PBS/1% IFCS中，涡旋混匀。在2nd 管（10-5 稀释），从1的10 μL中取出st 将管加入990 μL PBS/1% IFCS中，涡旋振荡。在3rd 管（10-6 稀释），从2中取100 μLnd 在900 μL PBS/1% IFCS中涡旋混匀，继续进行10倍系列稀释，直至10-9 稀释。详见 图3. - 吸弃 PBS/1% IFCS，每孔加入 0.7 mL 系列稀释的病毒液（起始浓度为 10-5 至 10-9) 至 Vero 细胞。
注意：切勿让细胞干燥。 - 在室温下将培养板置于摇床上轻轻摇动5分钟（以确保病毒接种物均匀分布）。
- 在37 °C下孵育平板1.5小时。
注意：在孵育期间，用含1% IFCS的DMEM配制人免疫球蛋白G（IgG）1:1000稀释液。对于6孔板，配制12.5 mL，以便在步骤3.7中每孔使用2 mL。根据人IgG不同批次的差异调整稀释比例。 - 移除孔中的病毒接种物，每孔加入2 mL含1% IFCS的DMEM培养基，其中添加0.1%人IgG（用于中和培养基中的oHSV，防止继发性空斑形成）。将培养板置于37 °C孵育3–4天。
注：通常在3天内形成清晰的噬菌斑。 - 固定与染色培养板
- 移除上清液，加入纯甲醇（1 mL/孔）固定细胞 5 分钟。移除甲醇，将培养板置于空气中自然晾干。
- 用去离子水将吉姆萨染液按1:5比例稀释，每孔加入1 mL稀释后的吉姆萨染液。室温孵育10–15分钟。
- 去除染色，用自来水冲洗，并让平板自然晾干。
- 使用解剖显微镜计数噬斑。
- oHSV 具有可选性 lacZ 表达
- 吸去上清液，用冰冷的0.2%戊二醛/2%多聚甲醛在室温下固定细胞5-10分钟。
- 移除固定液，用 PBS 洗涤细胞 3 次。
- 向细胞中加入X-gal溶液（每孔1 mL），并将培养板在37 °C孵育2小时。
注意：X-gal 染色液应在染色当天新鲜配制；长期储存可能导致颜色褪去。参见 X-gal 溶液的配制方法 表1. - 去除X-gal染色液，用自来水清洗平板1分钟。
- 用中性红溶液（1 mL/孔）室温避光复染 2 分钟。
注意：参见中性红溶液的配制方法 表1. - 用自来水冲洗平板1分钟；让平板自然晾干。
- 使用解剖显微镜计数蓝色噬斑图4).
- 使用公式计算滴度（2)
滴度（pfu/mL，空斑形成单位）= 空斑数 / 0.7 mL × 稀释倍数2)
注意：例如，如果在10⁻⁶稀释度下发现25个噬菌斑-9 稀释孔，滴度为 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL。此为第2.6.4步制备的等分试样中oHSV的最终滴度。
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结果
整个实验方案的简要概述见图1，该图展示了oHSV的增殖、纯化和滴定过程中所涉及的关键步骤。在HSV感染后4小时，即可在Vero细胞中观察到细胞病变效应（CPE）19。图2展示了oHSV感染后三个不同时间点Vero细胞中CPE的表现。随着时间推移，CPE程度逐渐增强。在本方案中，低感染复数（MOI）接种oHSV后通常在48小时内观察到90–100%的CPE（此为收获细胞进行纯化的最佳时机）。然而，具体时间可能长达4天，取决于步骤1.2中接种的oHSV MOI值和/或oHSV的复制能力。超过该时间段后，发生CPE的细胞可能发生裂解，导致病毒释放至培养上清中。因此，为获得高病毒滴度，关键在于在细胞仍保持完整时及时收获已发生CPE的细胞。另一个影响最终病毒滴度的重要因素是用于oHSV扩增的组织培养瓶的数量或规格。图3展示了为通过空斑实验测定滴度所需的对特定病毒原液（步骤2.6.4中获得）进行系列稀释（10-3<...
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讨论
该方案首先在低传代次数的 Vero 细胞中培养 oHSV。在接种病毒时，Vero 细胞单层的汇合度应约为 80%，因为过度生长的细胞可能形成紧密的纤维结构，从而降低 oHSV 进入 Vero 细胞的效率20。当观察到 90–100% 的细胞病变效应（CPE）时，移除培养上清液，收集细胞，重悬于 VB/上清液中（见步骤 1.4.6），迅速冷冻，并在 -80 °C 保存以备后续纯化。Blaho 及其同事采用了一种略有不同的感染 Vero 细胞收获与保存方法。例如，含有细胞和培养基（添加 1% 牛血清白蛋白以及含钾的 PBS）的培养瓶首先在 -80 °C 下至少保存 15 分钟，随后在室温下缓慢升温。然后收获细胞，与无菌脱脂乳混合，并在 -80 °C 下保存至纯化步骤20。在此情况下，无菌脱脂乳起到稳定剂的作用，已有研究表明，病毒原液储存在无菌脱脂乳/培养基中的滴度显著高于仅储存在培养基中的情况20。然而，在另一项研究中，对多种用于在 -80 °C 下保存几种疱疹病毒的稳定剂（包括无菌脱脂乳...
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披露
SDR 是与溶瘤性单纯疱疹病毒相关专利的共同发明人，这些专利由乔治城大学和麻省总医院拥有并管理，上述机构已从安进公司（Amgen）和 ActiVec 公司获得专利使用费，SDR 同时担任 EG 427 的科学咨询委员会成员。其他作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
Saha 实验室的研究工作部分得到了美国国防部（DOD，项目编号：W81XWH-20-1-0702）和阿比林 Dodge Jones 基金会的资助。Samuel D. Rabkin 和 Melissa R.M. Humphrey 部分得到了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R01 CA160762）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 离心管 | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL 聚丙烯离心管 | Falcon | 352097 | |
| 5 mL 聚丙烯管 | Falcon | 352063 | |
| 50 mL 聚丙烯离心管 | Falcon | 352098 | |
| 6 孔细胞培养板 | Falcon | 353046 | |
| 苯甲酸酶核酸酶 | Sigma | E8263-25KU | |
| 细胞刮刀 | Fisher Scientific | 179693 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’改良型伊格尔培养基 | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’磷酸盐缓冲液 | Corning | MT-21-031-CV | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH3007003 | |
| 吉姆萨染液 | Sigma | G3032 | |
| 戊二醛 | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 汉克平衡盐溶液（HBSS） | Corning | MT-21-021-CV | |
| 高糖 Dulbecco’磷酸盐缓冲液 | Sigma | D4031 | |
| 人免疫球蛋白 | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| 氯化镁 | Fisher Chemical | M33-500 | |
| 培养基除菌滤器，250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| 培养基除菌滤器，500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| 中性红溶液 | Sigma | N4638 | |
| 多聚甲醛 | Fisher scientific | 15710S | |
| 板式摇床 | Fisher | 88861043 | |
| 铁氰化钾 | Sigma | P8131 | |
| 亚铁氰化钾 | Sigma | P9387 | |
| 氯化钠 | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| 带螺帽的无菌微量离心管 | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| 注射器滤器，0.45 µm PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| 注射器滤器，0.8 µm MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| 注射器滤器，5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 培养瓶 | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| 超声波水浴器 | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
参考文献
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