肿瘤溶性单纯疱疹病毒的培养、纯化与滴定

摘要

本文中，我们描述了一种用于临床前研究的溶瘤单纯疱疹病毒的简单培养、纯化及滴定方法。

摘要

溶瘤病毒（OVs），例如 的 溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）是癌症免疫治疗领域中一种快速发展的治疗策略。溶瘤病毒（OVs），包括oHSV，能够选择性地在癌细胞中复制并杀死癌细胞（同时保留健康/正常细胞），并诱导抗肿瘤免疫反应。由于这些独特性质，基于oHSV的治疗策略在临床前和临床研究中正被越来越多地用于癌症治疗，其中包括美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Talimogene laherparepvec（T-Vec）。在将任何溶瘤病毒（包括oHSV）用于实验研究之前，其生长、纯化和滴定是三项必不可少的实验室技术。本文介绍了一种在Vero细胞中扩增oHSV的简单、逐步的方法。随着oHSV的增殖，其在Vero细胞中引发细胞病变效应（CPE）。当90–100%的感染细胞出现CPE时，轻柔收集细胞，随后用苯并核酸酶和氯化镁（MgCl₂）处理₂），过滤，并采用蔗糖梯度法进行纯化。纯化后，通过空斑形成单位（plaque-forming units，PFUs）测定具有感染性的oHSV数量。 "噬斑测定" 在Vero细胞中。本文所述方案可用于制备高滴度的oHSV病毒原液。 体外 细胞培养研究 体内 动物实验

引言

溶瘤病毒（OVs）是一种新兴且独特的癌症免疫疗法。OVs 可选择性地在肿瘤细胞内复制并裂解肿瘤细胞（同时保护正常/健康细胞）¹ 同时诱导抗肿瘤免疫反应²溶瘤性单纯疱疹病毒（oHSV）是所有溶瘤病毒（OVs）中研究最为广泛的病毒之一。其在临床应用中进展最为领先，其中Talimogene laherparepvec（T-VEC）是首个且唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗晚期黑色素瘤的溶瘤病毒。³除了T-VEC外，许多其他基因工程改造的oHSV正在多种癌症类型中进行临床前和临床试验^3,4,5,6,7,8目前先进的重组DNA生物技术进一步提高了构建编码治疗性转基因的新一代oHSV的可行性^3,5一种高效的oHSV扩增、纯化及滴度测定体系，是在对任何（新开发的）oHSV进行测试....

方案

1) oHSV 增殖

注意：在使用oHSV之前，须确保获得机构生物安全委员会的批准。本研究是在已获批准的IBC方案编号18007下进行的。须保持BSL2级防护措施：所有与病毒接触过的移液管、枪头、试管及其他材料均需用漂白剂处理。在手离开BSL2级细胞培养操作台之前，须用70%异丙醇喷洒手套。每次操作病毒后，务必用肥皂水彻底清洗双手。

1. 在第 -1 天，将低传代 Vero 细胞接种于 20 个 T-150 cm² 培养瓶中² 密度为 7-8 × 10 的培养瓶⁶ 细胞/瓶中的常规Vero细胞培养基
   注意：Vero 培养基通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活的胎牛血清（IFCS）制备而成。
2. 第0天（细胞融合度为80–90%），将oHSV接种物加入Vero细胞中。
   1. 病毒接种物的制备
      1. 使用感染复数（MOI）为0.01（MOI可根据病毒的复制能力在0.01至0.1之间调整）进行病毒扩增。使用公式（1) 计算20个培养瓶所需的病毒量（mL）。
         ​20 个培养瓶所需病毒量（mL）= 所需病毒量（pfu）/ 病毒储备液滴度（pfu/mL）1)
      2. 使用含1% IFCS的高糖Dul....

结果

整个实验方案的简要概述见图1，该图展示了oHSV的增殖、纯化和滴定过程中所涉及的关键步骤。在HSV感染后4小时，即可在Vero细胞中观察到细胞病变效应（CPE）¹⁹。图2展示了oHSV感染后三个不同时间点Vero细胞中CPE的表现。随着时间推移，CPE程度逐渐增强。在本方案中，低感染复数（MOI）接种oHSV后通常在48小时内观察到90–100%的CPE（此为收获细胞进行纯化的最佳时机）。然而，具体时间可能长达4天，取决于步骤1.2中接种的oHSV MOI值和/或oHSV的复制能力。超过该时间段后，发生CPE的细胞可能发生裂解，导致病毒释放至培养上清中。因此，为获得高病毒滴度，关键在于在细胞仍保持完整时及时收获已发生CPE的细胞。另一个影响最终病毒滴度的重要因素是用于oHSV扩增的组织培养瓶的数量或规格。图3展示了为通过空斑实验测定滴度所需的对特定病毒原液（步骤2.6.4中获得）进行系列稀释（10^-3<.......

讨论

该方案首先在低传代次数的 Vero 细胞中培养 oHSV。在接种病毒时，Vero 细胞单层的汇合度应约为 80%，因为过度生长的细胞可能形成紧密的纤维结构，从而降低 oHSV 进入 Vero 细胞的效率²⁰。当观察到 90–100% 的细胞病变效应（CPE）时，移除培养上清液，收集细胞，重悬于 VB/上清液中（见步骤 1.4.6），迅速冷冻，并在 -80 °C 保存以备后续纯化。Blaho 及其同事采用了一种略有不同的感染 Vero 细胞收获与保存方法。例如，含有细胞和培养基（添加 1% 牛血清白蛋白以及含钾的 PBS）的培养瓶首先在 -80 °C 下至少保存 15 分钟，随后在室温下缓慢升温。然后收获细胞，与无菌脱脂乳混合，并在 -80 °C 下保存至纯化步骤²⁰。在此情况下，无菌脱脂乳起到稳定剂的作用，已有研究表明，病毒原液储存在无菌脱脂乳/培养基中的滴度显著高于仅储存在培养基中的情况²⁰。然而，在另一项研究中，对多种用于在 -80 °C 下保存几种疱疹病毒的稳定剂（包括无菌脱脂乳.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 离心管	Sigma	CLS3620
15 mL 聚丙烯离心管	Falcon	352097
5 mL 聚丙烯管	Falcon	352063
50 mL 聚丙烯离心管	Falcon	352098
6 孔细胞培养板	Falcon	353046
苯甲酸酶核酸酶	Sigma	E8263-25KU
细胞刮刀	Fisher Scientific	179693
二甲基亚砜	Sigma	D2650-100ML
Dulbecco’改良型伊格尔培养基	Corning	MT-10-013-CV
Dulbecco’磷酸盐缓冲液	Corning	MT-21-031-CV
胎牛血清	Hyclone	SH3007003
吉姆萨染液	Sigma	G3032
戊二醛	Fisher Scientific	50-262-23
甘油	Sigma	G5516
汉克平衡盐溶液（HBSS）	Corning	MT-21-021-CV
高糖 Dulbecco’磷酸盐缓冲液	Sigma	D4031
人免疫球蛋白	Gamastan	NDC 13533-335-12
氯化镁	Fisher Chemical	M33-500
培养基除菌滤器，250 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25E
培养基除菌滤器，500 mL	Nalgene, Fisher Scientific	09-740-25C
中性红溶液	Sigma	N4638
多聚甲醛	Fisher scientific	15710S
板式摇床	Fisher	88861043
铁氰化钾	Sigma	P8131
亚铁氰化钾	Sigma	P9387
氯化钠	Fisher Chemical	S271-3
Sorvall ST 16R 离心机	ThermoFisher Scientific	75004381
Sorvall ST 21R 离心机	ThermoFisher Scientific	75002446
带螺帽的无菌微量离心管	Fisher Scientific	02-681-371
蔗糖	Fisher Scientific	BP220-1
注射器滤器，0.45 µm PVDF	MilliporeSigma	SLHV033RS
注射器滤器，0.8 µm MCE	MilliporeSigma	SLAA033SS
注射器滤器，5 µm PVDF	MilliporeSigma	SLSV025LS
T150 培养瓶	Falcon	355001
Tris-HCl	MP Biomedicals LLC	816116
超声波水浴器	Branson	CPX-952-116R
X-gal	Corning	46-101-RF