本文介绍了一种计算工具，可从二维荧光图像中对神经元树突分支的方向进行简单、直接的自动测量。
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本文内容
摘要
摘要
神经元树突树的结构在神经元整合突触输入过程中起着关键作用。因此，对树突形态进行表征对于深入理解神经元功能至关重要。然而，无论是孤立状态还是特别是在神经网络内部，树突树的复杂性尚未被完全阐明。我们开发了一种新的计算工具——SOA（分割与取向分析），该工具可从二维神经元培养的荧光图像中自动测量树突分支的取向。SOA 采用 Python 编写，通过图像分割将树突分支与背景分离，并建立每个分支空间方向的数据库。该数据库可用于计算多种形态学参数，例如神经网络中树突分支的方向分布以及树突分支平行生长的普遍程度。所获得的数据可用于检测树突在神经元活动以及生物和药理刺激下的结构变化。
引言
树突形态发生是神经科学的核心课题，因为树突树的结构影响神经元中突触整合的计算特性1,2,3。此外，树突分支的形态异常和改变与退行性疾病及神经发育障碍相关4,5,6。在树突分支更易于观察的神经元培养体系中，非姐妹树突分支之间的相互作用调控着分支上突触聚集的位置和范围，这种行为可能影响突触的共激活性和可塑性7,8,9。因此，利用二维（2D）神经元培养系统对树突树的形态参数进行表征，有助于理解单个神经元及神经元网络的树突形态发生及其功能。然而，这一任务具有挑战性，因为即使在"简化"的二维神经元培养体系中，树突分支仍会形成复杂的网状结构。
已开发出多种工具用于自动追踪和分析树突结构10,11,12,13。然而，这些工具大多针对三维神经元网络设计，用于二维网络时通常过于复杂。相比之下，较初级的形态学分析工具通常包含大量计算机辅助的人工操作，耗时较长且容易受到操作者主观偏差的影响14。现有的半自动工具，例如“ImageJ”15（美国国立卫生研究院提供的开源图像处理软件包，包含大量由社区开发的生物图像分析工具），在很大程度上减少了人工操作的工作量。然而，在图像处理过程中仍需一定程度的人工干预，且分割结果的质量可能不够理想。
本文介绍了SOA，一种简单的自动化工具，可对二维神经元网络中的树突分支进行直接分割和取向分析。SOA能够检测二维图像中多种线状结构，并表征其形态学特性。在此，我们利用SOA对培养条件下树突网络的二维荧光图像中的树突分支进行分割。该软件可准确识别树突分支，并成功测量平行度和空间分布等形态学参数。SOA可轻松适用于其他细胞类型的细胞突起分析，以及非生物网络的研究。
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方案
注意：以色列卫生部已批准在实验动物伦理使用协议 IL-218-01-21 下使用小鼠。SOA 仅兼容 Windows 10 和 Python 3.9。该软件以开源代码形式提供：https://github.com/inbar2748/DendriteProject。在此链接中还包含一个 README.DM 文件，其中提供了软件下载说明、软件官方网站链接，以及包含所有软件包所需版本信息的 requirements 文件。此外，该页面还提供了使用该软件进行分析的其他示例。
图1：用于分割和生长方向分析的SOA工作流程。 图示为树突网络荧光图像的处理步骤及数据分析流程。首先上传二维图像，进行分割（分为两个步骤：先将树突分支识别为线条，再合并相关线条），然后获取每条树突分支的空间信息。收集图像中所有树突分支的数据，最后通过数据分析获得所需的形态学参数。缩写：SOA = 分割与取向分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
1. 打开 SOA 应用程序。
- 打开网址：https://mega.nz/folder/bKZhmY4I#4WAaec4biiGt4_1lJlL4WA，找到 SOA.zip 压缩文件夹，通过双击下载该 ZIP 文件。
- 右键单击 SOA.zip，选择解压文件以解压文件夹。注意弹出的解压路径和选项窗口，其中目标地址文本框显示了已解压文件的路径。若要将文件解压到其他位置，可单击窗口右侧面板中的任一文件夹，将其设为目标文件夹。单击确定，将文件解压至该文件夹。
- 打开已解压的 SOA 文件夹，双击SOA.exe。等待黑色窗口打开后，应用程序将启动。
图 2：使用 SOA 图形用户界面（GUI）工作流程的示例。 左列：工作流程的 GUI 模块。中列：在工作流程中处理的树突网络图像（比例尺：20 µm）。右列：中列图像中红色矩形框选区域的放大图（比例尺：4 µm）。步骤 1：选择并上传图像。步骤 2：分割的第一阶段是检测代表已识别树突分支的线条。步骤 3：分割的第二阶段是基于邻近性的线段合并，以形成单个树突分支。所有步骤的参数设置均可调整。缩写：SOA = 分割与取向分析；GUI = 图形用户界面。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. 打开待分析的图像。
- 在 SOA Viewer Upload 菜单栏中 | 选择 Choose File | 从计算机文件中选择一个图像 | 单击该文件（仅限 .png、.jpg、.tif、.bmp 文件）| Open | 查看文件路径 | Next。
3. 分割优化
注意：在SOA Viewer Properties菜单栏中，更改所选参数的值以调整分割过程的设置。补充材料中提供了诸如Threshold等参数的详细说明。
- 在 边缘，通过选择调整显示的阈值 阈值 并输入一个数字。
注意：阈值越低，检测到的线条越多。阈值为0到255之间的数值，默认值设为0。 - 在 合并线条:
- 通过选择调整显示的最小合并距离 最小合并距离 并输入一个数字。
注意：该 最小合并距离 范围为0到30像素，默认值为20。 - 通过选择来调整显示的最小合并角度 最小合并角度 并输入一个数字。
注意：该 最小合并角度 从0到 30°默认值设置为10。
- 通过选择调整显示的最小合并距离 最小合并距离 并输入一个数字。
- 点击 创建预览分割图像.
注意：将根据更新后的数值显示分割结果的预览图像。此外，还将显示合并前的线条数量和合并后的线条数量。 - 更改参数以实现片段的最大识别。如果需要更改属性，请单击 关闭窗口 按钮并按照步骤 3.1-3.4 操作。
4. 创建输出文件。
- 点击确定以查看分割图像和分析图表。注意弹出的窗口，用于选择将要保存 .xlsx 文件的位置。
- 输入文件名 | 选择保存 | 等待包含数据的 .xlsx 文件创建并保存。
注意：除了 .xlsx 文件外，系统将自动显示以下文件：原始图像文件、线条识别图像、分割结果的最终图像，以及三个分析图表。
5. 导航工具栏
注意：所有图像窗口均包含一个导航工具栏，可用于浏览数据集。工具栏底部每个按钮的功能描述如下。
- 要前后切换之前定义的视图，请使用 前进 和 后退 按钮。
注意：主页、前进 和 后退 按钮的功能类似于网页浏览器中的 主页、前进 和 后退 控件。主页 可返回默认屏幕，即原始图像。 - 使用 缩放 按钮进行平移和缩放。要启用平移和缩放功能，请先点击 缩放 按钮，然后将鼠标移动到图像中的目标位置。
- 要平移图像，请按住鼠标左键并将其拖动到新位置。释放鼠标按钮后，图像中选定的点将显示在新位置。在平移过程中，按住 x 或 y 键可分别将移动限制在 x 或 y 轴方向。
- 要进行缩放，请按住鼠标右键并将其拖动到新位置。向右移动可在 x 轴方向放大，向左移动可在 x 轴方向缩小；对 y 轴方向则通过上下移动实现相同操作。缩放时请注意，鼠标指针下的点将保持固定，从而实现围绕该点的放大或缩小。使用修饰键 x、y 或 CONTROL 可分别将缩放限制在 x 轴、y 轴或保持纵横比不变。
- 要启用矩形区域缩放模式，请点击 缩放至矩形 按钮。将光标置于图像上，按下鼠标左键，然后在按住按键的同时拖动鼠标以定义一个矩形区域。
注意：当按下鼠标左键时，坐标轴的显示范围将缩放至所定义的区域；当按下鼠标右键时，坐标轴的显示范围将缩小，使原始坐标轴显示在所定义的区域内。 - 使用 子图配置 工具来设置子图的外观。
注意：子图的左侧、右侧、顶部和底部边缘，以及行与列之间的间距均可拉伸或压缩。 - 要打开文件保存对话框，请点击 保存 按钮，并将文件保存为以下格式之一：.png、.ps、.eps、.svg 或 .pdf。
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结果
对培养物中树突网络的图像进行了代表性分析。细胞提取方法如 Baranes et al.16,17 所述。简言之，从新生大鼠脑组织中分离海马神经元，并在二维玻璃盖玻片上培养 1–2 周。随后对培养物进行固定，并通过间接免疫荧光染色，使用针对树突蛋白标志物微管相关蛋白 2（microtubule-associated protein 2, MAP2）的抗体进行标记。利用荧光显微镜采集树突网络图像，并使用 SOA 对 10 张图像进行处理。
图1展示了一个典型的SOA工作流程，用于分析树突网络。输入为一幅二维荧光显微镜图像。图像分割分为两个阶段：第一阶段是将树突分支识别为线条，第二阶段是根据用户设定的距离和方向标准合并相关线条。分割完成后，收集每个已识别树突分支的空间信息。随后，从图像中所有树突分支的数据中提取以下信息：平行/非平行分类、平行与非平行树突分支的平均长度、平行树突分支之间的距离以及...
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讨论
为了跟上生物成像数据的快速增长，迫切需要有效的策略从二维图像中提取形态学信息。尽管成像数据可在数小时内生成，但对图像的深入分析却耗时较长。因此，图像处理已成为许多领域的显著瓶颈。这在一定程度上源于数据的高度复杂性，尤其是在处理生物样本时。此外，由于许多用户缺乏专业的编程和图像处理技能，亟需能够以简便、用户友好的方式实现自动化图像处理的工具。正因如此，SOA 预计将发挥重要作用。代表性结果展示了该工具的自动化分割功能，即使面对复杂的树突网络，也能通过几个简单的步骤识别图像中的树突分支。工作流程简单直观，可立即轻松获取多种空间信息。本研究采用多种算法来检测荧光图像中的单个树突分支，并对结果进行多项分析。有关这些算法的详细描述可参见补充材料以及系统需求信息。本文将简要介绍这些算法及其在软件中的作用。
分割
分割是本项目中最具挑战性的部分。在图像分割中，数字图像被划分为多个区域（图像对象）。分割的目的是识别图像中的目标，从而使其更易于理解和处理。在此，分割用于识别树突分支，并将其与背景分离。图像分割过程分为两个...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者谨此感谢 Orly Weiss 博士在培养图像制备方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Matplotlib | 2002 - 2012 John Hunter、Darren Dale、Eric Firing、Michael Droettboom 以及 Matplotlib 开发团队；2012 - 2021 Matplotlib 开发团队。 | 3.4.2 | 一个 Python 2D 绘图库 |
| matplotlib-scalebar | Philippe Pinard | 0.7.2 | 用于在 matplotlib 中显示比例尺的绘图组件 |
| NumPy | NumPy 社区。 | 1.20.3 | 科学计算库的基础包 |
| OpenCV | OpenCV 团队 | 4.5.2.54 | 开源计算机视觉库 |
| PyCharm | JetBrains | 2020.3.1（社区版）版本 | 构建号 #PC-203.6682.86，构建于 2020 年 12 月 18 日。运行时版本：11.0.9.1+11-b1145.37 amd64。虚拟机：JetBrains s.r.o. 提供的 OpenJDK 64 位服务器虚拟机。Windows 10 10.0。内存：978M，核心数：4 |
| PyQt5 | Riverbank Computing | 5.15.4 | 用于管理图形用户界面（GUI） |
| python | Python 软件基金会许可证 | 3.9 版本 | |
| Qt Designer | QT 公司有限公司 | 5.11.1 版本 | |
| scipy | 社区库项目 | 1.6.3 | 基于 Python 的开源数学、科学和工程软件生态系统 |
| Seaborn | Michael Waskom。 | 0.11.1 | Python 的统计数据分析可视化库。 |
| Windows 10 | Microsoft | ||
| Xlsxwriter | John McNamara | 1.4.3 | 用于创建 Excel XLSX 文件的 Python 模块 |
参考文献
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