本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。
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本文内容
摘要
摘要
通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体（polysome）分级是一种强大的技术，可用于构建核糖体图谱、鉴定由核糖体翻译的特定mRNA，并分析与多聚核糖体相关的因子。尽管该技术通常使用自动梯度生成装置和梯度分级系统，但这些设备通常价格昂贵，对于资源有限或因研究中仅偶尔需要执行该方法而难以承担其费用的实验室而言，可能不具备可行性。本文提供了一种利用大多数分子生物学实验室常见的标准设备、无需专用分级仪器即可重复生成多聚核糖体图谱的实验方案。此外，本文还比较了使用与不使用梯度分级系统所获得的多聚核糖体图谱。文中讨论了优化条件并获得可重复多聚核糖体图谱的策略。本方案以Saccharomyces cerevisiae作为模式生物，但该方法可轻松修改和适应，用于多种不同生物体和细胞类型的核糖体图谱分析。
引言
核糖体是执行将mRNA翻译为蛋白质这一基本过程的兆道尔顿级核糖核蛋白复合物。核糖体负责细胞内所有蛋白质的合成。真核生物核糖体由两个亚基组成，根据其沉降系数分别称为小核糖体亚基（40S）和大核糖体亚基（60S）。完全组装的核糖体称为80S单体核糖体。多聚核糖体（polysomes）是指参与翻译同一条mRNA分子的一组核糖体。通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体分级分离是一种强大的方法，可用于构建核糖体图谱，鉴定与正在翻译的核糖体相关联的特定mRNA，并分析与多聚核糖体相关的因子1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。该技术常用于将多聚核糖体与单个核糖体、核糖体亚基以及信使核糖核蛋白颗粒分离开来。通过分级分离获得的图谱可提供有关多聚核糖体翻译活性14以及核糖体组装状态15,16,17的重要信息。
核糖体组装是一个极为复杂的过程，由一组被称为核糖体组装因子的蛋白质协助完成18,19,20,21。这些因子在核糖体生物合成过程中通过与多种其他蛋白质相互作用，执行多种功能，这些蛋白质包括ATP酶、内切和外切核酸酶、GTP酶、RNA解旋酶以及RNA结合蛋白22。多核糖体分级分离技术一直是研究这些因子在核糖体组装中作用的有力工具。例如，该方法已被用于证明多核苷酸激酶Grc3（一种前体rRNA加工因子）的突变如何对核糖体组装过程产生负面影响17,23。多核糖体分析还揭示并证实了ATP酶Rix7内部保守基序在核糖体生成中的关键作用16。
多核糖体分级分离的实验步骤首先从制备目标细胞的可溶性细胞裂解液开始。裂解液中含有RNA、核糖体亚基、多核糖体以及其他可溶性细胞组分。在超速离心管中制备连续的线性蔗糖梯度。将细胞裂解液的可溶性组分小心地加样至蔗糖梯度管的顶部。随后对加样后的梯度管进行离心，利用重力作用使细胞组分根据其大小在蔗糖梯度中得以分离。较大的组分在梯度中迁移得更远，而较小的组分迁移距离较短。梯度上部含有较小且迁移较慢的细胞组分，而较大且迁移较快的细胞组分则位于梯度底部。离心结束后，将管内内容物按不同区段收集为多个组分。该方法可有效分离核糖体亚基、单核糖体（monosome）和多核糖体。随后通过测定254 nm波长处的光吸收值，确定每个组分的光密度。以吸光度为纵坐标、组分编号为横坐标作图，即可获得多核糖体图谱。
可以利用梯度混合器制备线性蔗糖密度梯度。离心后，通常使用自动化密度分级系统对梯度进行分级，并测定各组分的吸光度3,7,13,24,25。尽管这些系统在生成多核糖体图谱方面效果良好，但其价格昂贵，可能超出部分实验室的承受能力。本文介绍了一种无需使用此类仪器即可获得多核糖体图谱的实验方案。该方案仅需大多数分子生物学实验室常见的设备即可完成。
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方案
1. 7% - 47% 蔗糖梯度的制备
注意：可根据所用细胞类型调整蔗糖梯度的线性范围，以实现更好的分离效果。本方案已针对酿酒酵母（S. cerevisiae）的多聚核糖体图谱优化。
- 在蔗糖梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，60 mM KCl，10 mM MgCl2 和 1 mM DTT）中配制7%和47%的蔗糖储备液。使用0.22 μm滤器过滤除菌，并于4 °C保存。
- 按照表1中所述方法，通过分配并混合7%和47%蔗糖储备液，配制14 mL的17%、27%和37%蔗糖溶液。
- 将六个聚丙烯离心管（14 x 89 mm）放入全视窗试管架中。确保管间留有足够空间，以便操作单个试管时不会干扰其他试管。
- 将一根长针头连接至3 mL注射器上。本方案使用9英寸、22 G、钝头针头（图1），但任何能够触及离心管底部的足够长针头均可使用。
注意：在搭建梯度前，应先进行试填充和排液操作，确保注射器能容纳蔗糖溶液且无滴漏现象。 - 向每根离心管底部加入2 mL 7%蔗糖溶液。
- 将针头尖端置于离心管底部附近，缓慢而小心地加入2 mL 17%蔗糖溶液，使其位于7%溶液下方。
- 依次加入各2 mL的27%、37%和47%蔗糖溶液。确保每一层之间因密度差异形成清晰可见的分界线（图2）。
注意：若梯度在48小时内不使用，则在此步骤完成后、尚未形成连续梯度前，将含有分层蔗糖溶液的离心管在液氮中快速冷冻，并于-80 °C冰箱中长期保存。 - 将梯度于4 °C过夜静置，使蔗糖浓度逐渐连续递增。分层的蔗糖溶液需8–12小时方可形成线性蔗糖梯度。线性梯度在48小时内保持稳定。对于冷冻保存的分层蔗糖溶液，过夜4 °C储存可提供充分的解冻和线性梯度形成时间。使用密度计评估梯度质量。
注意：必须将梯度存放于稳定位置，避免任何移动或振动，否则会破坏梯度结构。
2. 酵母细胞提取物的制备
- 将目标酵母菌株接种于50 mL酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基中，在30 °C摇床培养箱中过夜培养至稳定期。
注意：温度可根据酵母菌株的需求进行调整。 - 将10 mL对数后期培养物转移至1 L新鲜YPD培养基中。在30 °C（或其他适宜温度）下剧烈振荡培养细胞，直至培养物达到对数中期（OD600 = 0.4-0.6).
- 在对数生长中期，向培养物中加入环己酰亚胺，使其终浓度为 0.1 mg/mL。冰上孵育 5 分钟。
- 通过离心在 3,000 x g 条件下收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。
注意：此时细胞可冷冻并储存在 -80 °C。 - 将细胞重悬于700 μL预冷的多聚核糖体提取缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，60 mM KCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT，1% Triton X-100，0.1 mg/mL环己酰亚胺，0.2 mg/mL肝素）中。加入100单位RNase抑制剂，转移至1.5 mL离心管中。
- 加入约 400 μL 预冷的玻璃珠（粒径范围 425–600 µm）至离心管中。使用珠磨机剧烈振荡 5 分钟以破碎酵母细胞。
- 8,000 x g 离心澄清裂解液 g 4 °C下离心5分钟。
- 通过分光光度计测量澄清裂解液在260 nm处的吸光度，或使用基于荧光的RNA检测系统，确定RNA的浓度。
注意：对于非常精确的RNA浓度测定，应使用基于荧光的RNA检测试剂盒。 - 确保RNA浓度为0.5–1 µg/μL。如果RNA浓度过低，在后续实验中可减少用于重悬细胞的多聚核糖体提取缓冲液体积。
注意：裂解并进行RNA定量后，应立即在梯度中上样裂解液。如有必要，可用液氮速冻裂解液，并于-80 °C保存数天。
3. 梯度离心
- 将裂解液小心地加至梯度液的上层。将移液器吸头紧贴聚丙烯管内壁顶部，轻轻倾斜离心管，缓慢沿管壁将裂解液滴加至梯度液表面。加样过程中务必注意不要破坏或扰动梯度液。
注意：所加裂解液的量因细胞类型而异，RNA 含量也有所不同。可能需要进行多次实验以确定生成最佳多聚核糖体图谱所需的裂解液用量。对于酵母，以 300 μg RNA 作为优化起始量较为合适。 - 将离心管轻轻放入已预冷的摆桶转子吊桶中。
注意：每个聚丙烯离心管中的梯度液体积和所加裂解液量应保持一致。不同管之间可能存在差异，需确保该差异不会在超速离心过程中导致不平衡错误。 - 在 4 °C 条件下，以 260,110 × g 离心 150 分钟。
4. 组分与数据收集
- 小心地从摆动桶转子中取出离心管，并将其放入试管架中。
- 标记用于储存组分的96孔板，并预先在冰上冷却。
注意：使用适用于分光光度计的96孔板，其光学窗口应可低至230 nm，以便在260 nm/280 nm处测定核酸。 - 从梯度顶部开始，通过将移液器吸头小心插入梯度顶部，收集100 µL或200 µL的组分。持续收集组分，直至整个梯度被分装完毕。组分数目取决于梯度总体积。
注意：收集组分时应避免扰动其余梯度部分。确保所有组分体积相等。除手动分部收集外，另一种低成本的分部收集方法是使用小型蠕动泵。 - 将每个组分转移至96孔板，直至离心管底部。始终将收集的组分置于冰上保存。
- 使用分光光度计在254 nm处测定每个组分的吸光度。以7%和47%蔗糖溶液作为空白对照。
注意：在测定组分吸光度时需注意，对于大多数分光光度计和比色计，最有效的吸光度范围为0.1–1.0。若吸光度超出该范围（≥1.0），说明组分中物质浓度过高。此时应稀释样品，重新测定数据，并在绘制图谱时计入稀释倍数。 - 通过绘制组分编号与吸光度的关系图，生成多聚核糖体图谱。
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结果
三个具有代表性的多聚核糖体图谱如图所示 图3所有图谱均来自同一种酵母菌株。典型的多聚核糖体图谱应能清晰分辨出40S、60S和80S核糖体亚基以及多聚核糖体的峰。每张图谱上均可明显观察到各核糖体亚基及多聚核糖体峰的峰顶图3）。自动化密度梯度分离系统的典型图谱如图所示 图3A. 用于生成此图谱的蔗糖梯度按照本方案中所述方法手工制备。此处所示图谱 图3A 通过进样溶液从底部向上推动蔗糖梯度，使其经过检测器流动池并被连续收集为不同组分，从而获得连续吸光度曲线。由于此类系统可连续测量吸光度，因此能够记录超过1,500个数据点，而手动获取同等数量的数据点则不切实际。手动绘制曲线时通常采用的组分体积为100–200 μL在此范围内的组分体积可产生足够详细的图谱，适用于大多数比较分析。从两者获得的代表性结果 100 μL 和 200 μL 组分分离结果如图所示 图3B
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讨论
本文介绍了一种无需使用昂贵的自动化分级分离系统的多聚核糖体谱型制备方法。该方法的优点在于使不具备自动化分级分离系统的实验室也能开展多聚核糖体分析。本方案的主要缺点是手工分级过程繁琐，且与专用的密度梯度分级系统相比灵敏度较低。
本方案涉及蔗糖梯度的精细制备，其分辨率足以分离核糖体亚基、单核糖体和多核糖体。制备蔗糖梯度时，关键在于加样过程中避免引入气泡。气泡会从底部上浮至顶部，破坏梯度的线性。此外，每次使用前应擦拭针头外表面，并用吸水材料吸去针腔内多余的蔗糖溶液，以确保每一梯度层的完整性。蔗糖梯度需在4 °C条件下于冷室中过夜保存。冰箱压缩机启停所产生的振动可能破坏梯度结构。
该实验的另一个关键因素是梯度的体积和RNA的浓度。14 mm × 89 mm的离心管可容纳12 mL的液体，但这已是这些试管所能承受的最大体积，通常认为此体积已超出推荐装载体积。一个较为合适的最大工作体积为11.5 mL，不会造成试管过载。蔗糖梯度本身的体积为10 mL；因此，用于重悬细胞的多聚核糖体提取缓冲液体积不应超过1.5 mL。获得良好图谱所需的RN...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Percy Tumbale 博士和 Melissa Wells 博士对本文稿的审阅。本工作由美国国立卫生研究院院内研究计划以及美国国家环境健康科学研究所（NIEHS；项目编号 ZIA ES103247，授予 R.E.S.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 自动分馏仪 | Brandel | ||
| Clariostar 多功能酶标仪 | BMG Labtech | ||
| 放线菌酮 | Sigma Aldrich | C7698 | |
| 二硫苏糖醇 | Invitrogen | 15508-013 | |
| 玻璃珠，酸洗 | Sigma Aldrich | G8772 | 425–600 μm |
| 肝素 | Sigma Aldrich | H4784 | |
| 氯化镁，1 M | KD Medical | CAC-5290 | |
| 针头，22 G，金属接头 | Hamilton Company | 7748-08 | 定制长度 9 英寸，3 型针尖 |
| Optima XL-100K 超速离心机 | Beckman Coulter | ||
| 聚丙烯离心管 | Beckman Coulter | 331372 | |
| 聚丙烯试管支架架 | Fisher Scientific | 14-810-54A | |
| 氯化钾 | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Qubit 4 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q33228 | |
| Qubit RNA HS 检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q32855 | |
| RNase 抑制剂 | Applied Biosystems | N8080119 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S0389 | |
| SW41 摆动桶转子套装 | Beckman Coulter | 331336 | |
| 注射器，3 mL | Coviden | 888151394 | |
| Tris，1 M， pH 7.4 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| UV-Star 微孔板，96 孔 | Greiner Bio-One | 655801 |
参考文献
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