无需梯度混合器或组分分离系统的多聚核糖体分析

摘要

本实验方案描述了如何在不使用自动梯度生成仪或梯度分段收集系统的情况下，制备多聚核糖体图谱。

摘要

通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体（polysome）分级是一种强大的技术，可用于构建核糖体图谱、鉴定由核糖体翻译的特定mRNA，并分析与多聚核糖体相关的因子。尽管该技术通常使用自动梯度生成装置和梯度分级系统，但这些设备通常价格昂贵，对于资源有限或因研究中仅偶尔需要执行该方法而难以承担其费用的实验室而言，可能不具备可行性。本文提供了一种利用大多数分子生物学实验室常见的标准设备、无需专用分级仪器即可重复生成多聚核糖体图谱的实验方案。此外，本文还比较了使用与不使用梯度分级系统所获得的多聚核糖体图谱。文中讨论了优化条件并获得可重复多聚核糖体图谱的策略。本方案以Saccharomyces cerevisiae作为模式生物，但该方法可轻松修改和适应，用于多种不同生物体和细胞类型的核糖体图谱分析。

引言

核糖体是执行将mRNA翻译为蛋白质这一基本过程的兆道尔顿级核糖核蛋白复合物。核糖体负责细胞内所有蛋白质的合成。真核生物核糖体由两个亚基组成，根据其沉降系数分别称为小核糖体亚基（40S）和大核糖体亚基（60S）。完全组装的核糖体称为80S单体核糖体。多聚核糖体（polysomes）是指参与翻译同一条mRNA分子的一组核糖体。通过蔗糖密度梯度离心进行多聚核糖体分级分离是一种强大的方法，可用于构建核糖体图谱，鉴定与正在翻译的核糖体相关联的特定mRNA，并分析与多聚核糖体相关的因子^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12}

方案

1. 7% - 47% 蔗糖梯度的制备

注意：可根据所用细胞类型调整蔗糖梯度的线性范围，以实现更好的分离效果。本方案已针对酿酒酵母（S. cerevisiae）的多聚核糖体图谱优化。

1. 在蔗糖梯度缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 7.4，60 mM KCl，10 mM MgCl₂ 和 1 mM DTT）中配制7%和47%的蔗糖储备液。使用0.22 μm滤器过滤除菌，并于4 °C保存。
2. 按照表1中所述方法，通过分配并混合7%和47%蔗糖储备液，配制14 mL的17%、27%和37%蔗糖溶液。
3. 将六个聚丙烯离心管（14 x 89 mm）放入全视窗试管架中。确保管间留有足够空间，以便操作单个试管时不会干扰其他试管。
4. 将一根长针头连接至3 mL注射器上。本方案使用9英寸、22 G、钝头针头（图1），但任何能够触及离心管底部的足够长针头均可使用。
   注意：在搭建梯度前，应先进行试填充和排液操作，确保注射器能容纳蔗糖溶液且无滴漏现象。
5. 向每根离心管底部加入2 mL 7%蔗糖溶液。
6. 将针头尖端置于离心管底部附近，缓慢而小心地加入2 mL 17%蔗糖溶液，使其位于7%溶液下方。
7. 依次加入各2 mL的....

结果

三个典型的多聚核糖体图谱如图3所示。所有图谱均来自同一种酵母菌株。典型的多聚核糖体图谱应能清晰分辨出40S、60S和80S核糖体亚基以及多聚核糖体的峰。每个核糖体亚基和多聚核糖体峰的峰顶在每张图谱上均清晰可见（图3）。图3A展示的是来自自动化密度梯度分离系统的代表性图谱。生成该图谱所用的蔗糖梯度是按照本实验方案中所述方法手工制备的。图3A所示图谱是通过连续吸光度扫描获得的：当蔗糖梯度在推动液的作用下自下而上流经检测器流通池时，连续记录吸光度并分部收集各组分。由于此类系统可连续测量吸光度，因此能够记录超过1,500个数据点。手动操作难以生成同等数量的数据点。手动分离通常采用的组分体积为100–200 μL。在此范围内选择组分体积可获得足够细节的图谱，适用于大多数比较分析。图3B和图3C.......

讨论

本文介绍了一种无需使用昂贵的自动化分级分离系统的多聚核糖体谱型制备方法。该方法的优点在于使不具备自动化分级分离系统的实验室也能开展多聚核糖体分析。本方案的主要缺点是手工分级过程繁琐，且与专用的密度梯度分级系统相比灵敏度较低。

本方案涉及蔗糖梯度的精细制备，其分辨率足以分离核糖体亚基、单核糖体和多核糖体。制备蔗糖梯度时，关键在于加样过程中避免引入气泡。气泡会从底部上浮至顶部，破坏梯度的线性。此外，每次使用前应擦拭针头外表面，并用吸水材料吸去针腔内多余的蔗糖溶液，以确保每一梯度层的完整性。蔗糖梯度需在4 °C条件下于冷室中过夜保存。冰箱压缩机启停所产生的振动可能破坏梯度结构。

该实验的另一个关键因素是梯度的体积和RNA的浓度。14 mm × 89 mm的离心管可容纳12 mL的液体，但这已是这些试管所能承受的最大体积，通常认为此体积已超出推荐装载体积。一个较为合适的最大工作体积为11.5 mL，不会造成试管过载。蔗糖梯度本身的体积为10 mL；因此，用于重悬细胞的多聚核糖体提取缓冲液体积不应超过1.5 mL。获得良好图谱所需的RN.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动分馏仪	Brandel
Clariostar 多功能酶标仪	BMG Labtech
放线菌酮	Sigma Aldrich	C7698
二硫苏糖醇	Invitrogen	15508-013
玻璃珠，酸洗	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
肝素	Sigma Aldrich	H4784
氯化镁，1 M	KD Medical	CAC-5290
针头，22 G，金属接头	Hamilton Company	7748-08	定制长度 9 英寸，3 型针尖
Optima XL-100K 超速离心机	Beckman Coulter
聚丙烯离心管	Beckman Coulter	331372
聚丙烯试管支架架	Fisher Scientific	14-810-54A
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 荧光计	Thermo Fisher Scientific	Q33228
Qubit RNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	Q32855
RNase 抑制剂	Applied Biosystems	N8080119
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389
SW41 摆动桶转子套装	Beckman Coulter	331336
注射器，3 mL	Coviden	888151394
Tris，1 M，  pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star 微孔板，96 孔	Greiner Bio-One	655801