利格宁和单宁的定量 ³¹P NMR 分析

最近发表在《自然议定书1》上的这一程序在档案文献中被引用了3 000多次，并已成为木质素和单宁特征的常规测量方法，因为它提供了必要、快速和可重复的结构信息。

利格宁和单宁
当保罗·阿纳斯塔斯和约翰·沃纳^2、3介绍绿色化学时，它彻底改变了化学的一般概念。特别是，以石油和煤炭等化石原料为起点，采用可持续材料代替化石原料的重要性，是^一个重要^方面。在不同种类的生物质中，木质素是最丰富的芳香生物聚合物，可视为工业商品和高附加值产品的潜在来源^。

木质素是第二富木成分（纤维素是第一，血糖是第三）。植物中其含量因植物类型而异:例如硬木的木质素含量低于软木（20%±4%，28%±4%）。此外，植物组织内的木质素分布不均匀:在细胞壁^5、6中可以发现较高的木质素含量。利格宁是一种多酚材料，工业获得作为纸/纤维素工业的副产品^7。它是从木材制浆过程中回收的，其中木屑主要在OH^和/或OH^- HS^- 1000条件的存在下加工，将纤维素与血糖和木质素（苏打和/或卡夫工艺^）8，9分离。

帕延和舒尔策分别于1838年和1865年¹⁰年首次尝试研究木质素。1977年，阿德勒总结了当时¹¹年的相关知识。目前已经确认木质素构建基块是三种苯基丙烷单位:p-库马里尔、针叶醇和西纳皮尔醇。这些单体，由于自由基聚合过程，产生p-羟基苯基，瓜亚基和西纳皮尔单位，最终大致构成木质素（图1）12。木质素缺乏初级结构意味着其结构特征具有内在的难度。因此，对分子量分布的评价一直存在一些争议。磨木木质素，在轻度条件下分离的木质素，大约大多是前列素^10，由寡聚物¹³组成，通过上铺聚合过程^14，15高度相互作用。

图1:一个具有代表性的软木木质素模型，其中不同类型的债券被突出显示。请点击这里查看这个数字的较大版本。

木质素通常根据:（a） 从中衍生的木材类型（例如硬木和软木）分类（b） 用于隔离木质的过程。最关键的工业木质素类型是卡夫，利格诺苏芬酸盐和有机体。

木质素的结构高度依赖于其来源和加工化学。更具体地说，当木质素的相当复杂和不规则的结构与它的自然多样性和复杂的加工化学复合时，一种极端多变性、多样性和异质性的材料就会出现，将其使用限制在低价值应用^16。虽然软木木质素主要含有瓜亚基单位 （G）， 其p- 羟基苯基组 （G 木质素） 数量可忽略不计， 但硬木木质素由瓜亚基和注射器亚单位 （GS 木质素） 以不同比例组成， 草木质素由瓜亚基、注射器和p- 羟基苯基 （GSH 木质素） 亚单位组成。用于隔离的提取方法极大地影响了新兴木质素¹⁷的结构。图2描绘了三种木质素结构，与采用的隔离方法不同。可以突出说明关于提取方法效果的一些考虑。首先，卡夫木质素是一种交易，高度分散，浓缩木质素，而奥戈索夫木质素有一个结构类似于磨木木木质素（使用比约克曼方法隔离）18，19，20。最后，木质素的特点是高度硫化，这取决于提取硫化过程的强度和条件。

图2:技术木质素的代表结构。在这个数字中，可以看到不同类型的木质素之间的差异。（A） 软木卡夫木质素高度浓缩，（B ） 木质素在饱和碳上具有硫化物组的特征，（C）有机木质素的结构类似于磨木质素。请单击此处查看此图的较大版本。

与木质素类似，单宁是植物中发现的多酚化合物。Das等人最近发布了关于单宁采掘方法和应用的最新^审查。单宁在日常生活中的重要性可以突出考虑两个例子:他们传授的味道和颜色的葡萄酒^22:此外，其多酚结构具有抗氧化特性，是制革行业^{应用的理想之选}。单宁分为两类:水解和非水解。水解单宁可被视为胆碱、二胆和藻酸酯聚合物（图3）。这些酯类是由于酚酸与糖分子（例如葡萄糖、黄酮和阿拉比诺斯）酯化的结果。

图3:典型的水解单宁:丹酸，维斯卡金。请点击这里查看此图的较大版本。

非水解单宁，也称为浓缩单宁，是来自弗拉万-3-ols的聚合物和寡聚物。在黄酮-3-ol中，儿茶素和胆黄酮最为常见。它们是无色结晶化合物（图4）。聚合产生以螺旋体结构为特征的聚合物。芳香羟基组定向在氦气的外部，而皮兰氧在内部。

图4:普兰托西亚尼丁结构: R =H， OH， OCH₃.请单击此处查看此图的较大版本。

使用 NMR 描述木质素和单宁
两种类型的信息在木质素或单宁特征中至关重要:（a） 化学结构（例如，羟基组含量、性质和团间联系频率）和 （b） 分子量和多分散性。自早期木质素研究以来，人们采用了不同的技术来实现这些目标，并出现了两类方法:化学和物理方法。

在木质素化学中，碱性硝基苯氧化、衍生化、还原、高锰酸盐氧化、硫酸化等化学方法在历史上已得到^{广泛应用。}然而，即使分析协议已经实施和优化，他们是时间要求，费力，并要求广泛的实验技能^30。或者，从工具分析开始，物理方法就被用来执行木质素和单宁特征^31。这些技术可以克服经典方法的问题，使木质素结构的特征变得容易。

核磁共振 （NMR） 允许在仪器技术中获取有关木质素结构和化学成分的信息。特别是，来自定量单维^1HNMR光谱和定量^13CNMR光谱的数据可以提供不同类型的木质素跨体粘结32，33，34，35的信息。不幸的是，单维光谱受到信号重叠的影响，这可能会严重破坏信号集成工作。HSQC（异核单量子相干）、Q-HSQC（定量-异核单量子相干）的定量版本已用于更好地了解木质素结构，提供有关内部联系的有用信息。但是，它们不能充分利用，以定量确定各个建筑单元13，36，37。

为了克服与单维和二维NMR相关的问题，考虑了基材衍生化。这种方法的优点之一是，特定标签可以在复杂的大分子中引入，并且没有光谱干扰的结果，从溶剂中标记的基板溶解^1。Verkade 是该领域的先驱，对磷衍生物、煤炭衍生物和相关化合物进行了³¹次 P NMR 分析^。在其出版物中，对不同含磷试剂（磷酸盐）进行了筛选，并记录了其他标记化合物的化学转移。阿吉罗普洛斯的研究小组于1991年首次引入了木质素中羟基组的定量和定性分析。在研究了使用含磷试剂的木质素模型化合物的衍生化后，他的小组为木质素化学中日常使用最多的技术之一^，31P NMR分析39，40，41，42，43铺平了道路。在所检查的不同磷酸盐中，阿吉罗普洛斯使用2-氯-4，4，5，5-四甲基-1，3-2-二恶磷（TMDP）作为最适合进行木质素分析^44。TMDP有选择地与羟基组发生反应，导致含磷衍生物的定量形成，其特征是特定^的31P NMR化学转移（图5）。

图5:褐宁和单宁磷化化学。 标记木质素和单宁阴唇H组是通过原位反应完成的。标记的多酚的特点是特定的 ³¹P NMR 波段对应于不同类型的羟基组。 请单击此处查看此图的较大版本。

样品衍生在苯丙胺/氯仿（1.6:1）混合物中进行:此选择来自准确的评估。皮里丁有两个优势。首先，选择一种溶剂，其特点是希尔德布兰德参数约22.1 MPa^1/2 简化和放大木质素溶解^45。因此，添加苯丙胺作为溶剂，其希尔德布兰德参数等于21.7，因此是最佳的。其次，TMDP与羟基组的反应伴随着盐酸（HCl）的形成，作为副产品，对木质素-磷烷衍生物的容易形成产生负面影响。因此，产生的 HCl 需要中和。当存在显著过剩时，与TMDP相比，苯丙胺的基本性允许HCl（通过盐酸丙氨酸的形成）中和。

使用推荐的苯丙胺/脱硫氯仿二元溶剂系统基于三个原因。首先，它赞成样品溶解。其次，由于盐酸二甲酸酯在氯仿中是可溶性的，因此可以防止降水和最终光谱的恶化。第三，选择去污氯仿作为其独特的单位信号，允许在采集过程中锁定 NMR 光谱仪。样品派生是在存在内部标准的情况下执行的。这样，当样品和标准被推导出来时，对样品峰值的积分和标准进行比较，可以量化每种类型的羟基组的量。各种化合物已被视为内部标准。这些化合物的特点是每个分子有一个羟基组，在推导后在^31PNMR光谱中提供单一的锐度信号。必须仔细选择标准。其信号不应与衍生样品的信号重叠。胆固醇在早期被广泛使用。但是，与由水合液组产生的信号的部分重叠限制了其使用。对于常规分析，首选 N-羟基-5-诺博宁-2，3-二甲基溴 （NHND） 的内部标准解决方案。但是，由于 NHND 不稳定性，其标准解决方案只能存储几天^46。

下图（图6）概述了对木质素和单宁进行 ^31PNMR分析的整个实验方案。

图6:木质素和单宁^的31PNMR分析程序。请点击这里查看这个数字的较大版本。

1. 样品预处理

1. 在 40 °C 的真空烤箱中，将分析液（褐宁或单宁样品）的异丙曲（约 100 毫克）干燥过夜。
   注意:由于温度高于 40 °C 可能会在化学上改变所检查的多酚的敏感结构，因此需要特别注意温度选择。
2. 干燥后，将样品迅速转移到无水的硫酸钙干燥器中，直到达到室温。此步骤是强制性的，以避免样品从环境中吸收湿度。

2. 溶剂溶液制备

1. 在 20 mL 样品瓶中，以 1.6/1 （v/v） 的比例混合无水的苯丙胺和脱水氯仿，准备一种苯丙胺/脱脂氯仿溶剂混合物。
   注意:在操纵苯丙胺和脱水氯仿时注意。这些化合物易燃、有害和有毒。使用适当的手套在通风良好的烟雾中准备和使用溶液。
2. 在3.2毫米颗粒中加入5-8克洗净和干燥激活的5A分子筛，以去除水痕迹。此外，强烈建议使用隔膜盖，以防止空气接触和溶剂系统的水分污染。将准备好的解决方案存放在黑暗中。

3. 内部标准解决方案 （IS） 制备

1. 在 2 mL Erlenmeyer 烧瓶中，在先前准备的溶剂溶液中准备 0.1 M 溶液，即铬 （III） 乙酰丙酮酸 （约 10 毫克） 和内部标准（约 35.8 毫克 NHND 或 77.3 毫克胆固醇）。
   注意:铬（III）乙酰丙酮酸盐是有害的:在操作过程中，戴上合适的手套。
2. 记录 IS 解决方案中添加的 IS 的确切重量。
3. 将 IS 溶液转移到装有密封盖的瓶中，内含激活分子筛（见点 2.2），并在 40 °C 下将其存储在黑暗中。

4. NMR 样品解决方案制备

1. 在配备搅拌棒的 2 mL 小瓶中准确称重 30 毫克样品。用隔膜帽密封小瓶。
2. 将溶剂系统溶剂溶液的 0.5 mL 添加到样品瓶中。
3. 通过微管在样品瓶中传输 100 μL 的 IS 溶液。磁性搅拌产生的分散（500 rpm），直到所有的木质素或单宁溶解，从而产生一个明确的解决方案。
   注:由于完整的样品溶解势在必行，因此此步骤可能需要长达 12 小时。
4. 将 0.1 mL 的 TMDP 传输到示例解决方案。将样品置于剧烈的磁搅拌下。密封样品溶液。佩戴适当的手套时，在通风良好的烟雾中使用 TMDP。
   警告:TMDP 及其蒸汽具有腐蚀性、有害性，并且与水快速相互作用。
   注:黄色沉淀物的形成是由于样品中的水痕迹或苯丙胺/氯仿溶液。在这种情况下，必须通过确保避免所有可能的水分污染来重复该程序。
5. 使用巴斯德移液器将样品溶液转移到 NMR 管中。

5. NMR 分析

1. 将管子加载到 NMR 仪器中。用于执行此分析的光谱仪需要宽带探头。
2. 根据表1 1中显示的设置修复实验^参数。

表1:记录衍生木质素或单宁的31P NMR光谱的实验参数。

3. 使用除臭氯仿的共振频率设置光谱仪频率，对样品进行闪亮，并调整光谱仪。然后，开始收购。

6. 频谱处理和分析

1. 根据以下步骤，通过适当的标准软件处理 ³¹P NMR 原始数据。
   1. 执行傅立更转换。
   2. 按手动相校正调整阶段（处理|相位更正|手动更正）。
   3. 手动更正基线，小心设置零点（处理|基线|多点基线校正）。
2. 信号校准。
   1. 将磷化水的信号设置为化学移位值 132.2 ppm（分析|参考|参考）。
      注:在 175 ppm 处出现尖锐的³¹P 信号是由于 TMDP 的过剩。它的存在确保了样品的完全派生。如果没有此峰值，则需要通过提供彻底的样品和溶剂干燥以及添加更多 TMDP 来重新审视整个过程。一旦这得到保证，光谱将放大到光谱范围132到150ppm左右（图7）。

图7:检查TMDP的超额存在:如果可以看到，样本的衍生是完整的。 然后可以分析光谱。在 155 到 132 ppm 之间放大光谱范围。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. 集成
   1. 通过将内部标准设置为 1.0（单击峰值|，使集成正常化 编辑集成|规范化: 1.00） 。根据下表中报告的化学变化执行频谱集成。使用 表 2 用于木质素， 将表 3 用于单宁。

表 ^2:31P NMR化学转移木质素磷酸化OH组。

表 ^3:31P NMR化学转移单宁磷酸盐OH组。

注:使用标准光谱处理软件，可以设置化学转移的预定义区域进行集成。当需要处理多个光谱时，此机会是有利的。

7. 功能组量化

1. 计算 IS 解决方案的浓度。
   
2. 计算特定信号的等量:
   
   

所述协议可用于木质素和单宁的分析。在木质素化学中，这种方法是根本的，因为它允许检测和量化不同类型的羟基组。 图 8A-D 显示了 31P NMR 木质素和单宁光谱的例子，这些光谱仪在不同频率下工作。 图 8A 中显示的频谱使用 300 MHz NMR 光谱仪进行记录，而 图 8D 则使用 700 MHz NMR 仪器记录。

图8:量31P NMR谱（A）软木牛皮纸（在30.8毫克木质素上用300MHz光谱仪记录的光谱），（B）软木木质硫化酸（30.1用300MHz光谱仪记录的光谱） 木质素在保存木质素到木质素酸后，（C） 金合欢单宁（在 30.3 毫克样品上用 300 MHz 光谱仪记录的光谱） 和 （D） 软木牛皮纸褐色素 （用 700 MHz 光谱仪记录的光谱）7.2毫克木质素）。请单击此处查看此图的较大版本。

这些光谱经过仔细记录和手动处理。水合物组（150-145 ppm）、芳香（145-137 ppm）和木毒（136-134ppm）的典型信号已得到很好的解决，因此很容易整合。如果光谱窗口打开（从 95 到 190 ppm， 图 8），则三个尖锐、强烈的峰值（175、144 和 132 ppm）是显而易见的。这些是由于TMDP、内部标准（胆固醇或NHND）和羟基化TMDP（由水痕迹引起）的过量。

与牛皮纸和有机木质素相比，木质素在硫化物/氯仿混合物中是不可溶性的。要获得可靠的 31P NMR 频谱，溶流是强制性的。为了克服这个问题，木质素可以在推导化之前转化为相应的脂质磺酸。用强酸（即硫酸）或酸交换树脂（例如，Dowex 1H，强酸酸酸交换器）处理脂质磺酸溶液，推动所有硫酸盐组以酸性形式转换。使用选择性吸附树脂（XAD-7，一种极地吸附剂，用于分离分子量高达 60，000 u.m.a）的化合物，可从酸性溶液中去除。 图8B 显示了TMDP衍生木质素酸的定量 31PNMR谱。即使在这种情况下，羟基组的不同信号也很明显。 图 8C 显示了使用 TMDP 衍生的单宁样品的典型定量 31P NMR 频谱。来自不同药理 OH （环 C）、皮罗加洛尔和 B 环中的音色单元和 A 环中的单元的特征信号清晰可见。

克劳迪娅·克雷斯蒂尼和迪米特里斯·阿吉罗普洛斯确保所有作者（C.C、N.P.和D.S.A.）没有利益冲突。