本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。
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摘要
摘要
成纤维细胞是表型高度动态的细胞，可在生化和生物力学刺激下迅速转分化为肌成纤维细胞。目前对包括心脏纤维化在内的纤维化过程的理解仍然有限，这阻碍了新型抗纤维化疗法的开发。可控且可靠的人源模型系统对于深入理解纤维化病理至关重要。本研究提供了一种高度可重复且可扩展的实验方案，可在48孔铸造板中构建工程化结缔组织（ECT），以促进在三维（3D）环境中对成纤维细胞及其纤维化组织病理生理学的研究。ECT在具有可调刚度的支柱周围形成，从而可在定义的生物力学负荷条件下进行研究。在特定的加载条件下，可研究由细胞-基质相互作用调控的表型适应性变化。采用48孔板格式可实现平行测试，并可对多个参数进行时间过程分析，例如组织压缩和对抗负荷的收缩能力。基于这些参数，可进一步研究组织刚度和弹性等生物力学特性。
引言
研究纤维化疾病的主要障碍之一是缺乏能够反映成纤维细胞及其病理衍生物行为的代表性人类三维组织模型。由于分离的成纤维细胞在非顺应性二维基质上培养时会迅速转分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的肌成纤维细胞，因此标准的二维培养系统在研究纤维化过程方面并不理想1,2,3。因此，标准二维培养中的成纤维细胞并不能代表正常的“健康”组织表型3,4,5,6。尽管已有研究采用可变形基质来模拟非纤维化（10 kPa）和纤维化（35 kPa）的组织环境7，但这些模型缺乏第三维度，而这一维度在病理生理学中极为重要。组织工程技术为克服这一局限提供了可能，它允许在明确且可实验调控的细胞外基质（ECM）环境中培养成纤维细胞，例如通过调节细胞密度、ECM成分和ECM浓度，这些因素均可决定组织的生物力学特性。
已利用成纤维细胞构建了多种三维模型。其中，悬浮圆盘和微球是最早开发的模型，可证明胶原会以时间依赖的方式被重塑并发生收缩。成纤维细胞会对胶原纤维施加牵引力，这一过程可通过添加促纤维化因子（如转化生长因子-β1（TGF-β1））加以促进8,9,10,11,12,13,14,15,16。然而，自由悬浮培养体系无法实现可控的外部加载，因此这类模型会持续收缩或致密化。片状工程化组织的出现使得研究组织生物力学特性的稳态调控成为可能，尤其是通过单轴、双轴、多轴或循环应变测试进行分析17,18,19,20。这些模型已被用于研究细胞数量对组织刚度的影响，结果表明组织刚度与细胞骨架完整性及肌动球蛋白细胞骨架的收缩性呈正相关18,19。但需注意的是，由于力传感器夹持点和锚定点周围组织变形不均匀，力-应变转换较为复杂。这一固有局限可通过狗骨形或环形组织模型加以克服，后者在锚定点处提供一定的组织增强作用21,22,23。环形组织可通过将细胞-胶原水凝胶分配至环形模具中制备而成。随着水凝胶的收缩，组织在模具不可压缩的内杆周围形成，从而对抗进一步的组织收缩24,25,26,27。在完成初始且通常为最大程度的收缩后，组织还可转移至可调节的间隔装置中，以在设定的组织长度下进一步限制环形工程化组织（ECT）的收缩3,24,25,26,27,28,29,30。生物物理特性可在标准的水平或垂直应变-应力装置中，使用适当的载荷传感器在单向或动态应变条件下进行评估3。由于此类组织具有高度均匀的环形结构，并可通过杆状或钩状结构（锚定点和/或力传感器）固定，尽管在加载杆周围仍可能存在压缩区域，但该构型相比夹持方式可实现更均匀的应变分布3。此外，锚定的组织可诱导细胞呈现双极形态，细胞会沿受力方向伸长，适应组织内的力学环境，从而促进各向异性的牵引力生成31,32,33,34,35,36。我们此前曾应用大鼠和人源心肌成纤维细胞（CF）围绕单一刚性柱体构建环形ECT，并在功能性的应力-应变实验中开展过表达和功能缺失研究，使用病毒转导的成纤维细胞24,25,26以及药理学干预手段37。此外，我们还在ECT模型中识别出CF介导的纤维化存在性别差异27。
以下方案以商品化供应商提供的冷冻保存的原代人食管上皮细胞（参见材料表）为例，用于生成人食管类上皮组织（ECT）。该方法结合了环形组织的优势，以及一种简便快速生成宏观组织的方法，适用于设计用于平行高通量检测的48孔板平台。
重要的是，ECT 模型并不局限于特定类型的成纤维细胞，已有文献报道其应用于其他成纤维细胞的研究，例如皮肤成纤维细胞38,39。此外，来自患者活检组织的成纤维细胞同样适用，具体选择何种成纤维细胞最终取决于拟解决的科学问题。
本方案中用于生成工程化心肌组织（ECT）的平台是一种 commercially available 的48孔三维细胞/组织培养板（图1A）。本文描述了利用该48孔板在定义的几何形状和机械负荷条件下，制备、培养以及监测ECT形成与功能的方法。所形成的ECT由集成的柔性支柱固定，通过使用不同硬度（邵氏A硬度值36–89）的支柱可依据最终用途精细调节机械负荷，从而影响其弯曲刚度。推荐使用邵氏A硬度值为46的支柱。此外，本方案还可与先前报道的一种定制圆形模具兼容，该模具通过单根刚性杆固定ECT37。该模具的尺寸见图1B。
图1：铸造模具的示意图。（A）带有两个柔性杆的铸造模具的技术图纸及尺寸。该模具由一段短壁限定的内周构成，短壁固定于模具主体上，并设有双层限位杆。柔性杆之间具有一定的自由水平间距，并在底部相连。该模具可容纳180 µL的浇铸体积。每个模具的培养孔至少可容纳600 µL的培养基。可使用不同材料组合来制造具有特定刚度的杆（例如TM5MED-TM9MED）。（B）带有单根刚性杆的环形模具的技术图纸及尺寸。这是一种具有不同几何结构和力学环境的替代模具，可用于ECT浇铸方案37。环形模具的组装方法借鉴自已发表的较大尺寸格式28,41。简而言之，该方法包括：（1）将聚四氟乙烯（PTFE）模具垫片（直径8 mm）压印到倒入玻璃培养皿（直径60 mm）中的聚二甲基硅氧烷（PDMS，硅胶）中；（2）在形成的中空腔内同心固定一个PDMS杆支架（直径1.5 mm），用于（3）固定可拆卸杆（直径4 mm的硅胶管）。由此形成的中空空间可容纳180 µL的浇铸体积。每个玻璃培养皿可容纳多个压印模具（图中示例为5个模具），最多可容纳5 mL培养基。请点击此处查看该图的放大版本。
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方案
所有步骤必须在生物安全二级柜中进行，且实验室的防护等级为一级。根据当地法规和所执行操作的类型（例如病毒介导的基因转移），防护等级必须提升至生物安全二级或三级。所有细胞培养物均置于细胞培养箱中，在37 °C、含5 % CO2的加湿空气环境中维持培养。请注意，步骤1和步骤2中提供的体积适用于T75细胞培养瓶。应根据标准细胞培养建议，针对不同的培养规格调整相应体积。
1. 原代心肌成纤维细胞（CF）的解冻与预铺板以进行单层培养（5-12天）
注意：作为替代方案，可按照供应商建议的标准传代培养方案使用 HFF-1 细胞。
- 根据制造商说明书配制成纤维细胞生长培养基（FGM）。可选择性添加抗生素，如 100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。使用前确保所有组分充分混匀。4 °C 条件下保存，最多可保存 14 天。
- 将 FGM 升温至 20–25 °C。
- 在 37 °C 水浴中解冻冻存的 CF（理想情况下每支冻存管含有 1 × 106 至 2 × 106/mL 细胞），约 2 分钟，直至冻存管中仅剩少量冰晶。
- 使用 2 mL 血清移液管，将细胞悬液逐滴转移至含有 10 mL FGM 的无菌离心管中。为最大程度回收细胞，用 1 mL FGM 冲洗冻存管，并将冲洗液转移至离心管。由于此时细胞非常敏感，应使用带宽口吸头的血清移液管重悬细胞，以尽量减少剪切应力对细胞造成的损伤。
注意：若冻存液中含有较高浓度的 DMSO，请确保细胞在 FGM 中重悬后，DMSO 终浓度低于 1%。或者，将重悬后的细胞在 20–25 °C 条件下以 300 × g 离心 5 分钟进行换液。随后小心吸除上清液，轻轻旋转离心管使沉淀的细胞松散，再用所需体积的 FGM 重悬细胞用于接种。 - 将 0.5 × 106 个细胞接种于 12 mL FGM 中，加入 T75 细胞培养瓶。若使用其他实验器皿，应调整接种细胞数量，以维持 6.7 × 103/cm2 的接种密度。
- 每两天更换一次 FGM，持续 5 天，或直至细胞达到 80% 汇合度。
注意：扩增后的细胞产量主要取决于细胞大小和增殖速率，不同供体来源的细胞可能存在差异。通常情况下，按照此标准培养程序，在培养 5 天后，可从一个 T75 细胞培养瓶中获得 4 × 106 至 5 × 106 个 CF 细胞。
2. 人囊性纤维化组织的酶解分散（10-20 分钟）
注意：此步骤旨在为原代人食管成纤维细胞（CF）建立单细胞悬液，用于单层细胞传代培养以及食管类器官（ECT）的制备。本方案已针对第3至第4代的人CF单层培养物进行了优化。为了实现最佳标准化，建议在制备ECT前至少进行一次单层CF的传代培养。本方案需根据来自不同供体或供应商的成纤维细胞进行相应优化。替代的细胞解离方案可包括使用含有蛋白水解酶和胶原酶的试剂，替代基于重组丝氨酸蛋白酶的解离试剂。
- 将FGM、PBS（无Ca2+/Mg2+）和细胞解离试剂预热至20-25 °C。
- 吸除培养细胞的培养基。
- 用6 mL PBS洗涤细胞，然后吸除。
- 向细胞中加入6 mL细胞解离试剂，在20-25 °C孵育3分钟，直至细胞明显开始脱落。
注意：根据CF来源不同，可能需要更长时间。若室温下细胞不脱落，可改在37 °C孵育以提高酶活性。为确保最佳细胞活力，应在显微镜下监测细胞脱落情况。 - 向含有解离细胞的细胞解离试剂中加入6-12 mL FGM以中和酶活性。使用10 mL移液管轻柔吹打4-8次，确保形成单细胞悬液，并将细胞转移至新的50 mL收集管中。根据制造商说明书，借助显微镜、血细胞计数板或自动细胞计数仪验证细胞得率。
- 在20-25 °C条件下，以300 x g离心细胞悬液5分钟。
注意：为获得足够数量的细胞用于制备所需量的ECT，可将细胞以最高1:6的比例传代扩增。让细胞生长至约80%汇合度（约5-6天），每隔一天更换一次培养基。然后重复酶解分散操作，并继续进行步骤2.7，以开展后续ECT制备。 - 吸除上清液，轻弹管壁使沉淀松动。在20-25 °C下用FGM重悬细胞，制备浓度≥15 x 106/mL的细胞悬液（约为步骤3.3所需细胞数的1.4倍），以补偿下一步过滤过程中可能造成的细胞损失。
- 通过40 µm孔径的细胞滤网过滤细胞悬液。
警告：细胞聚集体不利于ECT的最佳形成。当采用人源CF的酶解分散方案直接浇铸ECT时，过滤细胞悬液可确保无明显细胞团块，避免干扰组织的均匀形成。不均一会影响应力-应变分析的可靠性。 - 重新计数细胞数量并评估细胞活力，确保细胞悬液中细胞数量可靠且活力≥80%，方可进行ECT制备。
- 使用自动细胞计数仪通过电流排斥法测定细胞数量和活力。
- 或者，使用台盼蓝染料排除法（致癌物，危险类别2——需采取预防措施），在显微镜下结合血细胞计数板直接识别和计数活细胞（细胞膜完整，排斥染料）与死细胞（细胞膜受损，染料可结合胞内蛋白）。
- 将装有细胞悬液的收集管置于20-25 °C环境中，并立即进入步骤3。
3. 电休克治疗准备（1 小时）
注意：ECT 生成的示意图概述见图 2。
图2：ECT生成的示意图概述。 成纤维细胞在用于ECT生成前，先在二维培养体系中扩增。培养5-10天后，用酶法将细胞分散，再将细胞悬液重悬于含有牛I型胶原蛋白的缓冲混合液中。将细胞-胶原蛋白水凝胶混合物移入48孔板的各个孔中，用于三维工程化组织培养；该培养板设计为带有两个柔性支柱的浇铸模具，可使ECT在特定长度和负荷下悬吊培养。ECT通常在测量前培养1至20天。请点击此处查看该图的放大版本。
- 在37 °C下，通过将DMEM粉末溶解于ddH2O中（按材料表中指定的配方，浓度为134 mg/mL），并在持续旋转条件下孵育1小时，制备10倍浓缩的DMEM储备液。经滤膜除菌。该储备液在4 °C下可稳定保存最多14天，或在-20 °C下最多保存12个月。
- 通过将10倍浓缩DMEM储备液用无菌ddH2O稀释，并加入20%（v/v）胎牛血清（FCS），新鲜配制2倍浓缩DMEM培养基。可选择性添加抗生素，如200 U/mL青霉素和200 mg/mL链霉素。移液体积请参考表1。该溶液在4 °C下可稳定保存最多14天。
注意：在开始进行细胞酶解分散（步骤2）以制备ECT之前，请先完成步骤3.1和3.2。
| 试剂 | 终浓度 | 体积 (mL) |
| 10× DMEM | n/a | 2 |
| FCS | 20 % (v/v) | 2 |
| 青霉素 | 200 U/mL | 0.2 |
| 链霉素 | 200 mg/mL | 0.2 |
| ddH2O | n/a | 5.6 |
| 总计 | n/a | 10 |
表1：2x DMEM的成分。
注意：在使用前，所有用于细胞-胶原蛋白水凝胶混合物的组分以及离心管必须保持在冰上。这有助于防止在将细胞-胶原蛋白水凝胶混合物分配至铸造模具之前发生胶原蛋白的自发组装。
- 根据 表2，将细胞悬液调整至密度为 8.88 x 106 通过向步骤2.10的细胞悬液中加入FGM，于20–25 °C条件下调节细胞密度至cells/mL。随后将含有细胞悬液的收集管置于冰上。
- 为制备ECT水凝胶混合物，先将50 mL离心管置于冰上预冷，然后依次加入下表所列的不同组分 表 2 按以下顺序操作，避免产生气泡。
注意：制备的表皮等效组织（ECT）最大数量取决于步骤2.9中确定的总细胞数。每份ECT使用0.3 mg胶原蛋白，该胶原蛋白来源于浓度为6–7 mg/mL的储存液。胶原蛋白储存液的浓度决定了获得最佳ECT胶原含量所需的体积。其他ECT水凝胶组分的体积也必须相应调整。参见 表2 根据6.49 mg/mL的胶原蛋白储备液调整相应体积。文中所述体积指 表2 本方案中将其作为示例性指导使用。- 使用带有宽口吸头的血清移液管移取酸溶性I型胶原蛋白水凝胶。
- 通过轻轻旋转混匀试管，同时加入2倍浓度的DMEM来调节胶原溶液的盐含量。
- 通过轻轻旋动试管并加入 0.2 M NaOH 调节 pH 至中性。酚红指示剂颜色将由黄色变为红色。
注意：每次使用的胶原蛋白批次均需单独滴定 NaOH 体积，以实现最佳 pH 中和。中和过程受缓冲液类型与配制方式、胶原蛋白绝对浓度等因素影响，并会影响胶原基质的组装及细胞活力23,40. 一旦通过添加DMEM增加离子含量并中和pH值，胶原蛋白将随之发生自组装，此过程不得中断。因此，后续操作须迅速且连续完成。 - 将细胞悬液（来自步骤 3.3）逐滴加入，同时轻轻旋动试管以混匀。
| ECT 编号： | 1 | 6 | 24 | 48 | |
| 包含 10% 富余量 | |||||
| 细胞-胶原蛋白水凝胶组分： | (µL) | (µL) | (µL) | (µL) | |
| 胶原蛋白储备液（6.49 mg/mL） | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 2× DMEM | 46.2 | 305.1 | 1220.2 | 2440.4 | |
| 0.2 M NaOH | 3.1 | 20.5 | 81.8 | 163.7 | |
| FGM 中的细胞混合液（8.88×106 个细胞/mL） | 84.5 | 557.4 | 2229.7 | 4459.5 | |
| 总体积 (µL) | 180.0 | 1188.0 | 4752.0 | 9504.0 | |
| 本表示例说明如何为每个 ECT 准备 180 µL 的浇铸体积，每个 ECT 含有总计 750,000 个细胞和 0.3 mg 胶原蛋白。 | |||||
表2：ECT水凝胶的制备（包含10%的过量，以弥补移液误差）。
- 使用带宽口吸头的血清移液管，轻柔地上下吹吸混悬液仅一次，以避免气泡产生并尽量减少剪切应力。通过轻轻旋转离心管10次确保充分混合，并在整个浇铸过程中将装有ECT水凝胶混合物的50 mL离心管置于冰上。
- 用ECT水凝胶混合物预润湿1 mL移液器吸头，然后将180 µL混合物均匀分配至48孔浇铸板的每个模具中，避免施加过大的剪切力，以免影响胶原基质组装的完整性，并确保整个板在15–20分钟内完成操作。
注意：推荐的浇铸体积为180 µL，但可扩展至200 µL38。因此，如需要，可将表2中的体积调整为200 µL，同时保持细胞与胶原之间的浓度和比例不变。- 确保模具内形成完整的环状结构（图3A）。若ECT水凝胶混合物施加不连续，则将无法形成完整的ECT环状结构（图3B）。
- 避免将液体移入内孔（图3C），并在移液过程中避免气泡形成（图3D），以确保组织均匀且功能完整地形成。
图3：多孔板格式中的浇铸、水凝胶形成及ECT收缩过程。 上图显示浇铸后立即观察到的ECT外观。中图显示在37 °C孵育20分钟后ECT的外观。下图显示制备24小时后从电极取出的ECT收缩状态。（A）在最初24小时内，两个电极之间正常ECT形成的示例。（B-D）移液操作错误导致ECT无法正常形成的示例。白色和黑色箭头指示因浇铸不当引起的ECT结构缺陷。比例尺：5 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 将48孔制备板小心放入细胞培养孵箱中，让ECT水凝胶混合物重组15–30分钟。孵育后，混合物将呈现凝胶状且不透明（图3，中间图）。
- 每孔加入600 µL 37 °C预热的FGM，注意不要将培养基直接吹打到正在形成的ECT上，以免造成组织破坏。应沿孔壁轻轻加入培养基，此时ECT仍不可从孔底脱离（图4）。
图 4：向新制备的工程化细胞组织（ECT）中正确与不正确的培养基添加方式。（A）在ECT初步凝固后（浇铸后20分钟）添加培养基时，应保持正在收缩的ECT在孔底部不受扰动。在接下来的24小时内，由细胞驱动的基质收缩将使ECT沿斜坡向上滑动。最终ECT的位置由特定高度的凹形腔体控制；这确保所有ECT均稳定在相同位置，从而可在平行培养的ECT之间比较支柱弯曲活性。（B）若添加培养基过快，正在形成的ECT会从底部脱离。漂浮的ECT将在培养基上层发生收缩，导致ECT稳定在不同位置，此时支柱收缩力将无法直接比较。比例尺：2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 孵育 24 小时。
- 此后每天更换培养基，每次加入 500 µL FGM，直至进行分析。
注意：在细胞非依赖性凝胶化初始阶段之后，人源 CF 细胞将开始进一步压缩 ECT 水凝胶混合物。24 小时内，ECT 应明显收缩，并抬升至柔性支柱所固定的位置（图 3 和 图 4A）。
4. 通过测量横截面积（CSA）评估 ECT 收缩程度（每个 ECT 需 5 分钟）。
注意：组织收缩在胶原蛋白组装完成后立即开始，尤其在最初几小时内表现显著。收缩主要指细胞驱动的基质压缩所引发的变化，其方向垂直于组织的长轴。该参数通过测定工程化心肌组织（ECT）的横截面积（CSA）来评估。
- 在预定的时间点，使用体视显微镜记录工程化心肌组织（ECT）的顶视图和侧视图宏观图像（图5C）。
注意：可在48孔成型板的培养孔内直接对ECT进行成像。或者，可将ECT转移至透明底多孔板中进行成像。建议保留ECT两端的电极引线进行成像，因为移除引线会导致预负荷丧失，进而使组织在短时间内因张力释放而进一步收缩并可能发生扭转，从而影响尺寸分析所需的准确成像。 - 使用图像处理软件进行线扫描分析。设定标尺，并使用直线工具在每个成像平面中每条臂上至少6个位置处描记并测量ECT的直径（图5B、C）。
- 计算顶视图和侧视图平面测得的平均直径，并根据椭圆面积公式计算横截面积（CSA）：
图5：通过横截面积（CSA）分析监测ECT随时间的致密化过程。采用人源CF细胞与I型胶原蛋白生成ECT，并在两个柔性支柱周围培养5天。(A) 展示了置于柔性模具中的对照组ECT在5天时间内的代表性图像。比例尺 = 5 mm。此类明场图像也可用于确定支柱偏转程度的变化，以估算组织收缩情况。(B) ECT横截面积的示意图（顶视图直径以绿色表示，侧视图直径以粉色表示）。(C) 使用体视显微镜获取的ECT顶视图与侧视图宏观图像，以及使用图像处理软件对组织直径进行线扫描分析的对应示例。比例尺 = 2 mm。平均直径由每个视图平面上测得的所有线段长度的均值计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 通过极点偏转分析监测 ECT 收缩（每块 48 孔浇铸板 15 分钟）。
注意：ECT 培养通常进行 5 天，但可进一步延长至至少 20 天。由于细胞收缩力驱动组织沿其长轴方向产生张力，导致组织收缩，从而引起支点偏转。可在培养期间的任意一天通过成像评估 ECT 收缩情况。
- 使用配备高分辨率（≥ 500 万像素）黑白图像传感器、固定距离安装的集成面扫描相机的记录设备，对 48 孔制备板进行成像。
- 使用近紫外光（~390 nm）光源以最大化对比度，从而便于自动检测含有荧光染料的电极尖端（图 6A，C）。如条件允许，建议使用远心镜头进行成像，因其可最小化图像畸变。
注意：也可使用单个孔或整块板的宏观明场图像并附带比例尺进行分析（图 5A）。
- 使用近紫外光（~390 nm）光源以最大化对比度，从而便于自动检测含有荧光染料的电极尖端（图 6A，C）。如条件允许，建议使用远心镜头进行成像，因其可最小化图像畸变。
- 利用图像处理程序，或通过在能够检测暗背景下高对比度亮像素的软件中运行所记录图像，从每日记录中测量电极之间的距离（图 6C，D）。
- 通过比较各时间点电极间距与第 0 天初始间距的变化，计算电极的偏转程度。
图6：根据支柱偏转评估组织收缩的示意图。（A）在近紫外光激发下，48孔成胶板中荧光支柱的代表性高分辨率记录图像。相比明场图像，该方法更适用于对支柱尖端进行精确的自动追踪。（B）示意图展示了ECT致密化和收缩如何导致支柱弯曲。（C）同一块板中某一行在成胶后第0天和第5天的记录图像。D。放大图展示了如何使用图像处理程序测量支柱之间的距离（粉线）。请点击此处查看该图的放大版本。
注意：由于成像平面的差异，通过亮端图像测量的杆偏转仅能作为组织收缩的估计值。此外，需注意在组织培养过程中添加促纤维化物质（如 TGF-β1）会增强 ECT 的致密化和收缩，最终可能导致组织过早破裂。
6. 通过破坏性拉伸测量和应力-应变分析评估 ECT 的刚度及其他生物力学特性（每个 ECT 20 分钟）
注意：一条理想的应力-应变曲线可呈现三个区域：足趾区、弹性区和塑性区。图7展示了体外培养组织（ECT）应力-应变曲线的一个示例。对应力-应变曲线的分析可用于提取组织的重要生物力学参数，例如刚度、最大强度、弹性、塑性、延展性、回弹性以及韧性。
- 使用镊子将支架连同工程化心外膜组织（ECT）一起从其培养孔中取出，从而收获ECT。然后用手握住支架底部，用细钩或移液器吸头将ECT滑过支架尖端。
- 将ECT转移至安装在动态机械分析仪（DMA）上的两个钩子之间，该仪器配备有37 °C恒温器官浴（定制），浴内充满PBS，并分别固定在固定臂和传感器臂上（图7A）。
图7：ECT破坏性拉伸测量分析。（A）在拉伸动态力学分析（DMA）流变仪上进行的流变学破坏性拉伸测量。上方高倍视图：ECT安装于环境舱中初始长度L0处，并连接上下夹具以进行应力-应变分析。下方高倍视图：ECT以0.03 mm/s的恒定速率拉伸，直至达到极限应变时的断裂点。比例尺 = 5 mm。（B）ECT的应力-应变图，显示主要测量参数。弹性区的上限对应屈服点，塑性区介于屈服点与断裂点之间（延展性）。弹性区线性阶段的斜率对应反映组织刚度的杨氏模量。最大强度对应组织所能承受的最大拉伸应力。由于纤维微断裂，应力逐渐下降，直至组织达到断裂点。此时发生在极限应变（可延展性）处，因组织破裂而出现应力的突然下降。回弹性表示组织在发生永久变形前（至屈服点）所吸收的能量（kJ/m3），由曲线下面积（AUC）至屈服点应变处计算得出。韧性表示组织在破裂前可吸收的总能量（kJ/m3），由曲线下面积（AUC）至极限应变处计算得出。请点击此处查看该图的放大版本。
- 将流变仪设置为以大约每秒初始挂钩间距的1%的恒定线性速率进行单轴拉伸。使用典型的工程化角膜组织（ECT）尺寸时，可采用0.03 mm/s的恒定拉伸速率。对传感器进行归零，启动拉伸并持续记录至ECT断裂为止。
警告：必须在拉伸测试前记录ECT的宏观图像（步骤4.1），因为数据归一化需要横截面积（CSA）。
注释：应力-应变分析（包括CSA计算）可在拉伸测试完成后进行。使用电子表格软件和统计分析软件处理数据。 - 将测得的力值（mN）按ECT的横截面积（CSA，单位为mm2）进行归一化，以获得应力值（kPa）。
- 在XY图上绘制应力值相对于应变的曲线（应变为组织形变的几何度量，由上下挂钩之间的相对距离决定）。
注释：拉伸开始前组织的初始长度（上下挂钩之间的距离），即L0，必须手动调整，并对应于 toe 区域的起点（根据组织特性，toe 区域可能不存在）。每个应变点的值应根据以下公式计算，其中Ltotal为每个测量点的总间距：
绘图时，使用选定L0处的应力值进行背景扣除。 - 从应力-应变曲线中确定不同的生物力学参数（以图7B为例）。
注释：应力-应变曲线可能呈现三个区域：toe 区域、弹性区域和塑性区域。在组织开始出现微裂之前，弹性区域的上限对应于屈服点，其应变值反映组织的弹性。塑性区域介于屈服点与失效点之间。后者对应于因组织断裂导致的应力突然下降，定义为极限应变，是衡量组织延展性的指标。第三个测量点对应于最大强度，定义为组织在拉伸过程中不破裂所能承受的最大应力。恢复能（resilience）和韧性（toughness）分别由曲线下面积表示，对应组织在达到屈服点和失效点前所吸收的能量。对于每条获得的曲线，弹性区域线性部分的斜率即为杨氏模量（Young's modulus），也称为弹性模量，是衡量组织刚度的力学参数。- 从每条曲线中提取屈服点、失效点和最大应力点的XY值（分别为应变和应力）。
- 通过绘制弹性区域线性部分的线性回归，根据其斜率评估每个ECT的杨氏模量（刚度，单位为kPa = mN·mm-2）。
- 使用统计软件计算曲线下面积（AUC），以分别确定恢复能和韧性（至屈服点和失效点）。采用梯形法计算AUC。将基线设为零，并仅考虑高于基线且至少为Y轴最小值到最大值距离10%的峰。
注释：恢复能和韧性的模量由σ × ε给出，其中σ为应力（kPa），ε为应变（L/ΔL，mm/mm）。因此，恢复能和韧性分别为组织在发生永久形变前和断裂前吸收的能量，单位为kJ/m3（kPa = kN·m-2 = kN·m·m-3 = kJ/m·m·m-3 = kJ/m3）。
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结果
在最初的24小时内，ECT的致密化程度可达初始细胞-胶原蛋白水凝胶体积的约95%。在对照条件以及含FCS条件下，组织的致密化和收缩通常在成模后数小时开始，并显著持续增加至第5天（图5A）。支柱偏转程度在随后的15天内可能进一步增加（最长测试时间为20天）。支柱偏转的幅度取决于细胞类型、细胞状态以及细胞和组织培养条件。通常在培养第5天测量生物力学特性，但也可选择其他时间点。作为ECT模型适用性的一个示例，本文展示了该方案如何有助于研究肌动蛋白细胞骨架完整性对组织功能的影响。ECT在48孔成模板中制备，并用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A（Lat-A，7 ng/mL）处理。处理后ECT的致密化程度降低，表现为与对照组相比，横截面积（CSA）显著增加1.7倍（图8A，B）。此外，在5天培养期间评估了组织的收缩情况。在无药物处理时，组织收缩逐渐增加至第5天，达到约40%的收缩率。而Lat-A处理影响了组织收缩，最大收缩率仅为约20%（图8A...
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讨论
本方案描述了从原代人冠状纤维细胞（CF）生成ECT的方法，可用于研究这些细胞对其细胞外基质环境的力学影响，反之亦然。
成纤维细胞需要扩增以获得足够的细胞数量用于计划的ECT实验（0.75 × 106 细胞/ECT)。为了获得最佳的可重复性，建议在每次传代时，将冻存或组织来源的成纤维细胞在二维单层培养中预培养至标准化时长，达到约80%融合度后再用于ECT的制备（实验方案步骤3）。用于培养原代人CF单层细胞时 特别建议对衍生的 ECT 使用适用于 CF 的商用培养基和补充剂（参见 材料表）。在标准的二维培养中，培养基中添加血清对于确保成纤维细胞（CF）的扩增至关重要。在三维培养（包括工程化角膜组织（ECT）的构建及后续培养）中，是否采用无血清或低血清条件，可根据所选成纤维细胞类型而定。然而，在利用成纤维细胞进行ECT构建时，建议至少在浇铸水凝胶中添加血清，以确保组织初始收缩的正常进行。
该操作步骤的一个局限性在于，为生成工程化心肌组织（ECT）而需在二维培养条件下扩...
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披露
GLS 和 SL 起草了手稿。所有作者均参与了实验方案的制定并对手稿进行了修改。TM、MT 和 WHZ 是 myriamed GmbH 的科学顾问。WHZ 是 myriamed GmbH 的创始人及股东。
致谢
本工作由德国心脏病学会（DGK 研究奖学金，授予 GLS）和德国研究基金会（DFG，通过项目 IRTG 1816 支持 GLS 和 AD；项目编号 DFG 417880571 和 DFG TI 956/1-1 支持 MT；SFB 1002 TP C04 支持 MT 和 WHZ；SFB 1002 TP S01 支持 WHZ；EXC 2067/1-390729940J 支持 WHZ）资助。WHZ 还获得德国联邦教研部（BMBF，通过项目 IndiHEART）和 Leducq 基金会（20CVD04）的支持。MT、WHZ 和 SL 获得德国心血管研究中心（DZHK）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养试剂： | |||
| Accutase 溶液 | Merk Millipore | SCR005 | |
| 解离试剂 – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）粉末 | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS），pH 7.2，无 Ca²⁺，无 Mg²⁺ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM 成纤维细胞生长基础培养基 | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 SingleQuots， 补充剂与生长因子 | Lonza | CC-4126 | |
| 成纤维细胞生长培养基 3 套件 | PromoCell | C-23130 | |
| 成纤维细胞基础培养基 3 | PromoCell | C-23230 | |
| 生长培养基 3 补充剂套装 | PromoCell | C-39350 | |
| 青霉素（10000 U/mL）/ 链霉素（10000 μL/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 氢氧化钠溶液（NaOH）1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| 细胞来源： | |||
| 来自心室的正常人源心脏成纤维细胞（NHCF-V） | Lonza | CC-2904 | |
| 人源心脏成纤维细胞（HCF-c） | PromoCell | C-12375 | |
| 人源心脏成纤维细胞（HCF-p） | PromoCell | C-12377 | |
| 原代人源包皮成纤维细胞-1（HFF-1） | ATCC | SCRC- 1041 | |
| 胶原来源： | |||
| I 型胶原（牛源），溶于 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| I 型胶原（大鼠尾源），溶于 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| 药物： | |||
| Latrunculin-A（Lat-A） | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| 塑料器皿： | |||
| 细胞培养用塑料器皿 | Sarstedt 和 Starlab | ||
| 尼龙网细胞滤筛（孔径 40 μm） | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| 宽口无菌移液管（10 mL） | Corning | 07-200-619 | |
| 专用仪器： | |||
| 适用于 1/2″ 探测器的双远心 CORE 镜头 | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| 面阵扫描相机 Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
参考文献
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (16), 7540-7545 (2011).
- Elson, E. L., Genin, G. M. Tissue constructs: platforms for basic research and drug discovery. Interface Focus. 6 (1), 20150095(2016).
- Cho, N., Razipour, S. E., McCain, M. L. TGF-beta1 dominates extracellular matrix rigidity for inducing differentiation of human cardiac fibroblasts to myofibroblasts. Experimental Biology and Medicine. 243 (7), Maywood. 601-612 (2018).
- Cucoranu, I., et al. NAD(P)H oxidase 4 mediates transforming growth factor-beta1-induced differentiation of cardiac fibroblasts into myofibroblasts. Circulation Research. 97 (9), 900-907 (2005).
- Peng, H., Carretero, O. A., Peterson, E. L., Rhaleb, N. E. Ac-SDKP inhibits transforming growth factor-beta1-induced differentiation of human cardiac fibroblasts into myofibroblasts. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), 1357-1364 (2010).
- Ribeiro, A. J., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Tranquillo, R. T., Durrani, M. A., Moon, A. G. Tissue engineering science: consequences of cell traction force. Cytotechnology. 10 (3), 225-250 (1992).
- Barocas, V. H., Moon, A. G., Tranquillo, R. T. The fibroblast-populated collagen microsphere assay of cell traction force--Part 2: Measurement of the cell traction parameter. Journal of Biomechanical Engineering. 117 (2), 161-170 (1995).
- Lijnen, P., Petrov, V., Rumilla, K., Fagard, R. Stimulation of collagen gel contraction by angiotensin II and III in cardiac fibroblasts. Journal of the Renin-Angiotensin-Aldosterone System. 3 (3), 160-166 (2002).
- Baxter, S. C., Morales, M. O., Goldsmith, E. C. Adaptive changes in cardiac fibroblast morphology and collagen organization as a result of mechanical environment. Cell Biochemistry and Biophysics. 51 (1), 33-44 (2008).
- Zhou, Y., et al. Inhibition of mechanosensitive signaling in myofibroblasts ameliorates experimental pulmonary fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1096-1108 (2013).
- Lijnen, P., Petrov, V., Fagard, R. In vitro assay of collagen gel contraction by cardiac fibroblasts in serum-free conditions. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 23 (7), 377-382 (2001).
- Burgess, M. L., et al. Integrin-mediated collagen gel contraction by cardiac fibroblasts. Effects of angiotensin II. Circulation Research. 74 (2), 291-298 (1994).
- Nunohiro, T., Ashizawa, N., Graf, K., Hsueh, W. A., Yano, K. Angiotensin II promotes integrin-mediated collagen gel contraction by adult rat cardiac fibroblasts. Japanese Heart Journal. 40 (4), 461-469 (1999).
- Ngu, J. M., et al. Human cardiac fibroblast extracellular matrix remodeling: Dual effects of tissue inhibitor of metalloproteinase-2. Cardiovascular Pathology. 23 (6), 335-343 (2014).
- Knezevic, V., Sim, A. J., Borg, T. K., Holmes, J. W. Isotonic biaxial loading of fibroblast-populated collagen gels: a versatile, low-cost system for the study of mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 1 (1), 59-67 (2002).
- Delvoye, P., Wiliquet, P., Leveque, J. L., Nusgens, B. V., Lapiere, C. M. Measurement of mechanical forces generated by skin fibroblasts embedded in a three-dimensional collagen gel. Journal of Investigative Dermatology. 97 (5), 898-902 (1991).
- Kolodney, M. S., Elson, E. L. Correlation of myosin light chain phosphorylation with isometric contraction of fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 268 (32), 23850-23855 (1993).
- Bell, B. J., Nauman, E., Voytik-Harbin, S. L. Multiscale strain analysis of tissue equivalents using a custom-designed biaxial testing device. Biophysical Journal. 102 (6), 1303-1312 (2012).
- Wakatsuki, T., Kolodney, M. S., Zahalak, G. I., Elson, E. L. Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue. Biophysical Journal. 79 (5), 2353-2368 (2000).
- Thomopoulos, S., et al. Fibrocartilage tissue engineering: The role of the stress environment on cell morphology and matrix expression. Tissue Engineering Part A. 17 (7-8), 1039-1053 (2011).
- Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. Journal of Biomechanical Engineering. 124 (2), 214-222 (2002).
- Ongherth, A., et al. p63RhoGEF regulates auto- and paracrine signaling in cardiac fibroblasts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 88, 39-54 (2015).
- Vettel, C., et al. PDE2-mediated cAMP hydrolysis accelerates cardiac fibroblast to myofibroblast conversion and is antagonized by exogenous activation of cGMP signaling pathways. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 306 (8), 1246-1252 (2014).
- Jatho, A., et al. RhoA Ambivalently Controls Prominent Myofibroblast Characteritics by Involving Distinct Signaling Routes. PLoS One. 10 (10), 0137519(2015).
- Dworatzek, E., et al. Sex-specific regulation of collagen I and III expression by 17beta-Estradiol in cardiac fibroblasts: role of estrogen receptors. Cardiovascular Research. 115 (2), 315-327 (2019).
- Tiburcy, M., Meyer, T., Soong, P. L., Zimmermann, W. H. Collagen-based engineered heart muscle. Methods in Molecular Biology. 1181, 167-176 (2014).
- Schlick, S. F., et al. Agonistic and antagonistic roles of fibroblasts and cardiomyocytes on viscoelastic stiffening of engineered human myocardium. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 51-60 (2019).
- Wille, J. J., Elson, E. L., Okamoto, R. J. Cellular and matrix mechanics of bioartificial tissues during continuous cyclic stretch. Annals of Biomedical Engineering. 34 (11), 1678-1690 (2006).
- Berry, C. C., Shelton, J. C., Bader, D. L., Lee, D. A. Influence of external uniaxial cyclic strain on oriented fibroblast-seeded collagen gels. Tissue Engineering. 9 (4), 613-624 (2003).
- Stopak, D., Harris, A. K. Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction. I. Tissue culture observations. Developmental Biology. 90 (2), 383-398 (1982).
- Bellows, C. G., Melcher, A. H., Aubin, J. E. Association between tension and orientation of periodontal ligament fibroblasts and exogenous collagen fibres in collagen gels in vitro. Journal of Cell Science. 58 (1), 125-138 (1982).
- Tranquillo, R. T. Self-organization of tissue-equivalents: the nature and role of contact guidance. Biochemical Society Symposia. 65, 27-42 (1999).
- Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance. Journal of Biomechanical Engineering. 119 (2), 137-145 (1997).
- Yip, A. K., et al. Anisotropic traction stresses and focal adhesion polarization mediates topography-induced cell elongation. Biomaterials. 181, 103-112 (2018).
- Santos, G. L., Hartmann, S., Zimmermann, W. H., Ridley, A., Lutz, S. Inhibition of Rho-associated kinases suppresses cardiac myofibroblast function in engineered connective and heart muscle tissues. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 134, 13-28 (2019).
- Kittana, N., et al. Modulating the biomechanical properties of engineered connective tissues by chitosan-coated multiwall carbon nanotubes. International Journal of Nanomedicine. 16, 989-1000 (2021).
- Kittana, N., et al. Enhancement of wound healing by single-wall/multi-wall carbon nanotubes complexed with chitosan. International Journal of Nanomedicine. 13, 7195-7206 (2018).
- Antoine, E. E., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Review of collagen I hydrogels for bioengineered tissue microenvironments: characterization of mechanics, structure, and transport. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (6), 683-696 (2014).
- Holder, A. J., et al. Control of collagen gel mechanical properties through manipulation of gelation conditions near the sol-gel transition. Soft Matter. 14 (4), 574-580 (2018).
- Zimmermann, W. H., et al. Tissue engineering of a differentiated cardiac muscle construct. Circulation Research. 90 (2), 223-230 (2002).
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