本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。
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本文内容
摘要
摘要
成纤维细胞是表型高度动态的细胞，可在生化和生物力学刺激下迅速转分化为肌成纤维细胞。目前对包括心脏纤维化在内的纤维化过程的理解仍然有限，这阻碍了新型抗纤维化疗法的开发。可控且可靠的人源模型系统对于深入理解纤维化病理至关重要。本研究提供了一种高度可重复且可扩展的实验方案，可在48孔铸造板中构建工程化结缔组织（ECT），以促进在三维（3D）环境中对成纤维细胞及其纤维化组织病理生理学的研究。ECT在具有可调刚度的支柱周围形成，从而可在定义的生物力学负荷条件下进行研究。在特定的加载条件下，可研究由细胞-基质相互作用调控的表型适应性变化。采用48孔板格式可实现平行测试，并可对多个参数进行时间过程分析，例如组织压缩和对抗负荷的收缩能力。基于这些参数，可进一步研究组织刚度和弹性等生物力学特性。
引言
研究纤维化疾病的主要障碍之一是缺乏能够反映成纤维细胞及其病理衍生物行为的代表性人类三维组织模型。由于分离的成纤维细胞在非顺应性二维基质上培养时会迅速转分化为表达α-平滑肌肌动蛋白（SMA）的肌成纤维细胞，因此标准的二维培养系统在研究纤维化过程方面并不理想1,2,3。因此，标准二维培养中的成纤维细胞并不能代表正常的“健康”组织表型3,4,5,6。尽管已有研究采用可变形基质来模拟非纤维化（10 kPa）和纤维化（35 kPa）的组织环境7，但这些模型缺乏第三维度，而这一维度在病理生理学中极为重要。组织工程技术为克服这一局限提供了可能，它允许在明确且可实验调控的细胞外基质（ECM）环境中培养成纤维细胞，例如通过调节细胞密度、ECM成分和ECM浓度，这些因素均可决定组织的生物力学特性。
已利用成纤维细胞构建了多种三维模型。其中，悬浮圆盘和微球是最早开发的模型，可证明胶原会以时间依赖的方式被重塑并发生....
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方案
所有步骤必须在生物安全二级柜中进行，且实验室的防护等级为一级。根据当地法规和所执行操作的类型（例如病毒介导的基因转移），防护等级必须提升至生物安全二级或三级。所有细胞培养物均置于细胞培养箱中，在37 °C、含5 % CO2的加湿空气环境中维持培养。请注意，步骤1和步骤2中提供的体积适用于T75细胞培养瓶。应根据标准细胞培养建议，针对不同的培养规格调整相应体积。
1. 原代心肌成纤维细胞（CF）的解冻与预铺板以进行单层培养（5-12天）
注意：作为替代方案，可按照供应商建议的标准传代培养方案使用 HFF-1 细胞。
- 根据制造商说明书配制成纤维细胞生长培养基（FGM）。可选择性添加抗生素，如 100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。使用前确保所有组分充分混匀。4 °C 条件下保存，最多可保存 14 天。
- 将 FGM 升温至 20–25 °C。
- 在 37 °C 水浴中解冻冻存的 CF（理想情况下每支冻存管含有 1 × 106 至 2 × 106/mL 细胞），约 2 分钟，直至冻存管中仅剩少量冰晶。
- 使用 2 mL 血清移液管，将细胞悬液逐滴转移至含有 10 mL FGM 的无菌离心管中。为最大程度回收细胞，用 1 mL FGM 冲洗冻存管，并将冲洗液转移至离心管....
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结果
在最初的24小时内，ECT的致密化程度可达初始细胞-胶原蛋白水凝胶体积的约95%。在对照条件以及含FCS条件下，组织的致密化和收缩通常在成模后数小时开始，并显著持续增加至第5天（图5A）。支柱偏转程度在随后的15天内可能进一步增加（最长测试时间为20天）。支柱偏转的幅度取决于细胞类型、细胞状态以及细胞和组织培养条件。通常在培养第5天测量生物力学特性，但也可选择其他时间点。作为ECT模型适用性的一个示例，本文展示了该方案如何有助于研究肌动蛋白细胞骨架完整性对组织功能的影响。ECT在48孔成模板中制备，并用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin A（Lat-A，7 ng/mL）处理。处理后ECT的致密化程度降低，表现为与对照组相比，横截面积（CSA）显著增加1.7倍（图8A，B）。此外，在5天培养期间评估了组织的收缩情况。在无药物处理时，组织收缩逐渐增加至第5天，达到约40%的收缩率。而Lat-A处理影响了组织收缩，最大收缩率仅为约20%（图8A.......
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讨论
本方案描述了从原代人冠状纤维细胞（CF）生成ECT的方法，可用于研究这些细胞对其细胞外基质环境的力学影响，反之亦然。
成纤维细胞需要扩增以获得足够的细胞数量用于计划的ECT实验（0.75 × 106 细胞/ECT)。为了获得最佳的可重复性，建议在每次传代时，将冻存或组织来源的成纤维细胞在二维单层培养中预培养至标准化时长，达到约80%融合度后再用于ECT的制备（实验方案步骤3）。用于培养原代人CF单层细胞时 特别建议对衍生的 ECT 使用适用于 CF 的商用培养基和补充剂（参见 材料表）。在标准的二维培养中，培养基中添加血清对于确保成纤维细胞（CF）的扩增至关重要。在三维培养（包括工程化角膜组织（ECT）的构建及后续培养）中，是否采用无血清或低血清条件，可根据所选成纤维细胞类型而定。然而，在利用成纤维细胞进行ECT构建时，建议至少在浇铸水凝胶中添加血清，以确保组织初始收缩的正常进行。
该操作步骤的一个局限性在于，为生成工程化心肌组织（ECT）而需在二维培养条件下扩.......
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披露
GLS 和 SL 起草了手稿。所有作者均参与了实验方案的制定并对手稿进行了修改。TM、MT 和 WHZ 是 myriamed GmbH 的科学顾问。WHZ 是 myriamed GmbH 的创始人及股东。
致谢
本工作由德国心脏病学会（DGK 研究奖学金，授予 GLS）和德国研究基金会（DFG，通过项目 IRTG 1816 支持 GLS 和 AD；项目编号 DFG 417880571 和 DFG TI 956/1-1 支持 MT；SFB 1002 TP C04 支持 MT 和 WHZ；SFB 1002 TP S01 支持 WHZ；EXC 2067/1-390729940J 支持 WHZ）资助。WHZ 还获得德国联邦教研部（BMBF，通过项目 IndiHEART）和 Leducq 基金会（20CVD04）的支持。MT、WHZ 和 SL 获得德国心血管研究中心（DZHK）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养试剂： | |||
| Accutase 溶液 | Merk Millipore | SCR005 | |
| 解离试剂 – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）粉末 | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（DPBS），pH 7.2，无 Ca²⁺，无 Mg²⁺ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM 成纤维细胞生长基础培养基 | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 成纤维细胞生长培养基-2 SingleQuots， 补充剂与生长因子 | Lonza | CC-4126 | |
| 成纤维细胞生长培养基 3 套件 | PromoCell | C-23130 | |
| 成纤维细胞基础培养基 3 | PromoCell | C-23230 | |
| 生长培养基 3 补充剂套装 | PromoCell | C-39350 | |
| 青霉素（10000 U/mL）/ 链霉素（10000 μL/mL） | Gibco | 15140122 | |
| 氢氧化钠溶液（NaOH）1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| 细胞来源： | |||
| 来自心室的正常人源心脏成纤维细胞（NHCF-V） | Lonza | CC-2904 | |
| 人源心脏成纤维细胞（HCF-c） | PromoCell | C-12375 | |
| 人源心脏成纤维细胞（HCF-p） | PromoCell | C-12377 | |
| 原代人源包皮成纤维细胞-1（HFF-1） | ATCC | SCRC- 1041 | |
| 胶原来源： | |||
| I 型胶原（牛源），溶于 0.01 M HCl | LLC Collagen Solutions | FS22024 | 6-7 mg/mL |
| I 型胶原（大鼠尾源），溶于 0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 mg/mL |
| 药物： | |||
| Latrunculin-A（Lat-A） | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| 塑料器皿： | |||
| 细胞培养用塑料器皿 | Sarstedt 和 Starlab | ||
| 尼龙网细胞滤筛（孔径 40 μm） | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| 宽口无菌移液管（10 mL） | Corning | 07-200-619 | |
| 专用仪器： | |||
| 适用于 1/2″ 探测器的双远心 CORE 镜头 | OptoEngineering | TCCR12096 | |
| 面阵扫描相机 Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
参考文献
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells ....
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重印与许可
