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方法文章

为生物医学与生物工程研究建立章鱼生态系统

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DOI：

10.3791/62705

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2021年9月22日

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1Department of Biomedical Engineering, Michigan State University, 2Neuroengineering division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 3Biomedical Imaging division, The Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 4Department of Radiology, Michigan State University

本文内容

摘要

了解章鱼独特的生理和解剖结构，可对生物医学研究产生重大影响。本指南介绍了如何建立和维护适合该物种生存的海洋环境，并包含先进的成像与分析方法，以可视化章鱼神经系统的解剖结构与功能。

摘要

生物医学研究领域的许多进展都源于对不同物种中支持特定功能的解剖学和细胞机制的发现。章鱼正是其中一种非凡的动物，它为科学家在神经科学、机器人学、再生医学和假肢学等领域提供了新的见解。对这类头足类动物的研究需要建立复杂的设施，并对章鱼及其生态系统进行精心护理，这对项目的成功至关重要。该系统需要多种机械和生物过滤系统，以提供安全、清洁的动物生存环境。除了控制系统外，还需进行专业的常规维护和清洁，以确保设施长期有效运行。建议通过改变水族箱的环境布局、引入多种猎物以及设置具有挑战性的任务，为这些高智商动物提供丰富的环境刺激。我们的研究成果包括磁共振成像（MRI）和全身体自发荧光成像，以及行为学研究，以更深入地理解其神经系统。章鱼具有独特的生理特性，可能影响生物医学研究的多个领域。为其提供可持续的生态系统，是揭示其独特能力的第一步关键举措。

引言

生物医学研究和生物医学工程中的许多新概念常常受到生物物种应对环境和生理条件及挑战的特定策略的启发。例如，了解萤火虫的荧光特性已促成了新型荧光传感器的发展，可用于报告其他模式生物中的细胞活动1；发现藻类中由光激活的离子通道推动了细胞和时间特异性的光调控神经技术的发展2,3,4,5；发现玻璃猫鱼中可依据地球磁场导航的蛋白质，促进了基于磁场的神经调控技术的发展6,7,8,9,10,11；对海兔（Aplysia）虹吸反射的理解，对于揭示行为的细胞基础起到了关键作用12,13,14。

研究人员通过利用非常规实验物种在生理功能方面所具有的独特优势和新颖视角，不断拓展当前的生物工程和系统发育研究工具。联邦机构也正通过资助针对多种物种开展的创新性研究，开始支持这些研究方向。

有一类动物，其独特的解剖结构、再生能力以及对每条腕的自适应控制，不仅令生物学家和工程师着迷，也吸引了社会各界的广泛关注，这就是Octopus17。事实上，过去几十年来，研究人员已对章鱼生理学和行为学的诸多方面进行了深入研究15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。然而，近年来分子生物学、进化生物学、机器人学、运动记录、成像技术、机器学习和电生理学等领域的新进展，正在加速揭示章鱼生理与行为的奥秘，并推动这些发现转化为创新的生物工程策略27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39。

本文描述了如何建立和维护章鱼养殖系统，这将对来自不同背景、具有不同科研兴趣与目标的科学家和工程师具有参考价值和实际意义。然而，我们的研究重点在于章鱼在神经科学与神经工程研究中的应用。章鱼拥有高度发达的神经系统，其中包含约4500万个中枢脑神经元、1.8亿个视叶神经元，以及分布在八条腕足的轴索和外周神经节中的额外3.5亿个神经元；相比之下，狗的神经元总数与之相近，而猫则仅有其一半40。与脊椎动物的神经系统不同，章鱼的脑部数百万神经元与其每条腕足轴索中的数百万神经元之间，仅通过约3.2万条传出纤维和14万条传入纤维相连40,41,42。这些数量相对较少的连接纤维表明，运动程序的大部分执行细节实际上是在轴索内部完成的，突显了章鱼所特有的分布式神经控制机制。章鱼的腕足具备极佳的精细运动控制能力，使其能够完成诸如开启瓶盖等复杂操作，即使瓶盖位于容器内部也能实现。这种高度发达的抓握运动能力为头足纲动物（章鱼、乌贼和墨鱼）所独有43。

事实上，经过数亿年的进化，章鱼已发展出卓越而复杂的基因组和生理系统43,44，推动了科学与工程领域的诸多新进展。例如，基于章鱼吸盘解剖结构设计的防水黏附贴片，可在湿润或干燥表面牢固附着45；受章鱼 伪装 皮肤启发的合成伪装材料，可将平坦的二维表面转变为具有凸起和凹陷的三维结构46。此外，已开发出微型软体自主机器人（即Octobots），未来有望作为体内手术工具47；以及安装在类似坦克机器人上的机械臂（即OctoArm）48。多种章鱼被用于生物医学研究，例如 Octopus vulgaris、Octopus sinensis、Octopus variabilis 和 Octopus bimaculoides（O. bimaculoides）；其中  O. vulgaris 和 O. bimaculoides 最为常用34,49,50。近年来不同章鱼基因组的测序完成，使该属成为特别受关注的研究对象，并开辟了章鱼研究的新前沿34,43,51,52。

O. bimaculoides 在我们的实验装置中使用的是一种中等体型的章鱼，该物种于1949年首次被发现，分布于从美国加利福尼亚中部至下加利福尼亚半岛南部的东北太平洋沿岸浅海水域17。可通过其眼睛下方外套膜上的假眼斑来识别。与 巨型太平洋章鱼（Enteroctopus dofleini) 以及 普通章鱼（Octopus vulgaris）O. vulgaris)，这些 加利福尼亚双斑章鱼（O. bimaculoides) 体型相对较小，初生时小于几厘米，幼体阶段生长迅速。在实验室条件下饲养，成体的胴体长度平均可达100 cm，体重可达800 g。53,54章鱼在出生后的前200天内经历快速生长期；此后被视为成体，并在其余生命周期中持续生长。55,56,57. 章鱼可能具有同类相食的行为，尤其是在 雌雄个体需分开放置在不同的水族箱中饲养，因此必须在独立的水族箱中单独饲养58.

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方案

所有动物实验均经密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 章鱼养殖箱设备设置

  1. 首先，获取将要并入海洋环境系统的水族箱所需的所有非生物材料，如图所示。 材料表尺寸以英寸为单位提供。
  2. 安装前，使用70%乙醇和去离子水清洗所有管路、管道和过滤系统部件。清洁时请勿使用肥皂或其他任何化学品。
  3. 放置一张 13 英寸 x 49 英寸 x ½ 英寸（部件编号#71），配四个由碳纤维制成的桌腿，尺寸为 2 英寸 × 2 英寸 × 23 英寸（部件编号#72）。将桌腿直接安装在桌面的四个角下方。
  4. 在台面下方，于每条桌腿之间安装2英寸×2英寸长（部件编号#72）的碳纤维稳定支架，支架固定在桌面底侧，并紧贴顶层搁板边缘。使用螺丝将另一件 与桌子正下方地面接触的、具有相同尺寸的架子。让泵（参见 材料表) 直接置于底层架表面，而水箱则放置在顶层表面。该系统如图所示 图1.
    ​注意：水箱出水为重力驱动，除进出水箱的管道外，所有管路的位置均需低于水箱底部，以确保最大的排水静压头。

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图1：章鱼养殖缸装置示意图。 进水口与出水口（a）。三个章鱼养殖缸，每个面积为1.22 m × 0.3 m（b）。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 钻一个单孔1¾ 英寸孔，距离水箱一侧边缘2英寸，使用玻璃切割钻头。出水口吸水滤网的底部将决定出水孔的高度，如右侧所示 图 2a水位由吸水筛决定，并需至少低于水箱顶部6英寸，以留出溅水区域。
  2. 使用PVC底漆和胶水永久连接管段。操作时，先将预定的PVC雄接管端插入雌接管端。在雄接管外侧仍可见部分贴上一条 painter's tape，以防止底漆和胶水残留在管子外表面。贴好胶带后将两部分分开，先在雄接管外表面均匀涂抹一层薄薄的底漆，然后在同一区域涂上胶水。
  3. 尽快在涂胶后将雄接管重新插入雌接管中，并取下胶带。涂底漆和胶水后24小时，用去离子水冲洗新连接的部件。固化时间请参照胶水产品说明中的进一步指示。
    注意：使用PVC底漆和胶水之前，务必确保所有管道和设备的安装到位；管道长度要求可能有所不同。
  4. 接下来，将吸滤网外径（OD）为1英寸的一端永久连接到弯头接头内径（ID）为1英寸的一端。将弯头接头的另一端连接至一段直型PVC管（外径1英寸）。再将该直管的另一端连接至穿墙直通接头的雌性插座内径（ID）为1英寸的一侧。
    注意：ID 指管道内壁之间的最大距离，OD 指管材外壁之间的宽度。
  5. 将穿墙直通接头永久连接至一根长4英寸、外径1英寸的PVC直管（来自步骤1.8）。该管道将朝向水箱外部。
  6. 将直管永久连接至PVC三通接头（内径1英寸，T型；来自步骤1.9）的中心位置。接着，将两根6英寸长（部件号#69）的管道（外径1英寸）永久连接至三通接头的两个相对端口：一个垂直向上，用于排气；另一个垂直向下，用于水流。
  7. 将向下延伸的直管（来自步骤1.10）永久连接至一个内螺纹带倒刺的直通接头（内径1英寸）。连接一根36英寸长的橡胶管（¾ 英寸内径）连接至带刺管道接头。
  8. 将冷却系统置于出水管路与集水系统之间。
  9. 连接 ¾ 将系统附带的英寸卡套接头连接至冷水机单元的输入和输出端口。将步骤1.11中的橡胶管连接到冷水机的进水接头。
  10. 连接一段新的 ¾ 英寸内径管（来自步骤1.13）从冷却器输出端（来自步骤1.12）连接至集液系统的入口，如图所示 图2b.
  11. 接下来，放置孔径为的4英寸×12英寸袜式滤器 200 µm，放入其指定区域，如图所示 图2。此外，如图所示 图2将蛋白质分离器和回流泵放置到相应位置。同时，将自动补水浮球阀安装在泵区内部侧壁上，位置位于回流泵进水口顶部上方2英寸处；安装时需确保不妨碍泵在必要时从水族箱中取出。
  12. 永久连接一根12英寸长的直管（¾ 英寸 OD）连接至泵的出口（来自步骤 1.15）。在另一端的 ¾ 英寸外径直管，将该管的外径永久连接至 ¾ 英寸内径 45° 肘关节。将关节的另一端永久连接至 ¾ 英寸外径管
  13. 将直管的另一端（来自步骤1.16）连接至一个直通变径接头的3/4英寸内径端。将较大一端的接头（2英寸外径）永久连接至紫外灯的输入端。
    注意：直管的长度可能有所不同。
  14. 接下来，将紫外光入口的位置与泵的输出管（来自步骤1.17）对齐，确保紫外光装置与泵之间的管道（来自步骤1.15）无弯曲。在稳定支架上钻孔，使其与紫外光装置的安装孔位置匹配。根据钻头尺寸选择合适的螺丝，并使用所提供的螺丝将紫外光装置固定在桌面上。
  15. 将另一个变径接头的2英寸端永久连接至紫外灯的输出端（来自步骤1.18）。将一根外径1英寸、长5英寸的直管连接至该接头的1英寸内径端。接下来，连接一个 90° 将内径1英寸、外径1英寸的弯头管件一端连接至外径1英寸的管子；使弯头管件未连接的一端朝向水箱上计划进水的一侧（与步骤1.5中所述同一侧）。
  16. 将步骤1.19中角部的另一端永久连接至一段长6英寸、外径1英寸的管路（部件编号#69），并将其接入流量控制单元（部件编号#2）的输入端。将另一段外径1英寸的管路（部件编号#69）永久连接至流量监测单元的输出端；该管路长度必须至少超出水箱侧面3英寸。
  17. 使用1¾ 英寸玻璃切割钻头（部件号 #1），在预定水线以上 3 英寸、距水箱侧壁 2 英寸处切割一个新孔（图1a在与出水孔相对的一侧，安装另一个穿舱接头，其1英寸承插口（部件号#77）朝向箱体外侧。
  18. 将外径为1英寸、长度为4英寸的直管（部件编号#69）永久连接至隔板滑接接头。将1.21步骤最后一部分的管路截短，使其长度与该管路从水箱伸出的距离相匹配。永久连接一根 90° 将管子（部件号 #65）连接至每根敞开的管道，并截取一段最终的1英寸外径直管（部件号 #69），永久连接两个转角部件。
    注意： 图3 展示了水族系统的一个简单示意图。
  19. 安装控制系统的其余部分（部件编号 #34），首先将电源插座（部件编号 #53）安装在实验台本身或附近的墙上。在其旁边安装流体监测模块（部件编号 #2）。
  20. 将流量传感器、电源插座和泄漏检测传感器连接到模块上。安装并设置连接在藻类培养箱上的生长灯（部件编号 #26）。图2).
  21. 将流速传感器、紫外灯、生长灯、水泵和蛋白质分离器插入电源插座。根据制造商手册设置水控系统的程序。
  22. 通过将半杯市售盐混合物与1加仑反渗透（RO）或去离子（DI）水混合来制备盐水。制备45加仑以完全填满一个水族箱及集水槽系统。
  23. 打开集水井系统流量控制器中的水泵，并持续添加海水，直至自动补水阀处于关闭位置，从而无需再添加淡水。
  24. 水加满后，停止注水，并开启水冷装置，将温度设定在 18 °C 到 22 °C 因为这是较适宜的温度范围53打开蛋白质分离器。
  25. 在水箱底部加入30 kg碎珊瑚，并在藻类培养盒底部铺上一层碎珊瑚。向章鱼饲养环境中放入多块活石及其他所需添加物。用盖子封闭水箱开口。
    注意：活石是已死亡的珊瑚，其表面栖息着细菌、藻类等宏观海洋生物。
  26. 根据包装说明添加用于海水水族箱的硝化细菌。按照说明持续添加，并使用水质检测试剂盒、pH传感器和温度传感器每日检测温度、盐度、pH、氨、亚硝酸盐和硝酸盐。氨、亚硝酸盐和硝酸盐的安全浓度分别为低于0.5 ppm、0.25 ppm和10 ppm。58.
  27. 在添加硝化细菌的几天内，确保关闭紫外灯，以促进海水微生物的生长。待各项参数处于安全范围后，可重新启动紫外灯。
  28. 系统建立后，还需检测pH值和氧合水平是否处于8.0–8.4范围内 figure-protocol-2 59分别在将任何动物加入水族箱之前，使用铜含量检测试剂盒检测系统中铜的存在情况及氧气水平。
    ​注意：铜会对无脊椎动物造成损伤，并干扰鱼类鳃部的渗透调节60,61.
  29. 如果在水中检测到铜，请测试去离子/反渗透（DI/RO）水源。确认水源不含铜后，进行30%的换水，并将活性炭块（部件编号#46）放入水中。如果问题仍然存在，进行全部换水并清洗所有部件。
  30. 在所有水质参数均确定处于安全水平后，加入10只幽灵虾 至少在添加章鱼的一周前将系统启动。这有助于为细菌引入生物量，并指示整体水质状况。
  31. 向藻类培养箱中添加额外的水族生态系统生物。这包括 刺松藻 spp.（ spaghetti 藻） 扁玉螺属物种 （带状梯螺），以及 Mercenaria mercenaria （小蛤蜊）

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图 2：集液系统。 集液系统的侧视图（a）。集液系统的俯视图（b）。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图3：水族箱配备位于水箱下方的集水槽过滤系统及环境控制单元。绿色箭头表示水流在系统中的方向。水从第一区流至第二区进行冷却，随后进入第三区，将较重的生物物质与较轻的物质分离。较重的废物沉至底部并排入第五区，而较轻的生物物质则流入第四区的滤袜中。水从第四区流至第五区下方，进入第六区的蛋白质分离器，以去除水中残留的废物。藻类培养箱中含有微生物，可分解废物、氨和硝酸盐，同时为水体增氧。在系统的最后阶段，会补充部分水以弥补蒸发损失，随后水泵将水重新送回水族箱。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 储存罐

  1. 设置两个高大的60加仑储水箱，一个用于海水，另一个用于反渗透（RO）水。确保淡水箱的最高水位线高于实验台。将一根¼英寸的管路连接到集水系统浮球阀的自动顶部，并将管路的另一端连接到淡水箱的底部。
    注意：当水分蒸发时，该装置可自动补充淡水，盐分则保留在水中。
  2. 向海水箱中注入水，并按比例加入适量的盐。持续对海水储水箱进行曝气，以促进盐的充分溶解并保证水体充分氧合。使用前需等待一小时，以确保盐完全混合均匀。
    ​注意：海水箱可用于清洗后重新注水。

3. 食物罐设置

  1. 若需将虾存活超过一周，应将其与章鱼分开放置在独立水族箱中，盐度低于30 ppt，温度接近 25 °C.
  2. 为此，章鱼养殖池成熟一周后，将8加仑成熟海水转移至虾池中。在池底添加15 kg碎珊瑚，并向池中放入若干活石，为蜕壳期提供隐蔽场所。图 4).
    注意：成熟海水是指允许海洋细菌在海水中生长的过程，如步骤 1.30 所示。
  3. 将外置过滤桶连接至水族箱边缘，按照制造商说明安装外置过滤桶。在水族箱旁放置一个气泵，连接通气管，管端连接气石并放入水族箱中。
  4. 每周清洁滤网并更换滤纸，同时更换25%的水。使用水质检测试剂盒，按照步骤1.30所述，每日检测饵料培养罐中的氮含量、pH值和温度参数。若水中氮参数持续偏高，需进行额外的换水操作，并向水中添加氮吸附袋；若问题持续超过一个月，则需将虾转移至更大的培养罐中。
  5. 待珊瑚碎屑完全散开后，立即放入虾类。若需优先添加虾类，可在到达后将虾从运输用水中移出，放入小型海水缸中5分钟，以清除生物废物，随后可直接将虾加入实验缸中。食蚊鱼在到达后可直接放入虾类养殖缸中。
    注意：虾和食蚊鱼可从材料清单所列的任何活体动物商业供应商或其他食品供应商处购买。也可为章鱼提供解冻后的虾。
  6. 用鱼粮薄片、枯死的植物或藻类喂养虾和鱼62，按照食品说明中的指示进行。
  7. 对于蟹类养殖箱，加入1加仑海水和10公斤卵石。将卵石堆放在一侧，使一侧形成干燥陆地，另一侧保留2厘米深的海水（如所述） 图4）。这些无脊椎动物的最佳环境水参数应为30-35 ppt和22-25 °C 用于盐度和温度11,63分别。
  8. 将招潮蟹直接放入水族箱中（图4）。螃蟹一生中大部分时间在陆地上度过，但可一次性在水下停留数天，因此部分浸没在水中的水族箱对其长期生存至关重要。
  9. 每天喂食一次招潮蟹，将鱼粮 flakes 加入蟹缸干燥区域的食盘中。每周清洁一次，取出招潮蟹并完全更换盐水。清洁 鹅卵石。
  10. 将海洋双壳类软体动物（蛤类和贻贝）置于海水中养殖，供章鱼自行打开取食，同时作为另一种水体过滤机制。64.
  11. 将贻贝放置在另一个空置的水箱中饲养一周，以避免给章鱼水箱的过滤系统带来不必要的废物负荷。
    ​注意：虽然贻贝是章鱼的首选食物，但它们在到达后不久更易死亡，如果数量较多，会显著增加水族箱内的生物废物。

4. 将章鱼引入水箱

  1. 确保氨、亚硝酸盐和硝酸盐浓度分别低于 0.5 ppm、0.25 ppm 和 10 ppm。准备手动水泵，用于清除水箱中的章鱼墨汁。建议由两人共同完成此操作。
  2. 到达后，将运输袋放在秤上，在取出章鱼后减去袋子的重量。在将动物转移至水箱的过程中，向袋中加入气石以增加水体溶氧量。测量运输用水的温度和盐度。记录运输后出现长期疾病的情况。
    1. 不要将袋中的水倒入水箱，而是将运输袋悬挂在水箱角落，使袋子部分浸入水箱水中，以开始调节运输袋内的水温。从袋中移除10%的水并倒入下水道，然后加入等量的水箱水至袋中。每10分钟重复一次，直到袋中水温与水箱水温相差不超过1°C。
    2. 当袋内与水箱水温差在1°C以内时，佩戴手套将章鱼转移到各自的水箱中。转移时，双手置于章鱼身体下方以提供支撑；第二人需轻轻将吸附在袋壁上的腕足拉开。
    3. 章鱼离开袋子后，迅速将其放入新栖息环境的水中，尽可能减少带入运输袋中的水。使用手动水泵清除章鱼入箱后释放的任何墨汁。随后称量带水的袋子，以估算动物的大致体重。
  3. 在到达后的前两周内，监测章鱼每日摄食量，应为其体重的4%至8%58,65,66。每天应检查章鱼四次；两周后可减少至每天两次。每两周称重一次，并根据需要调整其食物摄入量。
    注意：已知某些章鱼物种会从水箱中逃逸，因此建议在水箱盖上放置一个2.5 kg的重物以防止逃脱。

5. 日常护理

  1. 使用市售的盐水测试试剂盒（用于检测 pH、氨、亚硝酸盐和硝酸盐），按照试剂盒说明将相应量的水族箱水加入所提供的四个试管中。根据测试试剂盒的说明，向对应的试管中加入指定量的比色反应试剂。
  2. 如果氨、亚硝酸盐和硝酸盐浓度分别超过 0.5 ppm、0.25 ppm 和 10 ppm，则需将生物膜从袜式过滤器中冲洗干净或更换新的袜式过滤器。此外，使用刷子清理蛋白质分离器顶部的生物膜，并向水族箱中添加额外的反硝化细菌。若问题持续存在，则更换 25% 的新鲜海水。
    注意：上述步骤可降低生态系统中的含氮化合物。
  3. 使用手动泵清除水箱中所有死蟹和死虾的尸体以及章鱼的排泄物。将水箱中所有存活的蟹移出，并放回储养水箱。随后，重新调整水箱内大型物体的布局。
  4. 将章鱼每日食量一半数量的、体重为1.25 ± 0.25 g的蟹引入水族箱中。对幼年章鱼投喂解冻的虾或小型雄性招潮蟹。根据实验需要，可将蟹和虾放入水族箱的任意位置，或直接提供给章鱼。
    注意：该 章鱼每日的食物消耗量为其体重的4%–8%67根据章鱼的体重，也可提供冷冻虾作为食物来源。
  5. 每天提供五只幽灵虾，本实验中平均消耗三只。为丰富章鱼的食物种类，每周提供一次活蛤蜊或贻贝，并在水族箱中始终饲养三条食蚊鱼。
    注意：无需为动物提供多种食物，多样化食物可能影响实验过程中动物对食物的反应。为最佳监测章鱼的摄食行为和活动规律，建议采用以下喂食方案：早晨按体重提供半量的螃蟹，并将虾的数量增加至5只；傍晚时，将剩余半量的螃蟹投入养殖缸中。

6. 每周消毒

  1. 在清洁集水系统之前，先关闭除沫器、水泵和藻类收集箱的灯光。然后，在排出水之前关闭系统的自动阀门。最后，仅从集水系统中移除除沫器及其中的全部水体。
  2. 轻轻刷洗藻类收集箱，以去除其内壁上的大部分生物量。使用刷子清洁集水区的其余部分。取出滤袜，用醋清洗干净后晾干；每周轮换使用另一只滤袜，每三个月更换一次新滤袜。每周取出并清理除沫器顶部的生物量。
    注意：避免使用金属工具清洁塑料部件，以免产生划痕，进而促进微生物生长。
  3. 将除沫器重新放回系统中，并开始注入海水。当水泵区域开始进水时，可重新开启所有系统设备。当自动浮球阀的顶部处于关闭位置时，停止加水。

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图 4： 招潮蟹（Minuca pugnax）饲养缸。 饲养缸底部一半区域设为干燥基床，另一半区域注入 2 cm 深的浅层盐水。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：幽灵虾（Palaemonetes paludosus）养殖缸。 虾缸中的石块为虾类提供了藏身和蜕皮的场所，同时也利于微生物的生长。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 不适动物的护理

  1. 参照指南参考文献66评估章鱼的健康状况。
    注意：对于雌性章鱼，生命周期的结束通常始于产卵之后。动物将开始减少摄食，并最终完全停止进食 ，活动变得更为迟缓。生命终结过程开始后的存活时间因个体而异。除喂食和监测动物状态外，无法采取其他有效措施。衰老的雄性章鱼也会出现摄食减少和活动迟缓的现象68。

8. 章鱼麻醉

  1. 按照 Butler-Struben 等人所述的方法对章鱼进行麻醉69。
  2. 准备一个带盖的 6 L 容器，高度至少为 15 cm。将 4 L 直接取自章鱼养殖水箱的水倒入容器中，并使用带有气石的小型气泵对 4 L 海水进行曝气，以向水环境中输送氧气58。
  3. 在放入章鱼之前，向容器中加入 1% EtOH。在接触章鱼前，通过计数虹管排出水流的次数，记录每分钟呼吸次数。
    注：对于研究人员实验室中的章鱼，基础呼吸频率为每分钟 16–24 次。
  4. 在转移章鱼前，记录其皮肤色素沉着情况和基础呼吸频率。使用一个洁净的 4 L 开口容器，连同周围水体一并舀起，将章鱼从水箱中取出。
    注：在麻醉过程中，呼吸频率并不一定反映完全麻醉状态。
  5. 在容器中称量章鱼体重，然后用双手环抱其身体将其提起。可能需要第二人协助将吸附在容器壁上的腕足移开。
  6. 迅速将章鱼转移至已准备好的含 1% EtOH 的容器中，并盖上盖子以防止其逃逸。
  7. 在开始后的第 5 分钟末，通过计数虹管排出水流的次数，记录章鱼每分钟的呼吸频率。如果呼吸频率仍高于基础水平，且动物对轻微夹捏仍有反应，则向水中额外添加 0.25% EtOH。乙醇的添加可逐步进行，最高不超过 3% EtOH。
    注：章鱼失去意识的一个表现是其色素细胞失去控制，此时皮肤颜色较正常更浅。另一个判断指标是对腕足进行轻微夹捏，测试是否存在运动反应。若此时仍无反应，则表明章鱼已失去意识，可开始实验操作。
  8. 在麻醉期间，持续监测章鱼的呼吸频率和体色，确保其在整个操作过程中保持无意识状态。若章鱼在操作过程中开始苏醒，应追加 0.25% EtOH。
  9. 为逆转乙醇麻醉效应，将章鱼转移至一个新准备的 4 L 或更大体积的、来自其长期饲养水箱的充氧水中。当呼吸频率恢复正常、章鱼恢复活动能力且皮肤色素恢复至正常状态后，可将其移回原水箱。

9. 章鱼安乐死

  1. 遵循 Fiorito 等人、Moltschaniwskyj 等人以及 Butler-Struben 等人所述的国际章鱼安乐死标准57,58,69。
  2. 准备一个新 6 L 容器，加入 4 L 来自章鱼饲养箱的水。向安乐死容器中加入 MgCl2，使其浓度达到 4%。执行步骤 8.1 至 8.9 以麻醉章鱼。
  3. 在完成步骤 8.8 后，将章鱼转移至安乐死容器中。待呼吸停止后，等待 5 分钟，对章鱼进行断头处理，或继续将其留在安乐死容器中额外 5 分钟。

10. 双斑蛸（O. bimaculoides）的行为

  1. 在训练章鱼使用螺旋盖容器的当天早晨，不要喂食。设置一台摄像记录设备，对准预定的喂食区域。
  2. 准备一个50 mL的螺旋盖离心管，管壁和管盖上均匀分布直径为1 mm的孔洞，以保证容器内外的水流交换。将一只招潮蟹放入容器内，并在容器内部或外部附加配重，使其能够沉入水族箱底部。
  3. 将 容器放置在水族箱底部的开阔区域，确保章鱼和摄像机均能清楚看到。如果4小时后招潮蟹仍未被食用，则将其从容器中取出，并恢复当天的正常喂食计划。每天持续进行此项训练。
    注意：如图6所示，并在代表性结果部分中讨论。

11. 章鱼 MRI

注意：此前已在麻醉动物中测量过章鱼视网膜的诱发电功能磁共振成像反应70。本研究中，我们获得了章鱼神经系统的超高清空间分辨率磁共振成像，该成像需要数小时的扫描时间。因此，本实验在已处死的 O. bimaculoides 个体中进行。

  1. 使用7T系统获取MRI图像。将章鱼用食品级聚氯乙烯保鲜膜包裹，以保持组织的水分。将章鱼放在保鲜膜上，包好两端，然后卷起密封。
  2. 使用直径为4 cm的容积发射/接收线圈获取脑部和多条腕足的图像。采用T1加权RARE序列，参数如下：重复时间（TR）1500 ms，回波时间（TE）20 ms，分辨率为117 × 117 × 500 µm，平均次数100次，RARE因子为8。这些是成像啮齿类动物大脑的典型MRI参数。使用RARE因子可加快成像速度，同时对100幅图像进行平均以提高信噪比71。
  3. 使用86 mm容积发射线圈和4 × 4 cm的4通道阵列接收线圈对章鱼腕足进行成像。用手术剪切下一条腕足，并将其置于装有磷酸盐缓冲液（PBS）的15 mL锥形管中。
    注意：序列采用T1加权反转恢复序列（MP-RAGE），参数为：TR/TE = 4000/2.17 ms，反转延迟1050 ms，分辨率100 × 100 × 500 µm，平均次数9次，扫描时间1.5小时（图7）。反转恢复序列可抑制水信号，增强图像对比度；选择该序列是因为其能够清晰显示腕足内部解剖结构72。

12. 冷冻荧光断层成像（CFT）

  1. 快速冷冻章鱼：在通风橱中操作。将液氮罐底部铺满干冰，然后注入己烷。在约10分钟内缓慢将章鱼放入己烷中，并根据需要添加新鲜己烷和干冰，确保章鱼完全被低温己烷覆盖。将章鱼在-20 °C下保持冷冻状态，直至包埋。
  2. 包埋并切片章鱼：使用CFT制造商提供的工具制作适当大小的矩形模具以容纳章鱼。在模具底部覆盖OCT（最佳切割温度）包埋介质（组织学实验室常用的标准材料），并使其冷冻至半固态凝胶状态。
  3. 将冷冻的章鱼放入OCT凝胶层中，然后分2-3层缓慢覆盖OCT。每次倾倒后，将样本块冷冻至OCT呈凝胶状态。待章鱼完全覆盖后，在-20 °C下至少冷冻12小时。
  4. 将样本载入冷冻荧光断层成像系统73。
  5. 以介观分辨率对整只安乐死的O. bimaculoides进行连续切片和成像，使用3种发射/激发滤光片，从而生成多个三维各向同性数据集。
  6. 当切片到达腕足和消化系统时，将切片转移至载玻片，用于进一步组织学分析。
  7. 将原始数据集载入CFT供应商提供的专用重建软件中，该软件专为快速处理而设计。
  8. 利用标志点对齐、直方图平衡以及荧光校正与归一化方法（包括去除每个波长的亚表面荧光效应）重建三维图像堆栈。
  9. 当重建工具生成最终的三维图像堆栈后，使用成像软件工具可视化数据，并结合白光与荧光叠加生成穿越动画，以及三维最大强度投影（3D-MIPS），例如 图873。

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结果

本研究中所有动物均采自野外，因此无法确定其确切年龄，且在实验室的饲养时间各不相同。每天观察章鱼的健康状况，未发现寄生虫、细菌感染、皮肤损伤或异常行为。动物的平均体重为 170.38 ± 77.25 g。每只动物单独饲养在40加仑的水族箱中。每周记录的水族箱参数平均值±标准差如下：pH 8.4 ± 0.0，盐度 34.06 ± 0.61 ppt，温度 18.7 ± 0.75 °C，氨浓度 0.11 ± 0.14 ppm，亚硝酸盐浓度 0.25 ± 0.14 ppm，硝酸盐浓度 1.43 ± 2.44 ppm。

双斑蛸（O. bimaculoides）的行为：为了理解章鱼的感知运动功能以及学习和记忆能力，拧开试管已被证明是一种有效的测试方法（图6）。该测试还可提供一种富集环境，有助于维持与神经退化相关的关键生理机制74。该实验每日进行，共涉及三只章鱼，平均需要4天时间学会打开试管。

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讨论

系统设置：
该水族生态系统的设计结合了机械和生物方法，用于过滤和增氧。系统的过滤组件采用滤袋、蛋白质分离器以及定期清洁，以维持氮和氧的水平。更重要的是，我们还依赖海洋微生物来消耗有害的含氮化合物及其他生物废物，并通过光合作用过程为水体充氧。除使用藻类外，还可通过外置增氧泵连接气石来增加水中氧气含量。在添加任何细菌之前，建议先加入活沙或碎珊瑚作为微生物生长的培养基质；若无基质，微生物群落将在系统中定植得更慢。该过程通常需要1至3周，才能有效分解生物废物，并使氮循环稳定在合适参数范围内。

环境丰富化：
认知和感觉运动方面的丰富化刺激有助于章鱼的神经发生及其整体健康75。丰富化环境可包括沙质基底、贝壳、石块及其他可提供藏身之处和遮蔽空间的结构。我们经常改变章鱼饲养缸内结构的布局，并引入具有有趣机械设计的新玩具，以激励章鱼进行探索。我们发现，使用底部带孔的花盆作为章鱼的居所效果最佳，因为单入口的居所可能在取出章鱼时造成创伤，而带孔设计可减少操作带来的应...

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披露

所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目UF1NS115817（G.P.）支持。G.P. 还部分获得NIH资助项目R01NS072171和R01NS098231的支持。我们感谢Emit Imaging的Patrick Zakrzewski和Mohammed Farhoud在Xerra成像平台上进行数据采集与可视化方面的帮助与支持。密歇根州立大学与布鲁克生物自旋公司（Bruker Biospin）存在研究合作协议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-3/4 英寸钻头家得宝204074205玻璃切割工具
部件编号：1
1" 流传感器Neptune Systems本地经销商带传感器的管道，用于测量水流
部件编号：2
1" 滑动舱壁滤网Bulk Reef Supply207113水箱出水过滤器
部件编号：3
10加仑水箱普鲁斯宠物本地经销商招潮蟹暂养池
部件编号：4
4 英寸 × 12 英寸 200 微米尼龙单丝网滤袋（带塑料环）AQUAMAXXUJ41171过滤集水坑中的大型有机物
部件编号：5
40加仑水族箱普鲁斯宠物本地经销商4 个饲养水族箱
部件编号：6
60克聚丙烯矩形容器普鲁斯宠物本地经销商2 水储存（盐水和淡水）
部件编号：7
Active Aqua 1/10 马力水培或水族箱冷水机 2018 型号WayWe719574198463用于持续冷却水
部件编号：8
ALAZCO 2 软握柄重型瓷砖填缝刷ALAZCOB06W2FT5V5水箱清洁
部件编号：9
氨测试试剂盒Aquarium Pharmaceuticals33D用于水质检测
部件编号：10
Apex 系统 WiFiNeptune Systems本地经销商远程监控系统连接
部件编号：11
API 水族箱测试套装亚马逊B001EUE808用于水质检测
部件编号：12
API 铜测试试剂盒亚马逊B0006JDWH8用于水质检测
部件编号：13
Aqua Ultraviolet Classic UV 25 瓦系列装置Aqua UltravioletA00028用于去除离开集水系统的细菌
部件编号：14
AquaClear 50 泡沫滤芯，3 个装AquaclearA1394Food Tank 活性炭过滤器滤芯
部件编号：15
Aqueon QuietFlow LED PRO 水族箱动力过滤器 30Aqueon100106082食物罐过滤装置
部件编号：16
自动补水套件（ATK）（每套包含1个FMM模块、2个光学传感器和1个浮球）Neptune Systems本地经销商用于淡水水族箱
部件编号：17
自动补充反渗透去离子水（RODI，LLC）Neptune Systems本地经销商从储水系统到章鱼养殖箱
部件编号：18
带纹 trochus 蜗牛LiveAquariaCN-112080用于藻类培养箱
部件编号：19
刺松藻，人工养殖LiveAquariaBVJ-76354用于藻类容器
部件编号：20
蛤蜊 - 活体，硬壳，小圆蛤，野生，美国产，一打富尔顿鱼市N/A活体饲料
部件编号：21
经典海盐混合物 - Tropic MarinBulk Reef Supply211813水箱用水盐
部件编号：22
透明 Masterkleer 软质 PVC 塑料管，适用于空气和水，3/4" ID， 1" ODMcMaster5233K71清洁工具
部件编号：23
Continuum Aquablade-P 丙烯酸安全除藻刮刀（带塑料刀片）— 15 英寸海洋仓库4C31001清洁工具
部件编号：24
铜检测试剂盒Aquarium Pharmaceuticals65L用于水质检测
部件编号：25
Curve Refugium CREE LED 水族灯Eshopps6500K藻类培养箱灯光
部件编号：26
Eheim 1262 回流泵EHEIM1250219储水罐用泵
部件编号：27
Eshopps R-100 藻缸集水槽 GEN 3Eshopps15000集水系统
部件编号：28
乙醇，200 ProofSigma-Aldrich64-17-5麻醉
部件编号：29
Extech DO600 ExStik II 溶解氧测定仪ExtechDO600氧气测量
部件编号：30
招潮蟹；活体；一打东北卤水虾N/A活体饲料
部件编号：31
滤芯Aqueon100106087食物罐过滤器
部件编号：32
佛罗里达碎珊瑚干砂 - CaribSeaBulk Reef Supply212959水箱底部用沉积物
部件编号：33
FMM模块Neptune Systems本地经销商apex 系统控制器
部件编号：34
Fritz-Zyme TurboStart 900 - FritzBulk Reef Supply213036细菌开始
部件编号：35
手动操作鼓泵，虹吸管，带出液口的基本泵，适用于桶型容器Grainger38Y789手动水泵
部件编号：36
高 pH 测试试剂盒Aquarium Pharmaceuticals27用于水质检测
部件编号：37
Imagitarium 虾类用细网Petco2580993虾和鱼转移网
部件编号：38
泄漏检测套件（LDK）— 包含 FMM 模块及 2 个 ALD 传感器Neptune Systems本地经销商放置于地面以检测漏水
部件编号：39
Lee氏大型藻类清洁刷垫 - 玻璃用海洋仓库LE12007清洁工具
部件编号：40
活石普鲁斯宠物本地经销商章鱼栖息环境
部件编号：41
长瓶清洗刷 17" 超长海猫猫B07FS7J7PN水箱清洁
部件编号：42
氯化镁Sigma-AldrichM1028-100ML安乐死
部件编号：43
磁性探针架Neptune Systems本地经销商用于固定顶端传感器探头
部件编号：44
海洋幽灵虾东北卤水虾N/A活体饲料
部件编号：45
Marineland C系列罐式碳袋滤材，2个装有嚼劲的98331铜含量升高时
部件编号：46
Nitra-Zorb 袋Aquarium PharmaceuticalsAP2213吸收氮化合物
部件编号：47
硝酸盐检测试剂盒Aquarium PharmaceuticalsLR1800用于水质检测
部件编号：48
亚硝酸盐检测试剂盒Aquarium Pharmaceuticals26用于水质检测<许多生物医学研究的进展都源于对不同物种中支持特定功能的解剖学和细胞机制的发现。章鱼就是其中一种非凡的动物，它为科学家在神经科学、机器人学、再生医学和假肢领域的研究提供了新的见解。对这类头足类动物的研究需要建立复杂的设施，并对章鱼及其赖以生存的生态系统进行精心维护，这对项目的成功至关重要。该系统需要配备多种机械和生物过滤装置，以为动物提供安全且洁净的生活环境。此外，还需配备控制系统，并进行专业的日常维护和清洁，以确保设施长期稳定运行。建议为这些高智商动物提供丰富化的环境，例如定期改变水族箱内的布局、引入多种猎物以及设置具有挑战性的任务供其完成。我们的研究成果包括磁共振成像（MRI）、全身体自发荧光成像以及行为学研究，以更深入地理解其神经系统。章鱼具有独特的生理特性，可能对多个生物医学研究领域产生重要影响。为它们构建可持续的生态系统，是揭示其独特能力的第一步。> 部件编号：49
Pawfly 2 英寸圆柱形气石 6 件装 气泡扩散器 水族箱鱼缸泵用气石 蓝色亚马逊B076S56XWX曝气处理水
部件编号：50
Penn Plax 水族馆专用 airline 管 –透明且柔韧，不易折弯，标准长度8英尺亚马逊B0002563MM连接气泵与气石的软管
部件编号：51
带活接/阀门的管道，外径 3/4" 柔性软管普鲁斯宠物本地经销商水体运输
部件编号：52
PM1 模块Neptune Systems本地经销商顶端电源控制模块
部件编号：53
蛋白质分离器礁石章鱼AC20284清除系统中的生物废弃物
部件编号：54
PVC 顶点安装板、衬套、电线支架Neptune Systems本地经销商有助于确保系统内电线和管路的有序排列
部件编号：55
PVC 普通胶粘剂和 4 盎司 NSF 紫色底涂剂亚马逊Oatey - 30246用于连接PVC管
部件编号：56
RODI 仪Neptune Systems本地经销商反渗透水
部件编号：57
盐度探针HANNA探针HI98319测量水的盐度
部件编号：58
Seachem Pristine 水族箱处理剂Seachem1438提供可分解多余食物、废物和碎屑的细菌
部件编号：59
Seachem Stability 鱼缸稳定剂Seachem116012607Seachem Stability 可快速且安全地在淡水和海水系统中建立水族箱生物过滤器
部件编号：60
Lexan 顶盖组件普鲁斯宠物本地经销商水族箱盖
部件编号：61
各种延长长度的 Aquabus 电缆套装Neptune Systems本地经销商Apex 系统用电缆
部件编号：62
SLSON 水族箱藻类刮除器 双面海绵刷清洁工具 长柄玻璃水族箱 scrubber亚马逊B07DC2TZCJ清洁工具
部件编号：63
标准壁厚 PVC 水管管件，45度弯头异径接头，3/4 英寸内螺纹母接头 x 3/4 英寸外螺纹公接头McMaster4880K189PVC 管
部件编号：64
标准壁 用于水的PVC管件，90度 肘部 适配器 1 个母头插座 x 1 个公头插座McMaster4880K773PVC 管
部件编号：65
标准壁 用于水的 PVC 管件，异径接头， 1 Socket-Connect 雌性 × 1 带刺雄性McMaster4880K415PVC 管
部件编号：66
标准壁 用于水的PVC管接头，直通型 减速器 2 孔雌性连接器 x 3/4 插座母头McMaster4880K008PVC 管
部件编号：67
标准壁 用于水的 PVC 管件，三通连接器 怀特， 1 大小 Socket-Connect 雌性McMaster4880K43PVC 管
部件编号：68
标准壁 用于水的无螺纹刚性PVC管，1英寸管径，10英尺长McMaster48925K13PVC 管
部件编号：69
用于水的标准化壁厚无螺纹刚性PVC管，管径3/4，长5英尺McMaster48925K92PVC 管
部件编号：70
结构型 FRP 玻璃钢板，48" 宽 x 96" 长，1/2" 厚McMaster8537K15台面材料
部件编号：71
结构型 FRP 玻璃钢方形管，10 英尺长，2" 宽 x 2" 高外部，1/8" 壁厚McMaster8548K33结构表材料
部件编号：72
水箱沉积物TopDawg 宠物用品8479001207招潮蟹养殖缸底部用沉积物
部件编号：73
温度探头Neptune Systems本地经销商水族箱温度探头
部件编号：74
Tetra TetraMarine 大型海水鱼 flakes 饲料，适用于所有海水鱼类亚马逊B00025K0US鱼、虾和蟹饲料
部件编号：75
Tetra Whisper 10加仑水族箱气泵Petco2335234小型水族箱用气泵
部件编号：76
厚壁穿墙管件，用于水，PVC 连接器，1 个插口连接母头McMaster36895K843PVC 管
部件编号：77
Vectra s2 泵Bulk Reef Supply212141水族箱泵
部件编号：78
水泵TACKLIFEGHWP1A用于清洁水箱的泵
部件编号：79
Wyze Cam v2 1080p高清室内WiFi智能家用摄像头（含夜视功能）亚马逊B076H3SRXGDeepLabCut 录制
部件编号：80

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