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方法文章

利用荧光寿命成像显微镜研究癌细胞的代谢与黏度

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DOI：

10.3791/62708

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2021年7月31日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Experimental Oncology and Biomedical Technologies, Privolzhsky Research Medical University, 2Becker & Hickl GmbH, 3Department of Chemistry, Imperial College London

本文内容

摘要

本文展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM），在活体癌细胞培养物中依次成像细胞代谢和质膜黏度。代谢评估通过检测内源性荧光实现，黏度则使用荧光分子转子进行测量。

摘要

黏度是生物膜的一个重要物理特性，因为它是调控活细胞形态和生理状态的关键参数之一。已知肿瘤细胞的质膜在其组成、结构和功能特性方面存在显著改变。除了葡萄糖和脂质代谢失调外，这些特定的膜特性还帮助肿瘤细胞适应恶劣的微环境，并对药物治疗产生耐药性。在此，我们展示了如何利用荧光寿命成像显微技术（FLIM）在活体癌细胞培养中依次成像细胞代谢和质膜黏度。通过检测内源性代谢辅因子（如还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NAD(P)H 和氧化型黄素）的荧光来评估代谢状态。黏度则使用一种荧光分子转子——一种合成的黏度敏感性染料——进行测量，该染料的荧光寿命对其所处环境的黏度具有强烈依赖性。结合这两种技术，使我们能够更深入地理解癌细胞膜状态与其代谢特征之间的关联，并可视化化疗所诱导的变化。

引言

细胞的恶性转化伴随着其形态和生理状态的多种改变。癌细胞的快速且不受控制的生长需要对负责能量产生和生物合成的生化通路进行根本性的重组。癌症代谢的典型特征包括：即使在正常氧浓度下糖酵解速率也增强（即瓦伯格效应）、利用氨基酸、脂肪酸和乳酸作为替代燃料、在抗氧化物水平较高的情况下仍产生大量活性氧（ROS），以及脂肪酸生物合成增加1,2。目前人们认识到，癌细胞的代谢具有高度可塑性，这使其能够适应不利且异质性的微环境，从而获得额外的生存优势3。

代谢的改变支持肿瘤细胞膜的特定结构与组成。癌细胞质膜的脂质谱在定量上不同于非癌细胞。脂质组的主要变化包括磷脂水平升高，如磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱；鞘磷脂水平降低；胆固醇含量增加；以及脂肪酸不饱和度降低等4,5,6。因此，膜的物理性质（如膜黏度，即流动性之倒数）不可避免地发生改变。由于黏度决定生物膜的通透性，并调控膜相关蛋白（酶、转运蛋白、受体）的活性，其稳态调节对细胞功能至关重要。同时，通过调节膜脂质谱来改变黏度，对于细胞在环境变化条件下的迁移/侵袭和存活也具有重要意义。

荧光寿命成像显微技术（FLIM）已成为一种强大的方法，可用于无创评估活细胞中的多种参数，其可通过内源性荧光或外源性探针实现7。FLIM通常在多光子激光扫描显微镜上实现，该系统可提供（亚）细胞分辨率。当配备时间相关单光子计数（TCSPC）模块时，能够以高精度进行荧光的时间分辨测量8。

利用荧光寿命成像（FLIM）探测细胞代谢的基础在于检测脱氢酶的内源性辅因子的荧光信号，这些辅因子包括还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）NAD(P)H以及氧化型黄素类分子——黄素腺嘌呤二核苷酸FAD和黄素单核苷酸FMN，它们在多种生化反应中充当电子载体7,9,10。所检测到的NAD(P)H荧光信号来源于NADH及其磷酸化形式NADPH，因为二者在光谱上几乎完全相同。通常情况下，NAD(P)H和黄素类分子的荧光衰减曲线可拟合为双指数函数。对于NAD(P)H而言，第一个组分（约0.3–0.5 ns，占比约70%–80%）归因于其游离状态，与糖酵解相关；第二个组分（约1.2–2.5 ns，占比约20%–30%）则对应其与蛋白质结合的状态，与线粒体呼吸作用相关。对于黄素类分子，短寿命组分（约0.3–0.4 ns，占比约75%–85%）可归属于被淬灭的FAD状态，而长寿命组分（约2.5–2.8 ns，占比约15%–25%）则对应未被淬灭的FAD、FMN及核黄素。糖酵解、谷氨酰胺分解、氧化磷酸化以及脂肪酸合成等代谢途径相对水平的变化，会导致这些辅因子短寿命和长寿命组分比例的改变。此外，这些荧光团的荧光强度比值（即氧化还原比）反映了细胞的氧化还原状态，也被用作代谢状态的指标。尽管与荧光寿命相比，氧化还原比在数据采集上更为简便，但FLIM在评估NAD(P)H和FAD方面具有优势，因为荧光寿命是荧光团的内在特性，几乎不受激发光功率、光漂白、聚焦、光散射和吸收等因素的影响，尤其是在组织样本中，而发射光强度则容易受到这些因素的干扰。

在微观尺度上对活细胞和组织中的黏度进行成像，一种便捷的方法是利用荧光分子转子——一类小分子合成的黏度敏感性染料，其荧光参数强烈依赖于局部黏度11,12在黏性介质中，由于分子内扭转或旋转运动减缓，分子转子的荧光寿命会延长。在各类分子转子中，二氟化硼二吡咯甲烷（BODIPY）衍生物特别适用于生物体系中黏度的检测，因其在生理相关黏度范围内具有良好的荧光寿命动态响应范围、不受温度影响、呈现单指数荧光衰减特性从而便于数据解析，同时具备足够的水溶性和低细胞毒性。13,14基于BODIPY的分子转子结合荧光寿命成像显微技术（FLIM）对癌细胞微黏度的定量评估此前已有报道 体外多细胞肿瘤球体和小鼠肿瘤 在体15,16.

本文详细介绍了用于研究癌细胞细胞代谢和质膜黏度的连续探针检测方法 体外 通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）进行检测。为避免相对较弱的内源性荧光受到基于BODIPY的分子转子荧光的干扰，需对同一层细胞依次成像，首先采集NAD(P)H和FAD的荧光信号。辅酶的荧光寿命在细胞质中测定，而转子的荧光寿命则通过手动选择相应区域作为感兴趣区，在细胞质膜中测定。该方案已应用于不同癌细胞系的代谢状态与黏度的相关性分析，并用于评估化疗后的变化。

FLIM样品制备方案与共聚焦荧光显微镜的样品制备方案并无差异。一旦获取数据，主要任务是从原始数据中提取荧光寿命。本方案的实施效果通过HCT116（人结肠直肠癌细胞）、CT26（小鼠结肠癌细胞）、HeLa（人宫颈癌细胞）和huFB（人皮肤成纤维细胞）进行展示。

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方案

1. 执行荧光寿命成像（FLIM）的最小配置说明

  1. 进行本实验时，需确保具备以下设备：一台倒置共聚焦显微镜、一台脉冲激光器（通常为皮秒或飞秒激光器），并配有同步信号输出，一个快速光子计数探测器（时间响应为150 ps）及光子计数电子系统，显微镜上需具备探测器的输出端口和激光器的输入端口，显微镜扫描控制器输出的扫描时钟脉冲，以及配备适用于FLIM所用激光波长的激光束合束器和主二向色镜的显微镜扫描头。
  2. 若FLIM采用双光子激发方式，需确保显微镜具备NDD端口。
  3. 对于哺乳动物细胞研究，尤其是长期实验，需确保配备一个可维持所需温度的CO2培养箱。
    ​注：有关本实验所用系统的详细信息，请参见材料表。

2. 显微镜观察用细胞的制备

  1. 将细胞常规培养于 37 °C、5% CO2 及湿润环境的培养箱中。
  2. 用于显微镜观察时，用完全培养基制备细胞悬液，浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
    注意：细胞浓度和培养基条件取决于具体细胞类型。接种细胞的数量和培养时间应根据实际情况调整，以确保在显微观察用培养皿中达到 70%–80% 的汇合度。
  3. 使用 200 µL 移液器将细胞接种至玻璃底 35 mm 细胞培养皿中（每皿 100 µL 含 1 × 105 个细胞）。
    注意：接种细胞时应使用带网格的玻璃底培养皿，以便在动态观察中持续追踪同一显微视野中的细胞。
    1. 手动接种过程中，确保移液器吸头不刮擦培养皿的底部或侧壁，以避免损伤皿底表面。
  4. 将培养皿放入 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2，湿润环境）中，孵育细胞 24 小时。
  5. 24 小时后，从培养箱中取出培养皿，在光学显微镜下检查细胞形态和汇合度。若细胞未达到约 80% 汇合度，则继续孵育额外 24 小时。
  6. 使用 1,000 µL 移液器轻柔吸除旧培养基，加入 2 mL 不含酚红的 DMEM 培养基（例如 DMEM Life 或 FluoroBrite）。
    ​注意：成像时可使用不同的培养基。进行显微镜观察时，应避免在培养基中使用含酚红的制剂。
  7. 将培养皿放回培养箱中孵育 60–120 分钟，使细胞适应环境。

3. 代谢辅因子的荧光寿命成像

  1. 将含有细胞的玻璃底培养皿（来自步骤 2.7）放置在显微镜载物台上。
  2. 点击激光扫描显微镜软件中的 定位 选项卡（例如 ZEN - ZEISS Efficient Navigation），然后点击 透射光 (TL) 以打开光源。
  3. 通过目镜观察细胞的中央切片层面，找到样品的焦平面，该层面应为细胞占据方形区域最大的位置（放大倍数为 40x）。
  4. 点击 关闭 按钮以关闭光源。
  5. 打开 采集 选项卡。为获取内源性 NAD(P)H 的透射光和自发荧光强度图像，请设置以下参数：激发波长：双光子模式 750 nm，检测范围：450–490 nm，激光功率：5%（约 6 mW），图像尺寸：1024 × 1024 像素。
    注意：激发波长和检测范围的选择基于 NAD(P)H 的光谱特性（最大激发和最大发射波长）17。
    1. 使用油浸物镜 С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA 进行图像采集。
  6. 按下 快照 按钮，并以 ZEN 格式保存图像。
  7. 为获取 FAD 的透射光和自发荧光强度图像，将 激发波长 更改为 900 nm，设置 检测范围：500–550 nm，激光功率：9%（约 6 mW），图像尺寸：1024 × 1024 像素。
    注意：激发波长和检测范围的选择基于 FAD 的光谱特性（最大激发和最大发射波长）18。
    1. 使用油浸物镜 С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA 进行图像采集。
  8. 按下 快照 按钮，并以 ZEN 格式保存图像。
  9. 对于 NAD(P)H，按照步骤 3.5 所述在激光扫描显微镜软件中设置参数，并将 图像尺寸 更改为 256 × 256 像素。
  10. 在 FLIM 模块的 SPCM（单光子计数模块）操作软件菜单中输入以下参数：采集时间：60 秒；TAC 范围：5.00E-8；CFD 下限：-29.41；ADC 分辨率：256；图像尺寸：256 × 256 像素。
  11. 对样品扫描 60 秒，停止扫描并保存获得的 NAD(P)H 的 FLIM 图像。
  12. 检查所获得的 FLIM 数据。为此，在图像软件中 打开 原始数据，将光标置于细胞胞质中的某一像素上并分析该像素的荧光衰减曲线。在 binning 为 1 的条件下，像素强度应 ≥3,000 个光子每衰减曲线。
    注意：如果光子数低于 3,000，可提高激光功率或图像采集时间，同时监控细胞形态和光子计数速率。通常，若计数率下降超过初始值的 10%，则表明发生了光漂白。
  13. 对于 FAD，按照步骤 3.7 所述在激光扫描显微镜软件中设置参数，并将图像尺寸更改为 256 × 256 像素。
  14. 在 FLIM 模块的 SPCM（单光子计数模块）操作软件菜单中输入以下参数：采集时间：60 秒；TAC 范围：5.00E-8；CFD 下限：-29.41；ADC 分辨率：256；图像尺寸：256 × 256 像素。
  15. 对样品扫描 60 秒，停止扫描并保存获得的 FAD 的 FLIM 图像。
    ​注意：步骤 3.10 和 3.15 中列出的参数针对所使用的电子设备和探测器而设定。
  16. 按照步骤 3.12 所述方法检查所获得的数据。
  17. 重复步骤 3.5–3.16，以记录不同视野下的 FLIM 图像。

4. 使用荧光分子转子对细胞进行染色

注意：在室温（约 20 °C）下，将细胞置于荧光分子转子溶液中成像，不进行洗涤，以减缓转子的内化过程。膜黏度具有温度依赖性，这一点在我们之前的研究中已有证明19,20。应在向细胞加入转子之前提前关闭显微镜的温控载物台。以我们的设备为例，载物台冷却约需 10 分钟。

  1. 制备荧光分子转子 BODIPY 2 的通用储备液（储备液 1，25.7 mM）。
    1. 在无菌环境中打开 BODIPY 2，使用精确天平称取约 2 mg，并小心转移至微量离心管中。
    2. 使用自动 20 µL 移液器加入 3 µL 适当的溶剂（例如 DMSO）。
    3. 待样品在 DMSO 中完全溶解后，加入 297 µL 无菌 PBS，并使用自动 200 µL 移液器充分混匀。
      注意：将储备液置于 4 °C 冰箱中避光保存。重悬后可在冰箱中保存数月。
  2. 通过将 25 µL 通用储备液（储备液 1）加入微量离心管中，再加入 48 µL 无菌 PBS，制备储备液 2（8.9 mM）。使用自动 200 µL 移液器轻轻混匀。
    注意：使用储备液 2 制备用于细胞染色的最终染色工作液，因细胞染色需使用微摩尔浓度。
  3. 轻轻吸除培养皿中的培养基（来自步骤 3.1），替换为冰冻的无 Ca2+/Mg2+ Hank's 溶液，并在 +4 °C 下孵育细胞 3 分钟。
    注意：使用冰冻溶液并在 +4 °C 下孵育可减缓分子转子的内吞作用，使细胞膜局部染色持续 20–30 分钟。
  4. 通过将 1 µL 储备液 2 加入 999 µL 冰冻 Hank's 溶液或 PBS 中，制备含 4.5 µM BODIPY 2 的最终染色溶液。
    注意：最终染色溶液中 BODIPY 2 的浓度可提高至约 10 µM，对细胞无毒性，且可实现更高效的染色和更高的光子采集数量；但浓度过高可能导致 FLIM 探测器过载。
  5. 吸除细胞培养皿中的 Hank's 溶液，替换为冰冻的 4.5 µM BODIPY 2 溶液。细胞在未洗涤的情况下直接于 BODIPY 2 溶液中进行成像。

5. 细胞中荧光分子转子的荧光寿命成像（FLIM）

注意：由于BODIPY 2的荧光光谱与内源性辅因子NAD(P)H和FAD的发射光谱重叠12,17,18，因此必须在完成代谢辅因子的荧光寿命成像（FLIM）之后，再进行荧光分子转子的FLIM检测。

  1. 将染色后的细胞培养皿转移至显微镜载物台（约 20 °C）进行成像。
  2. 在激光扫描显微镜软件中设置单光子模式的以下参数：激发波长为 488 nm（使用氩离子激光器），激光功率为 1%–2%，采集范围为 500–550 nm 波长。
  3. 使用油浸物镜 С Plan-Apochromat 40x/1.3 NA 进行图像采集。
  4. 点击实时按钮。开始扫描，并通过集成的电动载物台调节 XY 和 Z 轴位置，调整焦距，在预览窗口中获取细胞的透射光和荧光强度图像。如需，可保存所获得的图像。
  5. 检查叠加的透射光与荧光图像，确认荧光探针的信号是否来自预期位置（细胞质膜）。
  6. 在 FLIM 模块的 SPCM 软件菜单中输入以下参数：采集时间：60 s；TAC 范围：5.00E-8；CFD 下限：-29.41；ADC 分辨率：256；图像尺寸：256 × 256 像素。
    注意：根据 FLIM 系统配置及所用探测器的不同，图像采集参数可能有所变化。
  7. 调节显微镜的 Ti:Sapphire 激光器，使其波长为 850 nm，激光功率为 1%–2%，用于双光子 FLIM 成像。
  8. 在激光扫描显微镜软件中选择连续扫描选项卡，然后在 SPCM 软件中点击开始。对样品扫描 60 秒，停止扫描，并保存所获得的 FLIM 图像。
  9. 检查所获得的 FLIM 数据。为此，将原始数据导入 FLIM 数据分析软件 SPCImage，将光标置于细胞膜上的某一像素点并选择该点，分析该像素的荧光衰减曲线。在合理的采集时间（60–120 s）内，像素强度应 ≥5,000 计数/衰减曲线（可包含像素合并）。
  10. 重复步骤 5.4–5.8，以记录不同视野下细胞的 FLIM 图像。
    ​注意：使用 BODIPY 2 染色的活细胞进行 FLIM 测量，应在加入 BODIPY 2 后的约 30 分钟内完成。

6. 数据分析

  1. 荧光强度分析：氧化还原比率
    1. 使用 ImageJ 打开 NAD(P)H 和 FAD 荧光强度的图像
    2. 在NAD(P)H图像中使用圆形或方形工具圈选一个无细胞区域。点击 测量，然后单击 减去 （选择 过程 在主面板上，然后 数学 和 减去) 以减去测得的背景信号值。
    3. 对FAD图像重复步骤6.1.2。
    4. 通过将FAD荧光强度除以NAD(P)H荧光强度来获得氧化还原比率图像。操作方法为选择 过程 在主面板上，然后选择 图像计算器 和 分割；勾选该复选框 创建新窗口，然后按压 好的.
    5. 以 TIFF 格式保存图像。
    6. 为计算氧化还原比率，需在TIFF图像上选定特定细胞的胞质区域，然后按下 M 关键。对所有感兴趣的细胞重复此步骤。
    7. 将测量结果导入电子表格文档。
      注意：也可以使用显微镜的标配软件测量细胞中NAD(P)H和FAD的荧光强度，并在电子表格软件中将这两个数值相除以获得氧化还原比。
  2. FLIM 数据分析：代谢
    1. 将NAD(P)H的FLIM图像导入SPCImage软件中。
    2. 对图像应用双指数衰减拟合，将2填入其中 组件 部分
    3. 固定 偏移量 通过在 SPCImage 软件中勾选相应的复选框来设置参数。
    4. 前往 选项 并选择 模型使用 不完全多指数 拟合模型和 拟合方法 MLE.
    5. 调整像素合并（binning）以实现每个衰减曲线的光子强度不低于5000。
    6. 检查 χ2 值。χ2≤ 1.20 表明所使用的模型具有合理的拟合度。
    7. 通过点击顶部菜单计算每幅图像中荧光寿命的直方图 计算，然后在 衰变矩阵.
    8. 选择特定细胞的细胞质区域作为感兴趣区域。
    9. 分析短寿命和长寿命组分（τ1 和 τ2，以及寿命组分的相对振幅（a1 和一个2，其中 a1 + a2 = 100%）通过使用 颜色 选项
    10. 将测量结果导出至电子表格软件。
    11. 对每个目标细胞重复步骤 6.2.8–6.2.10。
    12. 对FAD图像重复步骤6.2.1–6.2.11。
  3. FLIM 数据分析：黏度
    1. 将FLIM图像导入FLIM数据分析软件SPCImage。
    2. 移除标记 散点图 盒子
    3. 将1放入 组分 由于转子荧光衰减应符合单指数模型，因此需进行分段处理。
    4. 调整 binning 以达到每个衰变曲线的像素强度 ≥5000 个光子。
    5. 检查质膜中的χ2值。χ的值2≤ 1.20 表明所使用的模型具有合理的拟合度。对于 χ2≥ 1.20 时，单指数近似不适用，此类数据可能表明染料发生聚集，应予以舍弃。染料聚集会导致无法使用校准曲线，并造成黏度估算错误。
      注意：双指数衰减可能提示存在聚集现象。在配备可变滤光片FLIM模块的显微镜上，可通过检测单体和聚集体特异性发射波长范围（分别为500–550 nm和580–650 nm）来识别，具体方法见参考文献21.
    6. 通过点击顶部菜单生成每幅图像的荧光寿命 τ 直方图 计算，然后在 衰变矩阵.
    7. 选择具有单指数衰减特性的单个细胞的质膜区域，χ2≤ 1.20，使用 ROI 选项。
    8. 将荧光寿命的数值导出至电子表格软件。
    9. 对每个感兴趣的细胞重复步骤 6.3.7–6.3.8。
    10. 使用以下方程（基于BODIPY在甲醇/甘油混合物中的校准曲线先前获得）将BODIPY 2的实验测得寿命（单位：ns）转换为黏度值（单位：cP）：
      在数学公式语境中用于计算变量 y 下 x 的方程。
      其中，x 为黏度（单位：cP），y 为荧光寿命 τ（单位：ns）。
      注意：仪器响应函数（IRF）是荧光寿命成像拟合（FLIM）的重要组成部分。在SPCImage软件中，IRF会根据荧光衰减曲线的上升沿自动计算得出。同时，也可通过非荧光样品（如陶瓷）或能产生二次谐波信号（SHG）的样品（如胶原、尿素晶体或蔗糖晶体）来记录IRF。如果软件具备自动计算IRF的功能，则不建议使用实验记录的IRF。

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结果

利用本文所述方案，我们通过荧光寿命成像技术（FLIM）对活体培养细胞中的代谢辅因子及微观膜黏度进行了可视化观察。实验在不同癌细胞系中进行，包括人结直肠癌细胞HCT116、小鼠结肠癌细胞CT26、人宫颈癌细胞HeLa Kyoto以及人皮肤成纤维细胞huFB。

基于荧光强度的氧化还原比率 FAD/NAD(P)H 以及 NAD(P)H 和 FAD 的荧光寿命可用于评估细胞代谢状态（图1, 图2）。NAD(P)H 和 FAD 主要定位于细胞的细胞质中。本研究中不同类型的细胞表现出相似的 NAD(P)H 和黄素类荧光寿命，以及相似的短寿命和长寿命组分贡献，这可能表明它们具有相似的代谢状态 体外 条件。荧光寿命及游离态（τ1，一个1）以及蛋白质结合态（τ2，一个<...

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讨论

本方案展示了荧光寿命成像显微镜（FLIM）在癌细胞多参数、功能性和生物物理分析中的应用潜力。通过结合基于内源性荧光的光学代谢成像与利用外源性荧光分子转子标记进行的细胞质膜黏度测量，我们能够在细胞培养条件下对活体癌细胞中这两个参数之间的相互关系进行表征，并追踪其对化疗的响应变化。

双光子激发荧光寿命成像显微技术（FLIM）是一种具有前景的技术，可用于对活细胞和组织的功能状态进行无创、灵敏、定量且高分辨率的评估。目前已有基于荧光寿命检测的荧光化学传感器和基因编码传感器，可用于可视化多种生理及物理化学参数，包括离子浓度、pH值、酶活性、缺氧状态、细胞周期、黏度、膜电位等。此外，FLIM还可利用NAD(P)H和黄素辅因子的内源性荧光来捕捉细胞的代谢特征。与荧光强度不同，荧光寿命能够克服因荧光探针浓度未知和/或不稳定、光漂白、仪器配置（例如，激发光强度、照明不均和光程长度）以及吸收和散射事件所带来的困难23。由于具备从单一样品中测量多个参数的能力，FLIM在生物医学应用中正成为一种日益流行的成像模式。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

代谢成像方案的开发得到了俄罗斯联邦卫生部（政府任务，注册号 АААА-А20-120022590098-0）的支持。黏度研究得到了俄罗斯科学基金会（项目编号 20-14-00111）的资助。作者感谢 Anton Plekhanov（PRMU）在视频制作方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>项目/设备
细胞培养箱Sanyo37°37°C、5% CO2、湿润环境
Centrifuge 5702 REppendorf5703000010
ImageJ 1.53cWayne Rasband （美国国立卫生研究院）
FLIM 模块 Simple Tau 152 TCSPC（用于 LSM 880）贝克尔 & Hickl GmbH
层流罩赛默飞世尔科技
Leica 显微镜 DFC290Leica Microsystems
LSM 880 共聚焦显微镜卡尔·蔡司
Ti:Sapphire飞秒激光器Mai TaiSpectra Physics
显微镜培养箱 XLmulti S DARK LSPeCon GmbH273-800 050
移液器赛多利斯 mLINE体积 0.5–10 μL；20-200 μL；100-1000 μL
油浸式物镜 C-Apochromat 40×/1.2 NA W Korr  （在 LSM 880 中）卡尔·蔡司421767-9971-790
Power-Tau 152 模块与 HPM-100-40 探测器贝克尔&Hickl GmbH
SPCImage 软件贝克尔 & Hickl GmbHSPC 9.8；SPCImage 8.3
ZEN 软件卡尔·蔡司ZEN 2.1 SP3（黑色版），版本 14.0.0.201
<强>试剂/材料
5-氟尿嘧啶Medac GmbH3728044
DMEMGibco，Life Technologies31885023
DMSOPanEcoF135
FBSHycloneA3160801
FluoroBright DMEMGibco，Life TechnologiesA1896701
汉克’不含 Ca²⁺/Mg²⁺ 的溶液Gibco，Life Technologies14175
L-谷氨酰胺PanEcoF032
哺乳动物细胞HCT116、CT26、HeLa Kyoto、huFB
分子转子 BODIPY 2由伦敦帝国理工学院Marina Kuimova课题组合成并提供
青霉素/链霉素PanEcoA065
带盖玻片底的荧光培养皿World Precision Instruments, Inc
0.25% 胰蛋白酶-EDTAPanEcoP034
Versen缓冲液PanEcoR080p

参考文献

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