通透化小鼠皮层神经元中的核转运实验

摘要

我们建立了一种可靠的方法，可选择性地对原代小鼠皮层神经元的质膜进行通透化处理，用于高通量自动化分析神经元的核质运输。

摘要

核质运输的紊乱在神经退行性疾病发病机制中的作用日益受到关注。此外，人们对核孔复合体结构在不同细胞类型间的特异性差异有了越来越多的认识，这促使人们需要针对神经元的特点对核运输方法进行优化。通透化细胞检测法通过皂苷选择性地穿孔细胞质膜，被广泛用于研究永生化细胞系中的被动性和主动性核运输，但尚未应用于神经元培养。在我们最初的尝试中，观察到即使在低浓度皂苷处理下，原代小鼠皮层神经元的核膜完整性也迅速丧失。我们推测，神经元的核膜可能因失去细胞质的支持而表现出独特的脆弱性。在测试了多种提高核稳定性的方法后，我们发现，在含有高浓度牛血清白蛋白垫层的低渗裂解条件下，核完整性保持最佳。采用该方法制备的神经元细胞核能够以能量依赖的方式稳定地导入重组荧光运载物，从而可通过高内涵显微镜结合自动化分析手段对核输入过程进行分析。我们预计该方法将广泛适用于原代神经元中被动性和主动性核运输的研究。

引言

核质运输（即蛋白质和RNA在细胞核与细胞质之间受调控的转运过程）的紊乱 increasingly 被认为与神经退行性疾病的发生机制有关（近期综述见¹）。我们及其他研究团队已在C9orf72相关肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）、阿尔茨海默病以及亨廷顿病的尸检组织和动物模型中，报道了核质运输装置在结构和功能上的破坏^2,3,4,5。核质运输紊乱在神经退行过程中的机制及其功能后果，以及潜在的治疗干预策略，目前仍是持续研究的领域。

核孔是由约30种核孔蛋白组成的大型跨膜复合物，允许小分子在核膜上自由扩散，但通过中央通道中富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）的核孔蛋白形成的通透性屏障，逐渐限制分子量大于>40 kD的货物分子通过⁶。携带核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）序列的较大货物分子则通过核转运受体（importin和exportin）以及小GTP酶Ran在核膜两侧形成的陡峭浓度梯度，实现主动的、受体介导的跨孔转运（近期综述见⁷）。目前已开发出多种....

方案

首先，本方案描述了原代神经元培养物的制备（步骤1）和转运实验材料的准备（步骤2），随后是转运实验本身（步骤3-4）以及图像采集与分析（步骤5）。此处描述的所有方法均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（ACUC）批准。

1. 小鼠原代皮层神经元培养

1. 配制储备液。
   1. 解剖缓冲液：将50 mL 10x HBSS与15 mL 1 M葡萄糖（溶于dH₂O）混合₂O）、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠和 5 mL 100 倍青霉素-链霉素，用 dH₂O 定容至 500 mL₂O. 无菌过滤后，于 4 °C 保存。
   2. 木瓜蛋白酶：用解剖缓冲液将木瓜蛋白酶稀释至 30 mg/mL。4 °C 保存。
   3. DNase：用解剖缓冲液将DNase I稀释至10 mg/mL。分装后于-20 °C保存。
   4. 铺板培养基：向神经基础培养基中加入5%胎牛血清（FBS）、2% B-27、1% Glutamax和1%青霉素-链霉素。经无菌过滤后，4 °C保存。
   5. 培养基：向Neurobasal培养基中加入2% B-27、1% Glutamax和1%青霉素-链霉素。4 °C保存。
2. 包被平板。
   1. 用多聚-D-赖氨酸（20 µg/mL）和层粘连蛋白....

结果

质膜的选择性透化（图1A）是本实验方案中最关键的步骤，在进行核输入分析之前必须确认其效果。由于每次细胞培养制备存在差异，通常需在第3步中所述，预先进行初步滴定实验，以确定低渗Tris-HCl缓冲液和BSA垫层针对该批次细胞的最佳浓度。透化不足或过度的细胞可通过共聚焦显微镜（图1B）轻易识别：透化不足时，70 kD葡聚糖无法进入细胞质区室；透化过度时，葡聚糖则同时出现在细胞质和细胞核区室中。在理想条件下，大多数细胞（≥80%）显示70 kD葡聚糖围绕在核膜周围，但不穿过核膜。

在优化透化条件后，下一步关键阶段（步骤4）是验证荧光货物蛋白的核输入依赖于能量和转运受体（图2A）。缺乏ERM和WCE（输入蛋白和Ran循环蛋白来源）的对照组应几乎不显示或仅显示微量的荧光货物在细胞核内的累积（图2B、C）。相关核输入抑制剂应.......

讨论

上述方案提供了一种可靠且可重复的方法，用于选择性地透化原代小鼠皮层神经元的质膜，以进行核输入分析。本文展示了该方法在直接importin β货物（Rango）核输入分析中的应用，但该方法同样可用于分析多种荧光货物的被动和主动核输入过程。透化处理使得能够对转运反应进行精确操控，而这种操控在完整细胞中是难以实现的，我们最近在突变体研究中已对此进行了描述 C9orf72 与肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性相关的二肽重复蛋白（DPRs）¹⁴合成的DPR蛋白在启动核输入反应之前，先与运输裂解液共同孵育，以便分析含精氨酸DPR对核输入阻断作用的浓度和长度依赖性。在分馏实验中，通过在运输裂解液中包含或排除DPR诱导的聚集体，以分析其对核输入功能的影响。此外，还将DPR预先与细胞核共同孵育，以确定其对核孔通透性的影响。以上仅为该检测方法的若干变体示例，可用于研究在神经退行性疾病中常被涉及的无序结构蛋白和易聚集蛋白。由于这是一种人工体系 体外 在该检测系统的局限性范围内，应谨慎解读研究结果。

该实验方案的成功关键在于对细.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 M HEPES	Gibco	15630-080
10x HBSS	Gibco	14185-052
32% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714-S
96 孔光学玻璃板	CellVis	P96-1.5H-N
ATP 锂盐	Millipore Sigma	11140965001
B27	Gibco	17504-044
Bio-Rad 蛋白定量检测试剂盒 II	Bio-Rad	5000002
BL21(DE3) 大肠杆菌	NEB	C2527H
牛血清白蛋白 V 组分，热激处理，无脂肪酸	Sigma-Aldrich	3117057001
层析柱	Bio-Rad	7311550
肌酸激酶	Millipore Sigma	10127566001
磷酸肌酸	Millipore Sigma	10621722001
葡聚糖，Texas Red 标记，70,000 分子量	Thermo Fisher	D1864
DNase I	Sigma-Aldrich	DN25
E15-16 天定时交配的 C57BL/6J 雌性小鼠	Jackson Laboratory	000664
Excel	Microsoft	N/A
胎牛血清	Hyclone	SH30070.03
Glutamax	Gibco	35050-061
甘油	Thermo Fisher	15514011
GTP 锂盐	Millipore Sigma	11140957001
HALT 蛋白酶抑制剂（100x）	Thermo Fisher	78439
HEK293T 细胞	ATCC	CRL-3216
HIS-Select HF 镍亲和凝胶	Sigma-Aldrich	HO537
Hoechst 33342	Thermo Fisher	H1399
ImageExpress Micro 共聚焦高内涵成像系统	Molecular Devices	N/A	用于延时成像
咪唑	Millipore	I3386
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
IPTG	Corning	46-102-RF
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich	L2020
LB 肉汤	Grainger	31FZ62
LSM800 共聚焦显微镜	Zeiss	N/A	用于葡聚糖成像
MetaXpress 高内涵图像分析软件	Molecular Devices	N/A
Neurobasal 培养基	Gibco	21103
木瓜蛋白酶	Worthington	LS003126
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
多聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407
蛋白酶抑制剂混合物	Millipore Sigma	11873580001
Rango 质粒（pRSET Rango2/a1 + 连接子）	N/A	N/A	pK44，含有 N 端 6-His 标签
SOC（含分解代谢抑制的超优肉汤）培养基	Quality Biological	340-031-671
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
Spin-X UF 浓缩器（30K 分子量截留）	Corning	CLS431484
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	Gibco	25300054