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方法文章

通透化小鼠皮层神经元中的核转运实验

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DOI：

10.3791/62710

⸱

2021年7月9日

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins School of Medicine, 2Whiting School of Engineering, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

我们建立了一种可靠的方法，可选择性地对原代小鼠皮层神经元的质膜进行通透化处理，用于高通量自动化分析神经元的核质运输。

摘要

核质运输的紊乱在神经退行性疾病发病机制中的作用日益受到关注。此外，人们对核孔复合体结构在不同细胞类型间的特异性差异有了越来越多的认识，这促使人们需要针对神经元的特点对核运输方法进行优化。通透化细胞检测法通过皂苷选择性地穿孔细胞质膜，被广泛用于研究永生化细胞系中的被动性和主动性核运输，但尚未应用于神经元培养。在我们最初的尝试中，观察到即使在低浓度皂苷处理下，原代小鼠皮层神经元的核膜完整性也迅速丧失。我们推测，神经元的核膜可能因失去细胞质的支持而表现出独特的脆弱性。在测试了多种提高核稳定性的方法后，我们发现，在含有高浓度牛血清白蛋白垫层的低渗裂解条件下，核完整性保持最佳。采用该方法制备的神经元细胞核能够以能量依赖的方式稳定地导入重组荧光运载物，从而可通过高内涵显微镜结合自动化分析手段对核输入过程进行分析。我们预计该方法将广泛适用于原代神经元中被动性和主动性核运输的研究。

引言

核质运输（即蛋白质和RNA在细胞核与细胞质之间受调控的转运过程）的紊乱 increasingly 被认为与神经退行性疾病的发生机制有关（近期综述见1）。我们及其他研究团队已在C9orf72相关肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）、阿尔茨海默病以及亨廷顿病的尸检组织和动物模型中，报道了核质运输装置在结构和功能上的破坏2,3,4,5。核质运输紊乱在神经退行过程中的机制及其功能后果，以及潜在的治疗干预策略，目前仍是持续研究的领域。

核孔是由约30种核孔蛋白组成的大型跨膜复合物，允许小分子在核膜上自由扩散，但通过中央通道中富含苯丙氨酸-甘氨酸（FG）的核孔蛋白形成的通透性屏障，逐渐限制分子量大于>40 kD的货物分子通过6。携带核定位信号（NLS）或核输出信号（NES）序列的较大货物分子则通过核转运受体（importin和exportin）以及小GTP酶Ran在核膜两侧形成的陡峭浓度梯度，实现主动的、受体介导的跨孔转运（近期综述见7）。目前已开发出多种方法用于分析培养细胞中的核转运动态过程，包括内源性货物分子以及作为主要转运受体亚类底物的标记报告构建体的转运行为。这些方法已被成功应用于神经元研究2,5,8，可在完整活细胞环境中反映核转运过程的异常变化。然而，在活细胞检测中，直接操控核转运反应或将其与其他细胞过程隔离进行独立研究的能力仍然有限。

在透性化细胞检测中，细胞质膜被选择性地穿孔，胞质内容物被释放，而核膜和核孔复合体保持完整，能够执行被动或依赖能量的双向转运9,10。通过添加全细胞裂解液、胞质组分或纯化的重组核转运蛋白及其运载物，可轻松重建此类转运反应。因此，透性化细胞检测可用于多种生物化学或生物物理研究，包括递送与神经退行性疾病研究相关的重组蛋白或合成蛋白及RNA。

鉴于已有研究报道不同细胞类型在核孔复合体结构和转运动力学方面存在特异性差异11,12，我们旨在将透化细胞检测方法优化并应用于原代神经元培养体系。尽管该方法已被广泛用于永生化细胞系的核转运分析，但通过全面的文献检索，我们未发现任何已发表的研究成功实现了在保持核膜完整性的前提下对神经元质膜进行透化处理。大多数实验方案依赖于皂苷（digitonin）——一种靶向质膜特有胆固醇成分的去垢剂——来选择性穿孔质膜而保留核膜完整13。然而，我们在原代小鼠皮层神经元中初次尝试使用皂苷时，观察到核膜完整性立即丧失，表现为70 kD荧光葡聚糖扩散进入细胞核内。我们推测核膜破裂可能是由于细胞质支撑丧失导致的机械扰动所致，因此测试了多种优化策略，包括分子拥挤环境构建、细胞骨架稳定以及替代性的细胞裂解方法。本文中，我们详细描述了一种快速低渗透化方法，通过使用高浓度牛血清白蛋白（BSA）缓冲层保护神经元细胞核，从而实现对神经元核输入的下游分析。我们近期已应用该方法研究了C9orf72-ALS/FTD中二肽重复蛋白干扰核转运的机制14，并预期该方法将广泛适用于今后对原代神经元中被动性和主动性核转运过程的研究。

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方案

首先，本方案描述了原代神经元培养物的制备（步骤1）和转运实验材料的准备（步骤2），随后是转运实验本身（步骤3-4）以及图像采集与分析（步骤5）。此处描述的所有方法均经约翰斯·霍普金斯大学动物护理与使用委员会（ACUC）批准。

1. 小鼠原代皮层神经元培养

  1. 配制储备液。
    1. 解剖缓冲液：将50 mL 10x HBSS与15 mL 1 M葡萄糖（溶于dH₂O）混合2O）、5 mL 1 M HEPES、5 mL 100 mM 丙酮酸钠和 5 mL 100 倍青霉素-链霉素，用 dH₂O 定容至 500 mL2O. 无菌过滤后，于 4 °C 保存。
    2. 木瓜蛋白酶：用解剖缓冲液将木瓜蛋白酶稀释至 30 mg/mL。4 °C 保存。
    3. DNase：用解剖缓冲液将DNase I稀释至10 mg/mL。分装后于-20 °C保存。
    4. 铺板培养基：向神经基础培养基中加入5%胎牛血清（FBS）、2% B-27、1% Glutamax和1%青霉素-链霉素。经无菌过滤后，4 °C保存。
    5. 培养基：向Neurobasal培养基中加入2% B-27、1% Glutamax和1%青霉素-链霉素。4 °C保存。
  2. 包被平板。
    1. 用多聚-D-赖氨酸（20 µg/mL）和层粘连蛋白（1:100）在无菌dH₂O中包被光学玻璃底96孔板2O. 将培养板放入培养箱中过夜。
    2. 在解剖当天，用无菌去离子水冲洗孔板三次2O 并替换 用Neurobasal培养基平衡，于培养箱中孵育至少30分钟。
  3. 解剖并消化皮层组织。
    注意：解剖操作应在洁净台中进行，并使用经高压灭菌的工具，以防止培养污染。
    1. 通过颈椎脱位法处死 E15-16 期的 C57BL/6J 孕鼠。用 70% 乙醇喷洒腹部。操作需迅速。使用剪刀和有齿镊进行腹正中切口，取出子宫，然后将胚胎从羊膜囊中转移至培养皿中。用剪刀剪下胚胎头部，并将头部分离收集至含有解剖缓冲液的 10 cm 培养皿中。
    2. 在解剖显微镜下，使用精细镊子去除颅骨并剥离脑膜。将完整脑组织转移至含有解剖缓冲液的新鲜10 cm培养皿中。分离大脑半球，并移除皮层下结构。
    3. 用无菌手术刀将皮层组织切碎，转移至含有5 mL解离缓冲液的锥形管中。加入100 µL木瓜蛋白酶（储存液浓度30 mg/mL，终浓度0.6 mg/mL）和50 µL DNase（储存液浓度10 mg/mL，终浓度0.1 mg/mL）。在37 °C水浴中消化10分钟。
      ​注意：消化时间超过10分钟将不利于细胞存活。
    4. 移除上清液，用 10 mL 铺板培养基洗涤两次以终止消化。每次洗涤之间让组织依靠重力自然沉降。
    5. 用P1000移液器在2 mL铺板培养基中轻柔吹打约20次，直至组织块基本消失。加入另外8 mL铺板培养基，使总体积达到约10 mL，随后将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤。
  4. 接种并维持神经元培养。
    1. 以 200 x 离心 g 5 分钟。将细胞重悬于 预热的铺板培养基。计数细胞，并用铺板培养基稀释至500,000个细胞/mL。轻轻颠倒混匀，转移至无菌多通道储液槽中。
    2. 吸出孔中的Neurobasal培养基，立即使用多通道移液器每孔加入100 µL细胞悬液（50,000个细胞/孔）。注意勿使包被孔干燥。
    3. 解剖后24小时，用饲喂培养基更换50%的培养液。此后每隔一天更换50%培养基，持续至第5–7天进行实验 体外 检测方法

2. 核转运实验组分的制备

  1. 转运缓冲液（TRB，改编自15）
    1. 配制5x TRB：将100 mM HEPES、550 mM KOAc、10 mM Mg(OAc)2、25 mM NaOAc、2.5 mM EGTA 和 1.25 M 蔗糖溶解于 dH2O 中，调节pH至7.3，并将缓冲液储存在4 °C。
    2. 在转运实验当天配制1x TRB-BSA：用dH2O稀释5x TRB，加入无EDTA蛋白酶抑制剂混合物、2 mM DTT 和 50 mg/mL BSA。
  2. 能量再生混合物（ERM，改编自9,16）
    1. 配制20x ERM：将2 mM ATP锂盐、2 mM GTP锂盐、80 mM磷酸肌酸和400 U/mL肌酸激酶溶解于1x TRB中。
    2. 将单次使用分装样品在-20 °C冷冻保存 。
  3. 全细胞提取物（WCE，转运受体 和Ran循环蛋白的来源）
    注意：可根据实验目的选择使用胞质提取物或全细胞提取物（WCE）。此处描述的是初始神经元转运实验中所用的WCE制备方法10。
    1. 在十五个150 mm培养皿中将HEK293T细胞培养至融合。用胰蛋白酶-EDTA消化，重悬于含10%胎牛血清的培养基中以抑制胰蛋白酶活性，然后在200 x g离心5分钟收集细胞。将细胞重悬于10 mL冰上预冷的1x TRB中（新鲜添加蛋白酶抑制剂混合物）。
    2. 在冰上进行超声处理，使用手持探头超声仪，3次，每次10个脉冲。在4 °C下以14,000 x g离心15分钟以澄清裂解液。
    3. 测定蛋白浓度（目标为8–10 mg/mL），并在液氮中快速冷冻单次使用分装样品，随后于-80 °C保存。
  4. 重组核输入货物蛋白
    注意：步骤3–5中的转运方案可适用于任何荧光标记的核转运货物蛋白，用于研究特定的主动或被动核转运通路。此处描述的是Rango（Ran调控的importin β货物蛋白）的表达与核输入过程。Rango由importin α1的importin β结合域构成，两侧分别连接荧光蛋白CyPet和YPet14,17。Rango是一种多功能传感器，既可用于FRET实验，也可用于核输入检测，在后者中作为直接的importin β货物蛋白发挥作用。
    1. 通过热激法将Rango质粒（含有N端6-His标签）转化至E. coli BL21(DE3)细胞中。操作如下：将50 µL BL21(DE3)细胞在冰上解冻，加入100–200 ng质粒DNA，轻弹管壁4–5次混匀，冰上孵育30分钟，随后置于42 °C水浴中40秒，立即转移回冰上继续孵育2–5分钟。
    2. 加入900 µL室温SOC培养基，37 °C摇床培养1小时，然后将菌液涂布于预热的琼脂平板（1.5%琼脂，LB培养基，100 µg/mL氨苄青霉素）。37 °C过夜培养。平板可在4 °C保存最多1周，或立即用于蛋白表达。
    3. 开始蛋白表达：从BL21(DE3)平板上挑取适量菌落（约3–10个），接种至3个装有25 mL起始培养液的50 mL离心管中。37 °C摇床过夜培养后，选择OD600 nm < 1.0的培养物，用于接种1 L LB培养基，使用2.8 L无挡板Fernbach摇瓶。37 °C培养至OD600 nm = 0.1–0.3。
      注意：使用存放时间较长的BL21(DE3) LB琼脂平板或高密度起始培养物（OD600 nm >1.0）可能会降低蛋白制备的产量和纯度。
    4. 将培养物置于冰上冷却至室温（22–25 °C），加入0.3 mM IPTG（终浓度）诱导蛋白表达，在室温下以80–120 rpm摇床孵育12–14小时。
    5. 离心收集细胞（6,000 x g，15分钟，4 °C），重悬于30 mL冰上预冷的含10 mM咪唑的PBS缓冲液（pH 7.4）中，并添加无EDTA蛋白酶抑制剂混合物。使用冰上预冷的French高压破碎仪裂解两次，然后在4 °C下以16,000 x g离心40分钟澄清裂解液。
    6. 将裂解液与高流速镍亲和琼脂糖树脂孵育（30–60分钟，4 °C），每升E. coli培养物使用1 mL树脂。将树脂装入层析柱，用10–20倍柱体积的冰上预冷的含10 mM咪唑/PBS（pH 7.4）缓冲液洗涤。使用25 mM至200 mM咪唑/PBS（pH 7.4）梯度洗脱Rango，每步使用5倍柱体积的洗脱缓冲液。
    7. 通过 SDS-PAGE分析选择纯度最高的组分并合并。
    8. 配制XB缓冲液：将10 mM HEPES、100 mM KCl、10 mM CaCl2、1 mM MgCl2 和 50 mM蔗糖溶解于dH2O中，调节pH至7.7。
    9. 将蛋白在XB缓冲液中透析，并使用截留分子量为30 kD的超滤装置，在4 °C下以7500 x g离心浓缩 。
    10. 采用Bradford法或其他合适方法测定蛋白浓度，在液氮中快速冷冻单次使用分装样品，随后于-80 °C保存。

3. 确定最佳细胞质膜通透化条件

注意：由于每批神经元之间存在差异，需针对每批神经元优化透化条件。该步骤应在进行核转运实验当天完成。

  1. 在塑料96孔分步板中，用Tris-HCl（pH 7.5）进行系列稀释（以引起渗透性肿胀），浓度分别为0 µM、10 µM、20 µM和40 µM，每种浓度均设置三种BSA浓度：50 mg/mL、100 mg/mL和150 mg/mL（用于模拟分子拥挤/提供机械支持）。将溶液预热至37 °C。
  2. 用预热的PBS冲洗神经元一次。吸除PBS，加入分步板中的Tris/BSA溶液。放回培养箱孵育4分钟。
  3. 从培养箱取出后，将培养板置于冰上。用1x TRB-BSA（按步骤2.1.2配制）冲洗两次，每次5分钟。
  4. 最后一次冲洗后，在1x TRB-BSA中加入70 kD的Texas Red标记葡聚糖（0.6 mg/mL）和Hoechst染料（1:10,000）。室温避光静置15分钟。
  5. 使用共聚焦显微镜成像，确定在何种缓冲条件和BSA浓度下细胞膜通透化比例最高，同时核膜仍能限制70 kD葡聚糖进入（目标为≥80%）。在后续实验中采用该条件。

4. 核输入实验

  1. 准备转运反应
    注意：为了使板上所有反应能够同时启动，在神经元透化处理前，需在冰上使用塑料96孔暂存板配制反应混合液。每种条件至少进行两次技术重复。每次实验板上均需设置对照。
    1. 配制基础反应混合液，包含2.5 mg/mL WCE、1× ERM、荧光示踪货物（200 nM Rango）和Hoechst 33342（10 mg/mL，1:10,000），溶于1× TRB-BSA中，每孔需50 µL。可选：加入70 kD Texas red标记的葡聚糖，以便在转运反应过程中监测核孔完整性，但需注意核内葡聚糖排除的成像需要共聚焦显微镜。
      注意：所提供的WCE浓度是实验优化的一个合理起始点。应对每批WCE进行经验性测试，以确定实现目标货物高效核输入所需的最优浓度。避免合并使用不同批次WCE制备的重复实验数据，因为核输入效率可能随批次变化。
    2. 设置对照组，包括（1）仅货物对照：Rango，不含WCE或ERM；（2）抑制剂对照：荧光示踪货物、ERM、WCE及100 µM importazole（IPZ，一种importin β18的小分子抑制剂）。也可选用0.8 mg/mL的小麦胚芽凝集素（WGA）19作为替代抑制剂。
      注意：在含有WCE的反应体系中，需将抑制剂预先平衡至少30分钟后再启动转运反应。为达到最大抑制效果，在透化后的洗涤步骤中，相应孔也应加入抑制剂。
  2. 透化并洗涤神经元
    1. 根据步骤3中确定的最优、批次特异性的方案对神经元进行透化处理。
    2. 将培养板从培养箱中取出，立即置于冰上。用1× TRB-BSA洗涤两次，每次5分钟。在指定孔的洗涤液中加入抑制剂。
  3. 进行转运反应。
    1. 最后一次洗涤后，吸除1× TRB-BSA。迅速使用多通道移液器（每孔50 µL）将预混的转运反应液加入已透化的细胞中。
    2. 立即将培养板放入室温下的高内涵显微镜中，开始延时成像（见步骤4.4），或在避光条件下将培养板置于实验台上，让反应进行至所需时间（例如30–120分钟），然后进行固定和成像。
    3. 如需固定，使用4%多聚甲醛/PBS固定15分钟，用PBS洗涤两次，每次5分钟，再转移至50%甘油/PBS中以备后续成像。固定后的培养板应避光保存于4 °C（可稳定保存一周或更长时间）。
  4. 活细胞成像
    注意：此阶段可采用任何常用的图像采集与分析方法。
    1. 将培养板放入高内涵显微镜中。先运行一个测试板，以优化并保存成像参数，包括放大倍数、焦距、曝光时间（Hoechst和FITC通道）以及时间间隔，然后再运行实验样本。将参数保存，以便后续每块板加载时重复使用。
      注意：为进行定量分析，荧光核输入货物（FITC）的曝光时间应设定为远低于稳态或最终时间点的饱和水平。通过测试板确定该参数，目标为半最大饱和值，以便在不同实验条件下允许荧光强度的变化。对每一帧和每个时间点均采集Hoechst图像，以便在后续自动分析中识别细胞核。
    2. 如有需要，使用Hoechst作为对焦波长调整焦距偏移，并运行成像程序。每5分钟采集一次图像，持续30分钟。根据成像速度和所研究的核输入反应动力学，可适当调整时间间隔和反应时长。

5. 图像分析

  1. 在显微镜下 评审板 对话框中，打开代表性帧的Hoechst和FITC图像。在 运行分析 标签，选择 转位增强型 模块，并配置设置。将 Hoechst 设为区室图像，FITC 设为转位探针图像。
  2. 在“分隔区域”中，调整近似的细胞核宽度、局部背景以上的强度，以及最小/最大面积。激活 自动分离相互接触的区域 因为神经元 tends to cluster。通过选择查看结果 测试运行调整参数设置，以最大限度提高神经元核识别的准确性，同时限制非神经元核或碎片的错误纳入。
    注意：如果存在胶质细胞污染，通常可根据细胞核大小在此步骤排除。最佳区室识别参数的确定需要在准确性和细胞数量之间进行权衡，必须根据具体实验、细胞类型和培养密度通过实验经验设定。严格参数会遗漏较多细胞，但错误较少；宽松参数则包含性更强，但错误率更高。若存在不同细胞群体（即 如果实验中包含可能影响细胞核大小的疾病突变体或处理因素，我们建议设置足够宽泛的大小/强度参数，以涵盖所有实验条件，从而避免在同一实验中使用多组参数。
  3. 为避免核边缘伪影，定义区域 在由Hoechst染色定义的区室边缘内侧和外侧分别测量数个像素。根据放大倍数和像素合并设置，将内侧区域距离设为2-4个像素，外侧区域距离设为1-2个像素。调整外侧区域宽度（1-2个像素）。
  4. 选择所需的背景估计方法（默认值为 自动恒定 建议）。在 配置数据记录器选择所需的输出参数，包括内圈平均强度、外圈平均强度以及内外圈平均强度比值（核质比，N/C 比值）。保存分析参数。
    注意：强烈建议在每个实验中设置内部阳性和阴性对照，以确保实验参数能够最大程度地敏感检测目标生物学事件。
  5. 使用 培养皿工具 对话框，用于使用已保存的参数对选定的板进行分析，并导出测量结果。
  6. 按处理条件对数据进行审查和汇总。选项：应用筛选条件以剔除非生理学数据，例如探针强度等于 0 以及核质比（N/C 比）的极端值 <0.1 和 >100）。在所有条件和实验中均等地应用任何滤镜。
  7. 作为对基线荧光的额外校正，将数据归一化至未添加裂解物和内质网的对照孔。为便于在生物学重复样本（即独立的神经元培养制备样本）之间进行比较，将最终的核输入数据表示为0时间点的百分比。

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结果

质膜的选择性透化（图1A）是本实验方案中最关键的步骤，在进行核输入分析之前必须确认其效果。由于每次细胞培养制备存在差异，通常需在第3步中所述，预先进行初步滴定实验，以确定低渗Tris-HCl缓冲液和BSA垫层针对该批次细胞的最佳浓度。透化不足或过度的细胞可通过共聚焦显微镜（图1B）轻易识别：透化不足时，70 kD葡聚糖无法进入细胞质区室；透化过度时，葡聚糖则同时出现在细胞质和细胞核区室中。在理想条件下，大多数细胞（≥80%）显示70 kD葡聚糖围绕在核膜周围，但不穿过核膜。

在优化透化条件后，下一步关键阶段（步骤4）是验证荧光货物蛋白的核输入依赖于能量和转运受体（图2A）。缺乏ERM和WCE（输入蛋白和Ran循环蛋白来源）的对照组应几乎不显示或仅显示微量的荧光货物在细胞核内的累积（图2B、C）。相关核输入抑制剂应...

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讨论

上述方案提供了一种可靠且可重复的方法，用于选择性地透化原代小鼠皮层神经元的质膜，以进行核输入分析。本文展示了该方法在直接importin β货物（Rango）核输入分析中的应用，但该方法同样可用于分析多种荧光货物的被动和主动核输入过程。透化处理使得能够对转运反应进行精确操控，而这种操控在完整细胞中是难以实现的，我们最近在突变体研究中已对此进行了描述 C9orf72 与肌萎缩侧索硬化症和额颞叶变性相关的二肽重复蛋白（DPRs）14合成的DPR蛋白在启动核输入反应之前，先与运输裂解液共同孵育，以便分析含精氨酸DPR对核输入阻断作用的浓度和长度依赖性。在分馏实验中，通过在运输裂解液中包含或排除DPR诱导的聚集体，以分析其对核输入功能的影响。此外，还将DPR预先与细胞核共同孵育，以确定其对核孔通透性的影响。以上仅为该检测方法的若干变体示例，可用于研究在神经退行性疾病中常被涉及的无序结构蛋白和易聚集蛋白。由于这是一种人工体系 体外 在该检测系统的局限性范围内，应谨慎解读研究结果。

该实验方案的成功关键在于对细...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 NINDS K08NS104273（资助 L.R.H.）支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HEPESGibco15630-080
10x HBSSGibco14185-052
32% 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15714-S
96 孔光学玻璃板CellVisP96-1.5H-N
ATP 锂盐Millipore Sigma11140965001
B27Gibco17504-044
Bio-Rad 蛋白定量检测试剂盒 IIBio-Rad5000002
BL21(DE3) 大肠杆菌NEBC2527H
牛血清白蛋白 V 组分，热激处理，无脂肪酸Sigma-Aldrich3117057001
层析柱Bio-Rad7311550
肌酸激酶Millipore Sigma10127566001
磷酸肌酸Millipore Sigma10621722001
葡聚糖，Texas Red 标记，70,000 分子量Thermo FisherD1864
DNase ISigma-AldrichDN25
E15-16 天定时交配的 C57BL/6J 雌性小鼠Jackson Laboratory000664
ExcelMicrosoftN/A
胎牛血清HycloneSH30070.03
GlutamaxGibco35050-061
甘油Thermo Fisher15514011
GTP 锂盐Millipore Sigma11140957001
HALT 蛋白酶抑制剂（100x）Thermo Fisher78439
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
HIS-Select HF 镍亲和凝胶Sigma-AldrichHO537
Hoechst 33342Thermo FisherH1399
ImageExpress Micro 共聚焦高内涵成像系统Molecular DevicesN/A用于延时成像
咪唑MilliporeI3386
ImportazoleSigma-AldrichSML0341
IPTGCorning46-102-RF
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
LB 肉汤Grainger31FZ62
LSM800 共聚焦显微镜ZeissN/A用于葡聚糖成像
MetaXpress 高内涵图像分析软件Molecular DevicesN/A
Neurobasal 培养基Gibco21103
木瓜蛋白酶WorthingtonLS003126
青霉素-链霉素Gibco15140-122
多聚-D-赖氨酸Sigma-AldrichP6407
蛋白酶抑制剂混合物Millipore Sigma11873580001
Rango 质粒（pRSET Rango2/a1 + 连接子）N/AN/ApK44，含有 N 端 6-His 标签
SOC（含分解代谢抑制的超优肉汤）培养基Quality Biological340-031-671
丙酮酸钠Gibco11360-070
Spin-X UF 浓缩器（30K 分子量截留）CorningCLS431484
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）Gibco25300054

参考文献

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