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方法文章

用于树突棘研究的连续块面扫描电子显微镜技术（SBEM）

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DOI：

10.3791/62712

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2021年10月2日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Imaging Tissue Structure and Function, Nencki Institute of Experimental Biology of Polish Academy of Sciences, 2Laboratory of Molecular Basis of Behavior, Nencki Institute of Experimental Biology of Polish Academy of Sciences

本文内容

摘要

连续块面扫描电子显微镜（SBEM）用于对小鼠海马区的树突棘进行成像和分析。

摘要

三维电子显微镜（3D EM）能够以纳米级分辨率分析树突棘的形态学参数。此外，某些树突棘的特征，例如棘的体积和突触后密度（PSD）（代表突触的突触后部分）、突触前终末的存在、滑面内质网或PSD的非典型形态（例如多神经支配的树突棘），只能通过3D EM进行观察。通过采用连续块面扫描电子显微镜（SBEM），相比传统的连续切片方法，可以更简便且更可重复地获得3D EM数据。本文展示了如何制备小鼠海马组织样本用于SBEM分析，以及该方案如何与树突棘的免疫荧光研究相结合。温和的固定灌注方法使得我们可以在脑组织的一半进行光学显微镜下的免疫荧光研究，而另一半则用于SBEM制样。该方法减少了实验所需的动物数量。

引言

中枢神经系统中大多数兴奋性突触位于树突棘上——树突棘是神经元膜上的微小突起。这些突起形成了隔离的生化区室，调控细胞内信号转导。树突棘和突触的结构可塑性与突触效能的功能性变化密切相关，而突触效能的变化是学习和记忆等重要过程的基础1,2。需要注意的是，只有电子显微镜（EM）技术能够确定树突棘是否具有来自轴突的突触前输入。研究突触后密度（PSD）的形态（代表突触的突触后部分）、树突棘的尺寸、轴突终扣的大小与形状等超微结构细节，也需要电子显微镜的高分辨率。此外，利用电子显微镜还可以观察突触及其周围环境的结构。

得益于成像和计算技术的进步，现已能够重建完整的神经环路。体积电子显微镜技术，如连续切片透射电子显微镜（ssTEM）、连续块面扫描电子显微镜（SBEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM），常被用于神经元环路的重建3。

在我们的研究中，SBEM 方法已成功用于研究小鼠海马组织样本及脑片培养样本中树突棘和突触后密度（PSDs）的结构可塑性4,5。SBEM 技术基于在扫描电镜腔室内安装微型超薄切片机6,7,8,9。首先对样品块的表面进行成像，随后由超薄切片机按设定深度切去一层，暴露出新的块面，再对该新块面进行成像，如此循环往复8。因此，仅保留块面的图像，而被切下的薄片则作为碎片丢失。正因如此，SBEM 被称为一种破坏性技术，意味着无法对同一位置进行重复成像。然而，这种在块面上进行的破坏性方法的优势在于，不会出现切片扭曲或丢失的问题，而这些问题可能严重影响数据质量和数据分析结果3。此外，SBEM 能够在高分辨率下实现相对较大的视场成像（> 0.5 mm × 0.5 mm）3。

为了使用扫描电镜背散射电子成像技术（SBEM），由于采用背散射电子探测器进行图像采集，样品必须按照一种专用的、具有高对比度的制备方案进行处理。本文展示了如何依据Deerinck10（国家显微镜与成像研究中心（NCMIR）方法）开发的流程，采用20世纪80年代建立的还原锇-硫碳酰肼-锇（rOTO）染色法进行样品制备8,11。此外，我们还引入了一种两步固定方法，通过温和的灌注固定，使得同一脑组织既可用于光学显微镜下的免疫荧光研究，也可用于SBEM分析。

在该方案中，小鼠脑组织首先用温和的固定剂进行初步固定，然后切成两半，其中一个半脑进行后固定并用于免疫荧光（IF）制备，另一个半脑则用于电镜（EM）研究（图1）。

用于固定、后固定、振动切片、扫描电镜成像和三维重建的小鼠脑分析示意图。
图 1。用于SBEM分析的树突棘样品制备流程示意图。 小鼠经处死后，用温和的初固定液进行灌流固定。将脑组织切成两半，其中一侧半脑使用专用于免疫荧光（IF）的固定液进行后固定，经冷冻保护后，用恒冷箱切片机切片，并用于免疫荧光研究；另一侧半脑则使用电镜专用固定液进行后固定，用振动切片机切片后制备用于电镜研究。用于SBEM研究的脑片经染色增强反差后，平埋于树脂中，随后将海马CA1区固定在样品钉上，并使用SBEM进行成像（图 1）。协议中以黄色框标示的部分在视频中进行了展示。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

研究严格遵守波兰神经研究所的指导原则，并获得当地伦理委员会的许可。实验遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）、波兰动物保护法，并经华沙第一地方伦理委员会批准。所有操作均尽可能减少使用动物数量并减轻其痛苦。

警告：由于所用试剂具有危险性，以下描述的所有操作必须在实验室通风橱中进行。需要采取个人安全防护措施，如佩戴手套、实验服、护目镜和面罩。

1. 灌注固定液的配制（0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4，含 2% wt/vol 多聚甲醛（PFA）和 0.5% vol/vol 戊二醛（GA））

注意：固定液需在使用当天配制，且存放时间不得超过3小时。若时间不足，可提前一天配制0.1 M磷酸盐缓冲液中的2% PFA，于4 °C保存，并在灌流前临时加入新鲜的GA。

  1. 取 400 mL 无菌双蒸水（ddH2O），使用搅拌加热板加热至 60 °C。然后加入 20 g 多聚甲醛（PFA），逐滴加入 1 M NaOH，直至 PFA 完全溶解，随后使溶液冷却。
  2. 加入 500 mL 0.2 M 磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）。
  3. 过滤溶液以去除任何沉淀物，并将其冷却至 4 °C。
  4. 在灌注前立即向溶液中加入 20 mL 25% 戊二醛（GA），然后用 ddH2O 定容至 1 L。

2. SBEM用灌注后固定液的制备（0.1 M磷酸盐缓冲液中含2% 质量/体积PFA和2.5% 体积/体积GA，pH 7.4）

  1. 取50 mL灌注固定液（0.1 M磷酸缓冲液中含2% PFA和0.5% GA）。
  2. 加入5 mL 25% GA。

3. 免疫荧光染色用灌流后固定液的制备（磷酸盐缓冲液（PBS）中含4% PFA）

  1. 根据制造商说明，将1× PBS（pH 7.4）的片剂溶解于纯化去离子水（H2O）中。
  2. 使用搅拌加热板将溶液加热至60 °C，并加入40 g PFA。
  3. 逐滴加入1 M NaOH，直至PFA完全溶解，然后让混合物冷却。
  4. 用1 M HCl将溶液pH调节至7.5，再用H2O定容至1 L。
  5. 过滤溶液以去除任何沉淀物。

4. 动物经心脏灌注

注意：所有含PFA和GA的废液必须根据当地法规收集并储存处理。麻醉和灌注操作应遵循当地法规。本方案中使用了成年3月龄及20±1月龄的雌性Thy1-GFP(M)小鼠（Thy1-GFP +/-）12，其在部分谷氨酸能神经元中表达绿色荧光蛋白（GFP），但也可使用其他品系。动物在实验生物学奈恩基研究所动物房中以C57BL/6J为背景进行杂合子繁育。

  1. 灌注前，通过腹腔注射（27号针头）给予小鼠氯胺酮/赛拉嗪混合物进行麻醉（氯胺酮剂量最高为90 mg/kg体重，赛拉嗪剂量为10 mg/kg体重）。
    1. 通过检测疼痛刺激（捏压）反应和角膜反射（眨眼）来评估麻醉深度是否足够。
  2. 20分钟后，通过腹腔注射（27号针头）给予戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）。
  3. 按照Gage等人13描述的灌注手术方案对小鼠进行灌注（见第4点；图5-6）。使用灌注泵，先以0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）灌注3分钟（30 mL），随后用含2% PFA和0.5% GA的0.1 M PB（pH 7.4）继续灌注6分钟（80 mL）。
    1. 小心地从颅骨中取出脑组织并将其分为两半（参见Gage等，201213中的图9-10）。将其中一半放入含有固定液的样品瓶中用于SBEM分析，另一半放入含4% PFA/PBS的样品瓶中用于免疫荧光染色。
    2. 将脑半球在4 °C下固定过夜。

5. 用于电子显微镜的脑切片制备

  1. 选择振动切片机的设置（刀片行进速度：0.075 mm/s，切割频率：80 Hz）。
  2. 将切片室放入支架中，将其固定到振动切片机上，并在周围放置冰块。然后将剃刀刀片装入振动切片机的刀片夹中。
  3. 使用勺子或类似工具，将冷却的脑组织（背侧朝上）放置在坚固的切割表面（例如玻璃培养皿盖）上。为制备海马体的冠状切片，使用剃刀刀片或手术刀在大脑半球与小脑之间进行垂直切割，从而去除小脑。嗅球也可一并去除。
  4. 在振动切片机的干燥平台上涂抹氰基丙烯酸酯胶水。
  5. 用镊子夹取脑组织，并在滤纸上小心地将其表面擦干。
  6. 将脑半球用胶水粘附在靠近切割刀片的平台上，前端朝上。将平台固定到支架后，立即注入冰冻的0.1 M磷酸缓冲液（PB），pH 7.4。如果垂直切割操作正确，脑半球将直立固定，形成90°角，从而可进行包含海马体的对称冠状切片。确保脑组织完全浸没在PB中。
  7. 将振动切片机刀片置于脑半球前方，并将其下降至脑半球的冠状面。再向尾侧方向降低400 µm，开始切片。持续切片，直至前两片完全与组织块分离。
  8. 收回刀片，再向尾侧降低100 µm，然后再次切片。
  9. 当海马体变得可见时（可参考小鼠脑图谱Paxinos和Franklin，200414），使用小号画笔或扩口的塑料巴斯德吸管收集切片。
  10. 将切片转移至盛有冷0.1 M PB（pH 7.4）的12孔板中。
  11. 在盛有0.1 M PB（pH 7.4）的玻璃培养皿中，使用剃刀刀片或手术刀解剖海马体，并将其放入含有相同磷酸缓冲液的玻璃小瓶中。
    ​注意：如需长期保存切片，可在0.1 M PB中添加0.05%叠氮化钠（NaN3）。

6. 用于免疫染色的脑组织样本制备

  1. 在通风橱中用 4% PFA/PBS 溶液固定过夜后，将脑组织放入冷冻保护液（含 0.05% NaN3 的 30% 蔗糖 PBS 溶液）中，于 4 °C 保存 2 天（直至组织沉底）。
  2. 配制防冻溶液（15% 蔗糖/30% 乙二醇/0.05% NaN3/PBS）。
  3. 将冷冻切片机柜内温度设定为 -19 °C，并确保在继续操作前已达到该温度。切片过程中，确保柜内温度维持在 -18 °C 至 -20 °C 之间。
  4. 使用勺子或类似工具，将冷却后的脑组织（背侧朝上）放置于坚固的切割表面（例如玻璃培养皿盖）。为制备海马体的冠状切片，使用剃刀刀片或手术刀在大脑半球与小脑之间进行垂直切割，从而去除小脑。
  5. 选取一个预冷的样品托盘，在冷冻架上用冷冻介质覆盖，并用镊子将脑半球固定在托盘上，使前端朝上，等待样品完全冻结。将样品托盘插入样品头中。
  6. 在冷冻室内的刀片架上安装刀片，并切出 40 µm 厚的切片。
  7. 用小号画笔将切片转移至盛有冷防冻溶液的 96 孔板中，并轻轻展开组织片（每次切片后收集一片，以防止其在切片室内丢失）。
    ​注意：脑组织或切片可在防冻溶液中于 -20 °C 长期保存。

7. 脑切片的免疫染色

注意：所有染色步骤均在24孔板中，于平台摇床上进行。

  1. 用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。
  2. 将切片置于 300 µL 封闭液（5% 正常驴血清（NDS）/0.3% Triton X-100）中，在旋转摇床上轻轻振荡孵育 1 小时。
  3. 将切片与抗 PSD-95 一抗在 5% NDS/0.3% Triton X-100/PBS 中稀释（1:500，每孔 300 µL），于 4 °C 过夜孵育。一抗的终浓度为 2 µg/mL。
  4. 用 0.3% Triton X-100/PBS 在室温（RT）下清洗切片三次，每次 6 分钟。
  5. 将切片与二抗在 300 µL 0.3% Triton X-100/PBS 中稀释（1:500），孵育 90 分钟。二抗的终浓度为 4 µg/mL。
  6. 用 PBS 清洗切片三次，每次 6 分钟。
  7. 使用封片剂将切片封固于载玻片上，然后加盖盖玻片。
  8. 使用共聚焦显微镜观察样本（63 × 油镜，NA 1.4，像素尺寸 0.13 µm × 0.13 µm）。
    ​注意：长期保存时，请将样本置于 4 °C，避免光照。

8. SBEM 样本制备

警告：由于所用试剂具有危险性，以下所有操作必须在实验室通风橱中进行。使用这些化学品前，应仔细阅读制造商提供的材料安全数据表，并咨询安全负责人了解当地相关规定，以确保安全操作和废液处理。

  1. 样品染色
    注意：切片洗涤和室温孵育应在温和振荡条件下进行（例如，使用平台摇床）。使用经高压灭菌的脱气水。
    1. 用冰冷的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤切片5次，每次3分钟。
    2. 将4%的水溶液四氧化锇与3%的亚铁氰化钾溶液按1:1体积比混合。最终混合物将变为棕色。将样品浸入该混合液中，置于冰上，并从此时起注意避光。轻轻振荡孵育1小时。
    3. 同时配制硫代羰基肼（TCH）溶液。将10 mL双蒸水与2O (ddH₂O)2O）和 0.1 g 的 TCH，放入设定温度的烘箱中 60 °C 1小时。期间需不时摇动溶液（例如每10分钟一次）。完成后冷却至室温。
    4. 用ddH₂O冲洗切片2O 五次，每次 3 分钟。
    5. 使用滤器过滤 TCH 溶液 0.22 µm 使用注射器滤器过滤溶液，并将样本浸入滤过的溶液中。切片将变为黑色，在室温下孵育20分钟。
    6. 用ddH₂O冲洗样品2O 五次，每次 3 分钟。
    7. 用2%的OsO₄水溶液孵育样品4 室温下孵育30分钟。
    8. 用ddH₂O冲洗样品2O 五次，每次 3 分钟。
    9. 将样品置于过滤后的1%醋酸铀水溶液中，并在 4 °C 过夜。使用 0.22 µm 用于过滤的注射器滤器
    10. 将0.4 g L-天冬氨酸与80 mL ddH₂O混合，配制L-天冬氨酸溶液。2O，调节pH至3.8以促进溶解，然后加水定容至100 mL。
    11. 次日，开始使用Walton's铅天冬氨酸15 制备。将0.066 g硝酸铅与10 mL预热至 60 °C 并调节pH至5.5（在 60 °C) 用 1 M NaOH。用天冬氨酸铅封口小瓶并静置 60 °C 在水浴中放置30分钟。溶液应保持澄清。若溶液变浑浊，则必须弃用并重新配制。
    12. 在此期间，用脱气的 ddH₂O 清洗样品2O 五次，每次 3 分钟。然后将它们置于设定温度的烘箱中 60 °C 30分钟。
    13. 将样品浸入新配制的铅天冬氨酸溶液中，并在设定温度的烘箱中孵育 60 °C 20分钟。
    14. 用脱气的ddH₂O洗涤样品2O 五次，每次 3 分钟。
  2. 脱水与树脂包埋
    1. 制备环氧树脂。称取组分（33.3 g 组分 A/M、33.3 g 组分 B 和 1 g 组分 D），充分混合树脂（例如，在15 mL离心管中置于旋转摇床上振荡），至少混合30分钟，然后加入16滴加速剂DMP 30。再次搅拌10分钟。
      注意：在通风橱下称量试剂。此配比的组分可制备约 60 mL 树脂，足以用于 15 个装有样品的西林瓶。可按需减少配制量，或将剩余树脂储存于注射器中 4 °C 并于次日使用。请记得密封注射器的尖端。
    2. 准备含有梯度浓度乙醇的样品瓶（30%、50%、70%、90%、100%、100% 乙醇溶于水，以及经分子筛干燥的100%乙醇）。
    3. 将树脂与100%乙醇按1:1比例混合，配制50%树脂溶液，充分混匀。
    4. 将样品依次在30%至100%无水乙醇（经分子筛干燥）的各级浓度乙醇中各脱水5分钟。注意，样品切勿完全干燥。
    5. 先将样品浸入50%树脂中30分钟，随后浸入100%树脂中1小时，最后再次浸入100%树脂中过夜。所有浸透步骤均需在持续缓慢振荡条件下进行。
    6. 次日，将样品置于新鲜的100%树脂中1小时，然后将其包埋于氟聚合物包埋片之间。用乙醇对包埋片进行脱脂处理，并将样品平置于两层包埋片之间，以两片载玻片作为支撑进行平整包埋。注意避免树脂中或样品附近产生气泡。
    7. 在烤箱中固化样品 70 °C 至少 48 小时。
  3. 修块与安装
    1. 分离包埋片，用剃刀切下一小块包埋样品（约1 mm × 1 mm），转移至Parafilm上。此举可最大限度减少因静电导致样品丢失的风险。
    2. 取一支经乙醇脱脂处理的铝针。充分混合导电环氧树脂，并取少量用于将样品固定在铝针上。将导电环氧树脂在 70 °C 10分钟。
    3. 用金刚石刀修切样本块的每一侧，然后修平块面，直至暴露出组织。
      注意：在此步骤中，通过收集部分切片并进行甲苯胺蓝染色，确认目标区域的存在16 或在电子显微镜下检查。
    4. 尽可能减小样品尺寸。然后使用导电漆将样品接地至销钉并进行固化（室温下放置24小时或在烘箱中 65 °C 40分钟。
    5. 为尽量减少电荷积累伪影，使用一层薄金或金/钯对样本进行溅射镀膜。

9. SBEM 成像

  1. 将带有样品的样品针放入连续切片扫描电镜的样品腔中。将样品与切刀对齐。关闭样品腔并设置参数。
  2. 以所需的放大倍数、像素尺寸、切片厚度、加速电压（EHT）、光阑、压力等条件采集图像序列。
    ​注意：参数取决于样品和实验目的。示例性的初始成像设置见材料表。

10. 三维重建

注意：以下步骤中我们使用开源软件，例如 FijiJ17（ImageJ 1.49b 版本）、Microscopy Image Browser (MIB)18 和 Reconstruct19，但也可采用其他多种软件。

  1. 将数字显微图（dm）文件转换为TIFF格式。首先导入图像序列（在FijiJ中： 文件 > 导入 > 图像序列 > 选择8位格式）然后另存为TIFF格式（在FijiJ中： 文件 > 另存为 > 图像序列 > 选择 Tiff).
  2. 调整图像堆栈的亮度和对比度（在 FijiJ 中）： 图像 > 调整 > 亮度/对比度）并在必要时进行去噪（使用FijJ的DenoisEM插件）20 : 插件 > DenoiseEM > 去噪).
  3. 对齐图像堆栈 （在 FijiJ： 插件 > StagReg 或 MIB：数据集 > 对齐工具).
  4. 分割树突棘与突触 （在 MIB 或 Reconstruct 软件中，可获取全面的教程（参见 材料表 详见正文。

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结果

采用上述方法可获得高对比度、高分辨率的小鼠脑组织图像。SBEM 技术提供的大视野有助于精确选择感兴趣区域。获取海马 CA1 区域的大范围图像，用于测量辐射层（stratum radiatum，SR）的长度（图 2A），并精确定位成像中心（图 2B）。随后采集图像序列，并对感兴趣的目标结构进行分割，包括树突、树突棘以及突触的突触后密度等（图 2C，D）。

采用SBEM技术可以分析相对大体积的组织，并识别罕见事件，例如多神经支配的树突棘（图2E）——这是一种特殊类型的突触，其特征是多个突触前终末共同接触同一个突触后树突棘21。

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讨论

Deerinck 于 2010 年描述的 NCMIR 基本方法有多种变体10。其基本原理保持不变，但根据所研究材料的类型，会进行一些细微调整。先前已有报道指出，可用于 SBEM 样品包埋的树脂种类多样，例如，对于植物样品，由于 Spurr 树脂黏度较低，更易穿透细胞壁，因此是首选树脂22,23。此外，固定过程中可使用多种缓冲液（如卡考基酸盐缓冲液、HEPES 或磷酸盐缓冲液），以及不同浓度的戊二醛（2–3%）和多聚甲醛（2–4%）23,24,25,26,27,28。使用鞣酸可增强富含...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

SBEM成像、光学显微镜成像以及电子显微镜样品制备均在实验生物学尼恩基研究所影像组织与功能实验室的设备上完成，该实验室为研究所的影像核心设施。

为制备图1，使用了小鼠（Souris_02）的图像以及来自 https://smart.servier.com/ 的一个试剂瓶。

本工作由波兰国家科学中心授予KR的Opus基金（项目编号：UMO-2018/31/B/NZ4/01603）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉剂：
氯胺酮/赛拉嗪混合物（Ketamina/Sedazin）Biowet Pulawy，普瓦维，波兰
戊巴比妥钠（Morbital）Biowet Pulawy，普瓦维，波兰
固定剂：
戊二醛（GA）Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国G58821级，25% H2O，专为用作电子显微镜固定剂而特别纯化
盐酸（HCl）POCH，格利维采，波兰575283115纯度 p.a.
多聚甲醛（PFA）Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国441244颗粒状，95%
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国P4417-50TAB片剂
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国S5881试剂级， <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%，颗粒（无水）
磷酸氢二钠（Na2HPO4)Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国S3264
磷酸二氢钠（NaH2PO4)Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国S3139
灌注：
大型钝头/钝头弯剪（约14.5 cm）Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城14519-14
微型刮勺（双头 2" 一端扁平，一端圆形，另一端锥形收窄至1/8")Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城10091-12
针尖，15号，钝头（灌注针）KD Medical GmbH 医院产品，柏林，德国KD-FINE 9004131.80 x 40 mm
精细（Graefe）镊子一对Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市11050-10
灌流泵铅液BQ80S
塑料小瓶Profilab，波兰华沙534.02带蓝色瓶盖的塑料离心管（用于组织储存），20 ml，31 x 48 mm
直头虹膜剪（约9 cm）Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城14058-11
用于电镜的脑切片制备：
12孔板NEST，新泽西州拉威，美国712001
氰基丙烯酸酯胶水Fenedur，蒙得维的亚，乌拉圭
玻璃小瓶美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司7263220 ml 闪烁瓶，一包100个
巴斯德吸管VWR，Radnor，PA，美国612-4545LDPE，一次性，7.5 ml
剃刀刀片Wilkinson Sword，伦敦，英国经典双刃安全剃须刀片
手术刀片Swann-Morton，谢菲尔德，英国20
振动切片机徕卡显微系统公司，奥地利维也纳Leica VT1000 S
用于免疫荧光的脑切片制备：
96孔板NEST，新泽西州拉威，美国701101
冷冻切片机徕卡显微系统公司，奥地利维也纳Leica CM 1950
乙二醇Bioshop，Burlington，加拿大ETH001
低剖面一次性刀片 819Leica Biosystems Inc., USA14035838925
手术刀片Swann-Morton，谢菲尔德，英国20
叠氮化钠 (NaN3)POCH，格利维采，波兰792770426
蔗糖POCH，格利维采，波兰772090110
用于冷冻切片的组织冷冻介质，OCT-CompoundLeica Biosystems，瑞士14020108926
免疫染色：
24孔板NEST，新泽西州拉威，美国702001
抗突触后密度蛋白95抗体默克-密理博，美国马萨诸塞州伯灵顿MAB1598
共聚焦显微镜Zeiss, Gö蒂宾根，德国蔡司转盘共聚焦显微镜（63 × 油镜，数值孔径 1.4，像素大小 0.13 µm × 0.13 µm)
封面幻灯片Menzel Glaser，德国不伦瑞克B-123124 x 60 mm
驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德A31570
含DAPI的Fluoromount-G封片剂Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德00-4959-52
显微镜载玻片Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆AGAA00008SuperFrost
正常驴血清（NDS）Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA017-000-121
ShakerJWElectronic，华沙，波兰KL-942
TritonT X-100 试剂级Bioshop，Burlington，加拿大TRX506
电子显微镜样品制备
六水合六氰合铁(II)酸钾POCH，格利维采，波兰746980113
Aclar 33C 薄膜美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司50425氟聚合物薄膜包埋片
DMP-30, 2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国T58203环氧包埋介质加速剂
Durcupan ACM 单组分 A，MSigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国44611Durcupan ACM 单组分 A，M 型环氧树脂
Durcupan ACM 单组分 BSigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国44612Durcupan ACM 单组分 B，硬化剂 964
Durcupan ACM 单组分 DSigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国44614Durcupan ACM 单组分 D，增塑剂
无水乙醇POCH，格利维采，波兰64-17-5乙醇，纯度99.8%，P.A.-BASIC
Genlab 实验室烘箱Wolflabs，英国约克Mino/18/SSOven Genlab MINO/18/SS 18升容积，无风扇循环，无数字显示屏，标准温度梯度，标准恢复速率，无定时器 250°C 最高温度，240V 电源供应
L-天冬氨酸Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国A-9256试剂级， <图像替代文本"方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%（HPLC）
硝酸铅Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国467790<图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>99.95% 痕量金属基准
四氧化锇Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国75632用于电子显微镜，4% 在 H2O
pH计Elmetron，扎布热，波兰CP-5-5
旋转器BioSan, Józefó波兰Multi Bio RS-24rotator Multi Bio RS-24
氢氧化钠（NaOH）Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国S5881试剂级， <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%，颗粒（无水）
向日葵迷你摇床Shepreth，英国 Grant 生物PD-3D
注射器滤器Millipore，Burlington，MA，USASLGP033NB0,22 µm 孔径
硫代碳酰肼Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国88535电子显微镜用，纯度 p.a. <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>99.0% (N)
醋酸铀酰Serva，德国海德堡77870醋酸铀酰·2H2O，科研级
水浴锅WSL，斯维埃托赫洛维采，波兰LWT
用于SBEM的样本安装
96孔培养板VWR，Radnor，PA，USA734-278296孔板，圆底，未处理
AM Gatan 3View 样品台操作镊子微米到纳米，荷兰哈勒姆
荷兰		50-001521
双目OPTA-TECH，波兰华沙X2000
导电胶美国佐治亚州 ChemtronicsCW2400导电环氧树脂
Gatan 3View 样品针 stubs微米到纳米，荷兰哈勒姆
荷兰		10-006003
ParafilmSigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国P7793卷尺寸 20 英寸 × 50 ft
Pelco 导电银漆Ted Pella，美国加利福尼亚州雷丁16062-15PELCO® 导电银漆，15g
双刃剃须刀片美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司72000不锈钢 "聚四氟乙烯" 镀膜。PERSONNA 品牌 .004" 厚型，单片独立包装，每盒250片。
扫描电子显微镜蔡司，德国奥伯科亨Sigma VP配Gatan 3View2腔室，加速电压2.5 kV，可变压力5 Pa，光阑 20 µm，停留时间 6 µs切片厚度 60 nm，放大倍数 15 000 x，图像分辨率 2048 x 2048 像素，像素大小 7.3 nm
修剪 90° 金刚石刀片Diatome Ltd.，瑞士尼道DTB90
超薄切片机徕卡显微系统公司，奥地利维也纳Leica ultracutR
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动物
小鼠成年3个月大及 20±1 月龄 雌性 Thy1-GFP(M) 小鼠（Thy1-GFP +/-）（Feng 等，2000），其在部分分布的谷氨酸能神经元中表达 GFP。动物在实验生物学奈恩基研究所动物房内以杂合子形式与 C57BL/6J 背景杂交繁殖。

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