连续块面扫描电子显微镜（SBEM）用于对小鼠海马区的树突棘进行成像和分析。
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本文内容
摘要
摘要
三维电子显微镜（3D EM）能够以纳米级分辨率分析树突棘的形态学参数。此外，某些树突棘的特征，例如棘的体积和突触后密度（PSD）（代表突触的突触后部分）、突触前终末的存在、滑面内质网或PSD的非典型形态（例如多神经支配的树突棘），只能通过3D EM进行观察。通过采用连续块面扫描电子显微镜（SBEM），相比传统的连续切片方法，可以更简便且更可重复地获得3D EM数据。本文展示了如何制备小鼠海马组织样本用于SBEM分析，以及该方案如何与树突棘的免疫荧光研究相结合。温和的固定灌注方法使得我们可以在脑组织的一半进行光学显微镜下的免疫荧光研究，而另一半则用于SBEM制样。该方法减少了实验所需的动物数量。
引言
中枢神经系统中大多数兴奋性突触位于树突棘上——树突棘是神经元膜上的微小突起。这些突起形成了隔离的生化区室，调控细胞内信号转导。树突棘和突触的结构可塑性与突触效能的功能性变化密切相关，而突触效能的变化是学习和记忆等重要过程的基础1,2。需要注意的是，只有电子显微镜（EM）技术能够确定树突棘是否具有来自轴突的突触前输入。研究突触后密度（PSD）的形态（代表突触的突触后部分）、树突棘的尺寸、轴突终扣的大小与形状等超微结构细节，也需要电子显微镜的高分辨率。此外，利用电子显微镜还可以观察突触及其周围环境的结构。
得益于成像和计算技术的进步，现已能够重建完整的神经环路。体积电子显微镜技术，如连续切片透射电子显微镜（ssTEM）、连续块面扫描电子显微镜（SBEM）和聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM），常被用于神经元环路的重建3。
在我们的研究中，SBEM 方法已成功用于研究小鼠海马组织样本及脑片培养样本中树突棘和突触后密度（PSDs）的结构可塑性4,5。SBEM 技术基于在扫描电镜腔室内安装微型超薄切片机6
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方案
研究严格遵守波兰神经研究所的指导原则，并获得当地伦理委员会的许可。实验遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）、波兰动物保护法，并经华沙第一地方伦理委员会批准。所有操作均尽可能减少使用动物数量并减轻其痛苦。
警告：由于所用试剂具有危险性，以下描述的所有操作必须在实验室通风橱中进行。需要采取个人安全防护措施，如佩戴手套、实验服、护目镜和面罩。
1. 灌注固定液的配制（0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB），pH 7.4，含 2% wt/vol 多聚甲醛（PFA）和 0.5% vol/vol 戊二醛（GA））
注意：固定液需在使用当天配制，且存放时间不得超过3小时。若时间不足，可提前一天配制0.1 M磷酸盐缓冲液中的2% PFA，于4 °C保存，并在灌流前临时加入新鲜的GA。
- 取 400 mL 无菌双蒸水（ddH2O），使用搅拌加热板加热至 60 °C。然后加入 20 g 多聚甲醛（PFA），逐滴加入 1 M NaOH，直至 PFA 完全溶解，随后使溶液冷却。
- 加入 500 mL 0.2 M 磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）。
- 过滤溶液以去除任何沉淀物，并将其冷却至 4 °C。
- 在灌注前立即向溶液中加入 20 mL 25% 戊二醛（GA），然....
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结果
采用上述方法可获得高对比度、高分辨率的小鼠脑组织图像。SBEM 技术提供的大视野有助于精确选择感兴趣区域。获取海马 CA1 区域的大范围图像，用于测量辐射层（stratum radiatum，SR）的长度（图 2A），并精确定位成像中心（图 2B）。随后采集图像序列，并对感兴趣的目标结构进行分割，包括树突、树突棘以及突触的突触后密度等（图 2C，D）。
采用SBEM技术可以分析相对大体积的组织，并识别罕见事件，例如多神经支配的树突棘（图2E）——这是一种特殊类型的突触，其特征是多个突触前终末共同接触同一个突触后树突棘21。
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讨论
Deerinck 于 2010 年描述的 NCMIR 基本方法有多种变体10。其基本原理保持不变，但根据所研究材料的类型，会进行一些细微调整。先前已有报道指出，可用于 SBEM 样品包埋的树脂种类多样，例如，对于植物样品，由于 Spurr 树脂黏度较低，更易穿透细胞壁，因此是首选树脂22,23。此外，固定过程中可使用多种缓冲液（如卡考基酸盐缓冲液、HEPES 或磷酸盐缓冲液），以及不同浓度的戊二醛（2–3%）和多聚甲醛（2–4%）23,24,25,26,27,28。使用鞣酸可增强富含.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
SBEM成像、光学显微镜成像以及电子显微镜样品制备均在实验生物学尼恩基研究所影像组织与功能实验室的设备上完成，该实验室为研究所的影像核心设施。
为制备图1，使用了小鼠（Souris_02）的图像以及来自 https://smart.servier.com/ 的一个试剂瓶。
本工作由波兰国家科学中心授予KR的Opus基金（项目编号：UMO-2018/31/B/NZ4/01603）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 麻醉剂： | |||
| 氯胺酮/赛拉嗪混合物（Ketamina/Sedazin） | Biowet Pulawy，普瓦维，波兰 | ||
| 戊巴比妥钠（Morbital） | Biowet Pulawy，普瓦维，波兰 | ||
| 固定剂： | |||
| 戊二醛（GA） | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | G5882 | 1级，25% H2O，专为用作电子显微镜固定剂而特别纯化 |
| 盐酸（HCl） | POCH，格利维采，波兰 | 575283115 | 纯度 p.a. |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 441244 | 颗粒状，95% |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | P4417-50TAB | 片剂 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | S5881 | 试剂级， <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%，颗粒（无水） |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4) | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | S3264 | |
| 磷酸二氢钠（NaH2PO4) | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | S3139 | |
| 灌注： | |||
| 大型钝头/钝头弯剪（约14.5 cm） | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城 | 14519-14 | |
| 微型刮勺（双头 2" 一端扁平，一端圆形，另一端锥形收窄至1/8") | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城 | 10091-12 | |
| 针尖，15号，钝头（灌注针） | KD Medical GmbH 医院产品，柏林，德国 | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
| 精细（Graefe）镊子一对 | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特市 | 11050-10 | |
| 灌流泵 | 铅液 | BQ80S | |
| 塑料小瓶 | Profilab，波兰华沙 | 534.02 | 带蓝色瓶盖的塑料离心管（用于组织储存），20 ml，31 x 48 mm |
| 直头虹膜剪（约9 cm） | Fine Science Tools，美国加利福尼亚州福斯特城 | 14058-11 | |
| 用于电镜的脑切片制备： | |||
| 12孔板 | NEST，新泽西州拉威，美国 | 712001 | |
| 氰基丙烯酸酯胶水 | Fenedur，蒙得维的亚，乌拉圭 | ||
| 玻璃小瓶 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 72632 | 20 ml 闪烁瓶，一包100个 |
| 巴斯德吸管 | VWR，Radnor，PA，美国 | 612-4545 | LDPE，一次性，7.5 ml |
| 剃刀刀片 | Wilkinson Sword，伦敦，英国 | 经典双刃安全剃须刀片 | |
| 手术刀片 | Swann-Morton，谢菲尔德，英国 | 20 | |
| 振动切片机 | 徕卡显微系统公司，奥地利维也纳 | Leica VT1000 S | |
| 用于免疫荧光的脑切片制备： | |||
| 96孔板 | NEST，新泽西州拉威，美国 | 701101 | |
| 冷冻切片机 | 徕卡显微系统公司，奥地利维也纳 | Leica CM 1950 | |
| 乙二醇 | Bioshop，Burlington，加拿大 | ETH001 | |
| 低剖面一次性刀片 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
| 手术刀片 | Swann-Morton，谢菲尔德，英国 | 20 | |
| 叠氮化钠 (NaN3) | POCH，格利维采，波兰 | 792770426 | |
| 蔗糖 | POCH，格利维采，波兰 | 772090110 | |
| 用于冷冻切片的组织冷冻介质，OCT-Compound | Leica Biosystems，瑞士 | 14020108926 | |
| 免疫染色： | |||
| 24孔板 | NEST，新泽西州拉威，美国 | 702001 | |
| 抗突触后密度蛋白95抗体 | 默克-密理博，美国马萨诸塞州伯灵顿 | MAB1598 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss, Gö蒂宾根，德国 | 蔡司转盘共聚焦显微镜（63 × 油镜，数值孔径 1.4，像素大小 0.13 µm × 0.13 µm) | |
| 封面幻灯片 | Menzel Glaser，德国不伦瑞克 | B-1231 | 24 x 60 mm |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 | Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | A31570 | |
| 含DAPI的Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德 | 00-4959-52 | |
| 显微镜载玻片 | Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | AGAA00008 | SuperFrost |
| 正常驴血清（NDS） | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| Shaker | JWElectronic，华沙，波兰 | KL-942 | |
| TritonT X-100 试剂级 | Bioshop，Burlington，加拿大 | TRX506 | |
| 电子显微镜样品制备 | |||
| 六水合六氰合铁(II)酸钾 | POCH，格利维采，波兰 | 746980113 | |
| Aclar 33C 薄膜 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 50425 | 氟聚合物薄膜包埋片 |
| DMP-30, 2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | T58203 | 环氧包埋介质加速剂 |
| Durcupan ACM 单组分 A，M | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 44611 | Durcupan ACM 单组分 A，M 型环氧树脂 |
| Durcupan ACM 单组分 B | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 44612 | Durcupan ACM 单组分 B，硬化剂 964 |
| Durcupan ACM 单组分 D | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 44614 | Durcupan ACM 单组分 D，增塑剂 |
| 无水乙醇 | POCH，格利维采，波兰 | 64-17-5 | 乙醇，纯度99.8%，P.A.-BASIC |
| Genlab 实验室烘箱 | Wolflabs，英国约克 | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18升容积，无风扇循环，无数字显示屏，标准温度梯度，标准恢复速率，无定时器 250°C 最高温度，240V 电源供应 |
| L-天冬氨酸 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | A-9256 | 试剂级， <图像替代文本"方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%（HPLC） |
| 硝酸铅 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 467790 | <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>99.95% 痕量金属基准 |
| 四氧化锇 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 75632 | 用于电子显微镜，4% 在 H2O |
| pH计 | Elmetron，扎布热，波兰 | CP-5-5 | |
| 旋转器 | BioSan, Józefó波兰 | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
| 氢氧化钠（NaOH） | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | S5881 | 试剂级， <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>98%，颗粒（无水） |
| 向日葵迷你摇床 | Shepreth，英国 Grant 生物 | PD-3D | |
| 注射器滤器 | Millipore，Burlington，MA，USA | SLGP033NB | 0,22 µm 孔径 |
| 硫代碳酰肼 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | 88535 | 电子显微镜用，纯度 p.a. <图像 替代文本="方程" src="/files/ftp_upload/62712/62712symbol.png"/>99.0% (N) |
| 醋酸铀酰 | Serva，德国海德堡 | 77870 | 醋酸铀酰·2H2O，科研级 |
| 水浴锅 | WSL，斯维埃托赫洛维采，波兰 | LWT | |
| 用于SBEM的样本安装 | |||
| 96孔培养板 | VWR，Radnor，PA，USA | 734-2782 | 96孔板，圆底，未处理 |
| AM Gatan 3View 样品台操作镊子 | 微米到纳米，荷兰哈勒姆 荷兰 | 50-001521 | |
| 双目 | OPTA-TECH，波兰华沙 | X2000 | |
| 导电胶 | 美国佐治亚州 Chemtronics | CW2400 | 导电环氧树脂 |
| Gatan 3View 样品针 stubs | 微米到纳米，荷兰哈勒姆 荷兰 | 10-006003 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | P7793 | 卷尺寸 20 英寸 × 50 ft |
| Pelco 导电银漆 | Ted Pella，美国加利福尼亚州雷丁 | 16062-15 | PELCO® 导电银漆，15g |
| 双刃剃须刀片 | 美国宾夕法尼亚州哈特菲尔德，电子显微镜科学公司 | 72000 | 不锈钢 "聚四氟乙烯" 镀膜。PERSONNA 品牌 .004" 厚型，单片独立包装，每盒250片。 |
| 扫描电子显微镜 | 蔡司，德国奥伯科亨 | Sigma VP配Gatan 3View2腔室，加速电压2.5 kV，可变压力5 Pa，光阑 20 µm，停留时间 6 µs切片厚度 60 nm，放大倍数 15 000 x，图像分辨率 2048 x 2048 像素，像素大小 7.3 nm | |
| 修剪 90° 金刚石刀片 | Diatome Ltd.，瑞士尼道 | DTB90 | |
| 超薄切片机 | 徕卡显微系统公司，奥地利维也纳 | Leica ultracutR | |
| 软件 | 网页 | 教程 | |
| FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
| 显微图像浏览器 | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
| 重建 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
| 动物 | |||
| 小鼠 | 成年3个月大及 20±1 月龄 雌性 Thy1-GFP(M) 小鼠（Thy1-GFP +/-）（Feng 等，2000），其在部分分布的谷氨酸能神经元中表达 GFP。动物在实验生物学奈恩基研究所动物房内以杂合子形式与 C57BL/6J 背景杂交繁殖。 |
参考文献
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
- Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
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