高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

摘要

利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的种系转化。

摘要

利用转座元件将遗传物质稳定插入昆虫基因组，是功能基因组学研究和开发遗传害虫管理策略的有力工具。在昆虫转化中应用最广泛的转座元件是piggyBac，基于piggyBac的生殖系转化已在模式昆虫中成功实现。然而，在包括农业害虫在内的非模式昆虫中应用该技术仍具挑战性。本文报道了利用高活性piggyBac转座酶（hyPBase）对全球性农业害虫草地贪夜蛾（FAW），Spodoptera frugiperda，进行生殖系转化的研究。

在本研究中，采用 hyPBase mRNA 取代辅助质粒用于胚胎显微注射。这一改进成功实现了转基因棉铃虫（FAW）的创制。此外，本文还描述了转基因个体的筛选方法、基于 PCR 的转基因插入快速检测技术，以及基于热不对称交错 PCR（TAIL-PCR）的整合位点确定方法。因此，本文提供了一套完整的转基因棉铃虫制备方案，将有助于推动基于 piggyBac 的棉铃虫及其他鳞翅目昆虫的转基因技术发展。

引言

草地贪夜蛾（FAW），学名Spodoptera frugiperda，原产于美洲的热带和亚热带地区。目前，该害虫已在全球100多个国家造成严重危害¹。FAW幼虫可取食超过350种寄主植物，其中包括多种重要的粮食作物²。成虫具有强大的迁飞能力，导致其近年来迅速从美洲扩散至世界其他地区^1,2。因此，这种害虫现已成为国际粮食安全的重大威胁。应用新技术可能有助于推进对草地贪夜蛾的深入研究，并为防控该害虫提供新的策略。

昆虫种系转化已被用于研究基因功能，并创制转基因昆虫以应用于遗传控制^3,4。在实现昆虫遗传转化的多种方法中，基于piggyBac元件的方法应用最为广泛⁵。然而，由于转座效率较低，在非模式昆虫中开展转基因操作仍然具有挑战性。最近，研究人员开发出一种高活性的piggyBac转座酶（hyPBase）^6,7。近期已在草地贪夜蛾（FAW）中....

方案

1. 体外 hyPBase mRNA 的合成

注意：hyPBase 的完整编码序列已合成并插入 pTD1-Cas9 载体中（参见材料表），以构建 pTD1-hyPBase 质粒，该质粒包含一个 hyPBase 表达盒，其序列为 T7 启动子：多角体蛋白-5' 非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3' 非翻译区：poly(A)。pTD1-hyPBase 构建体的完整序列见补充材料。

1. 模板的制备 体外 合成
   1. 使用上游引物 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' 和下游引物 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3'，以高保真聚合酶和 pTD1-hyPBase 质粒为模板，进行 PCR 反应以扩增表达 hyPBase 的表达盒。
      注意：PCR 反应（终体积 50 µL）包含 5.0 µL 10x 反应缓冲液、4.0 µL 10 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTP）、1.0 µL 质粒（50 µg/µL）、1.0 µL 高保真聚合酶、各 1.0 µL 的 10 µM 正向引物和反向引物，以及 33 µL 无核酸酶水。反应程序如下：95 °C 预变性 3 min，随后进行 35 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 10 s、60 °C 退火 15 s 和 68 °C 延....

结果

含有 hyPBase 的表达载体构建：T7 启动子：多角体蛋白-5'非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3'非翻译区：多聚腺苷酸信号序列的构建（图1A）并扩增为约2.2 kb的PCR片段，用于合成hyPBase mRNA 体外 (图1B）。随后，制备hyPBase mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。在1%琼脂糖凝胶上检测到预期大小的mRNA条带（约1.1 kb条带）图1C).

随后，构建了一个基于piggyBac的EGFP表达载体（图2A）。将该质粒与hyPBase mRNA或PBS溶液混合后，在产卵后2小时内注射到胚胎中。注射后24小时，在注射胚胎中观察到EGFP表达的瞬时信号。PBS注射组胚胎未显示EGFP信号（图2B），而注射EGFP表达质粒和hy.......

讨论

较低的转座率以及将转基因元件递送至新鲜胚胎的困难，限制了许多非模式昆虫（尤其是鳞翅目昆虫）生殖系转化的成功率。为了提高生殖系转化效率，研究人员开发出了一种最常用的piggyBac转座酶的高活性版本（hyPBase）^7,10。迄今为止，鳞翅目昆虫中成功的生殖系转化主要报道于模式昆虫家蚕Bombyx mori¹¹。然而，在其他鳞翅目昆虫（包括一些主要农业害虫）中开展转基因研究仍然具有挑战性。

使用本方案建立转基因草地贪夜蛾品系的主要局限性和关键步骤在于合成高质量的hyPBase mRNA，以及将piggyBac转座组分递送至早期胚胎中。传统piggyBac系统包含两个核心组分：一个携带待插入基因组的外源片段的供体质粒，以及一个提供转座酶的辅助质粒¹²。为了提高转化效率，辅助质粒中通常使用高活性启动子来驱动.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5" 牙科棉卷	PlastCare USA	8542025591	饲养
1 盎司舒芙蕾杯盖	DART	PL1N
1 盎司舒芙蕾杯	DART	P100N	饲养
48 盎司塑料熟食容器	Genpack	AD48	饲养
附加滤光片组（绿色）	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	筛选
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instruments	BF100-50-10	注射
硼硅酸盐玻璃	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
解剖显微镜	Nikon	SMZ745T	筛选
轻质镊子	BioQuip	4750	饲养
沟槽防护网	ThermWell Products	VX620	饲养
倒置显微镜	Olympus	IX71	注射
显微注射仪	Narishige	IM-300	注射
微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-1000	注射
显微镜载玻片	VWR	16004-22	注射
NightSea 全套系统	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	筛选
氮气	AWG/Scott-Gross	NI 225	注射
纸巾	Bounty	43217-45074	饲养
Spodoptera frugiperda 人工饲料	Southland Products, Inc	N/A [申请物种/数量]	饲养
Spodoptera frugiperda 卵	Benzon Research, Inc	N/A [申请物种/数量]	饲养
Taq MasterMix			聚合酶混合物