高活性 piggyBac 转座酶介导的秋黏虫Spodoptera frugiperda种系转化

摘要

利用高活性piggyBac转座酶的mRNA，成功实现了对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的种系转化。

摘要

利用转座元件将遗传物质稳定插入昆虫基因组，是功能基因组学研究和开发遗传害虫管理策略的有力工具。在昆虫转化中应用最广泛的转座元件是piggyBac，基于piggyBac的生殖系转化已在模式昆虫中成功实现。然而，在包括农业害虫在内的非模式昆虫中应用该技术仍具挑战性。本文报道了利用高活性piggyBac转座酶（hyPBase）对全球性农业害虫草地贪夜蛾（FAW），Spodoptera frugiperda，进行生殖系转化的研究。

在本研究中，采用 hyPBase mRNA 取代辅助质粒用于胚胎显微注射。这一改进成功实现了转基因棉铃虫（FAW）的创制。此外，本文还描述了转基因个体的筛选方法、基于 PCR 的转基因插入快速检测技术，以及基于热不对称交错 PCR（TAIL-PCR）的整合位点确定方法。因此，本文提供了一套完整的转基因棉铃虫制备方案，将有助于推动基于 piggyBac 的棉铃虫及其他鳞翅目昆虫的转基因技术发展。

引言

草地贪夜蛾（FAW），学名Spodoptera frugiperda，原产于美洲的热带和亚热带地区。目前，该害虫已在全球100多个国家造成严重危害¹。FAW幼虫可取食超过350种寄主植物，其中包括多种重要的粮食作物²。成虫具有强大的迁飞能力，导致其近年来迅速从美洲扩散至世界其他地区^1,2。因此，这种害虫现已成为国际粮食安全的重大威胁。应用新技术可能有助于推进对草地贪夜蛾的深入研究，并为防控该害虫提供新的策略。

昆虫种系转化已被用于研究基因功能，并创制转基因昆虫以应用于遗传控制^3,4。在实现昆虫遗传转化的多种方法中，基于piggyBac元件的方法应用最为广泛⁵。然而，由于转座效率较低，在非模式昆虫中开展转基因操作仍然具有挑战性。最近，研究人员开发出一种高活性的piggyBac转座酶（hyPBase）^6,7。近期已在草地贪夜蛾（FAW）中成功实现种系转化⁸，这是首次在鳞翅目昆虫中应用hyPBase的报道。本报告详细描述了使用hyPBase mRNA创制转基因草地贪夜蛾的方法。此处所述方法也可用于其他鳞翅目昆虫的转化。

方案

1. 体外 hyPBase mRNA 的合成

注意：hyPBase 的完整编码序列已合成并插入 pTD1-Cas9 载体中（参见材料表），以构建 pTD1-hyPBase 质粒，该质粒包含一个 hyPBase 表达盒，其序列为 T7 启动子：多角体蛋白-5' 非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3' 非翻译区：poly(A)。pTD1-hyPBase 构建体的完整序列见补充材料。

1. 模板的制备 体外 合成
   1. 使用上游引物 5'-atgcggtgtgaaataccgcacagatgcg-3' 和下游引物 5'-tagaggccccaaggggttatgctag-3'，以高保真聚合酶和 pTD1-hyPBase 质粒为模板，进行 PCR 反应以扩增表达 hyPBase 的表达盒。
      注意：PCR 反应（终体积 50 µL）包含 5.0 µL 10x 反应缓冲液、4.0 µL 10 mM 脱氧核苷三磷酸（dNTP）、1.0 µL 质粒（50 µg/µL）、1.0 µL 高保真聚合酶、各 1.0 µL 的 10 µM 正向引物和反向引物，以及 33 µL 无核酸酶水。反应程序如下：95 °C 预变性 3 min，随后进行 35 个循环，每个循环包括 98 °C 变性 10 s、60 °C 退火 15 s 和 68 °C 延伸 2 min。
   2. 在新鲜的Tris-乙酸-乙二胺四乙酸（TAE）缓冲液中，于120 V电压下将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳30分钟，随后使用凝胶回收试剂盒纯化产物。
      注意：不要使用PCR产物纯化试剂盒。即使痕量的pTD1-hyPBase质粒也会显著降低效率 体外 合成
2. 体外 使用商业试剂盒合成hyPBase mRNA
   1. 完全解冻冷冻试剂，将酶和2x NTP/CAP溶液置于冰上，解冻后的10x反应缓冲液置于室温。
   2. 在室温下加入以下组分以组装反应体系：2x NTP/CAP 溶液：10 µL；10x 反应缓冲液：2 µL；模板 DNA：0.1–0.2 µg；酶混合物：2 µL；无核酸酶水补至 20 µL。
   3. 轻轻吹打混合试剂，充分混匀后于 37 °C 孵育 2–4 小时。
3. 氯化锂沉淀法回收合成的mRNA
   1. 加入30 µL氯化锂沉淀液，轻轻弹击离心管充分混匀，然后在-20 °C放置不少于30分钟。
   2. 在4 °C下以最大速度离心15分钟，小心移除上清液。
   3. 用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀物一次，重新离心，然后小心移除上清液。
   4. 将沉淀在室温下干燥1-2分钟，然后用20-40 µL无核酸酶水重悬沉淀。
   5. 将1 µL mRNA溶液与9 µL无核酸酶水混合稀释。取2 µL用于测定mRNA浓度，另取8 µL在新鲜TAE缓冲液中以100 V电压进行1%琼脂糖凝胶电泳40分钟，以检测mRNA质量。
   6. 分装mRNA溶液，于-70 °C冷冻保存，可保存长达一年。
      ​注意：不要将 mRNA 沉淀完全干燥，否则可能难以溶于水中。

2. 显微注射

1. 卵的收集
   1. 将12只雄性蛹和12只雌性蛹放入一个15 cm × 15 cm × 10 cm的盒子中。用纸巾覆盖盒子，并在盒内放置10%蔗糖溶液以供成虫取食。
   2. 羽化后第2天，将成虫暴露于强光下过夜。
   3. 羽化后第3天，将来自步骤2.1.2的成虫转移至暗处。在产卵后2小时内收集胚胎。
   4. 向置于冰上培养皿中的纸巾片上的新鲜卵滴加数滴水。用细毛刷轻轻将卵转移至载玻片上，并逐个排列整齐。微注射前将排列好卵的载玻片保持在冰上。
2. 显微注射准备
   1. 使用自动显微注射仪（参见材料表），向卵内注射含有转基因增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达质粒（200 ng/µL）、pBac: hr5ie1-EGFP-SV40、hyPBase mRNA（200 ng/µL）以及无菌蒸馏水的混合物，同时使用补偿压力。
   2. 将注射后的卵置于27 ± 1 °C、相对湿度60 ± 10%条件下培养，直至孵化。
   3. 用人工饲料喂养孵化后的幼虫，并在幼虫进入早期3^rd龄期（体长约6 mm，体色变黑）时，将每条幼虫转移至一个小杯中。

3. 荧光筛选与遗传杂交

1. 收集蛹，将约150只雌蛹和约150只雄蛹放入一个35 cm × 35 cm × 35 cm的笼子中。在笼内悬挂数张纸巾（约30 cm × 15 cm），用于收集卵。
2. 每天收集带有卵的纸巾，并将卵置于27 ± 1 °C、60 ± 10%相对湿度条件下培养，直至孵化。
3. 将初孵幼虫在4 °C下冷藏5分钟以使其 immobilize（固定），然后转移至冰冷的培养皿上。
4. 在荧光体视显微镜下筛选固定后的初孵幼虫。挑选EGFP阳性的个体，在27 ± 1 °C条件下饲养约两周至化蛹阶段，并根据腹部腹面体节的表型差异进行性别分离。
   注意：雌蛹在第八腹节具有狭缝状的生殖 opening（开口），第九和第十腹节的头侧边缘向生殖 opening 弯曲；雄蛹的生殖 opening 在第九腹节处有轻微隆起。
5. 将EGFP阳性的蛹与野生型相反性别的蛹按1:1的雄雌比例放入同一笼中。通过同胞交配繁殖EGFP表达的成虫，以获得后续世代。

4. 转基因插入的PCR检测

1. 使用任何商业化的基因组DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从野生型和EGFP阳性个体幼虫中提取基因组DNA。
2. 以基因组DNA为模板进行PCR反应，上游引物序列为5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3'，位于ie1启动子区；下游引物序列为5'- aagcactgcacgccgtaggtcag-3'，位于转化载体的EGFP区域。
3. 每项PCR反应体系总体积为40 µL，包含20 µL聚合酶混合液、1.0 µL基因组DNA（40 µg/µL）、各1.0 µL的10 µM上游和下游引物，以及17 µL无核酸酶水。反应程序设置如下：95 °C预变性3 min，随后进行35个循环，每个循环包括95 °C变性20 s、56 °C退火20 s、68 °C延伸40 s。
4. 将PCR产物在1%琼脂糖凝胶中以120 V电泳30 min进行检测。

5. 转基因插入位点的确定

1. 以基因组DNA为模板，进行高效TAIL-PCR，以确定EGFP阳性昆虫中外源基因插入的整合位点。
   1. 按照文献中所述步骤进行PCR反应⁹。
      1. 在三轮PCR反应中，分别使用三种特异性针对piggyBac载体的引物：P1: 5'-atcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcc-3'，P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3'，以及P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgct-3'。
2. 对最终的PCR产物进行测序，以确定整合位点。

结果

构建了一个表达含T7启动子：多角体蛋白-5'非翻译区：hyPBase：多角体蛋白-3'非翻译区：多聚腺苷酸信号的hyPBase的载体（图1A）并扩增为约2.2 kb的PCR片段，用于合成hyPBase mRNA 体外 (图1B）。随后，制备hyPBase mRNA并进行琼脂糖凝胶电泳。在1%琼脂糖凝胶上检测到预期大小的mRNA（约1.1 kb条带）图1C).

随后，构建了一个基于 piggyBac 的 EGFP 表达载体（图 2A）。将该质粒与 hyPBase mRNA 或 PBS 溶液的混合物在产卵后 2 小时内注射到胚胎中。注射后 24 小时，在注射胚胎中观察到 EGFP 表达的瞬时信号。PBS 注射组胚胎未显示 EGFP 信号（图 2B），而注射...

讨论

较低的转座率以及将转基因元件递送至新鲜胚胎的困难，限制了许多非模式昆虫（尤其是鳞翅目昆虫）生殖系转化的成功率。为了提高生殖系转化效率，研究人员开发出了一种最常用的piggyBac转座酶的高活性版本（hyPBase）^7,10。迄今为止，鳞翅目昆虫中成功的生殖系转化主要报道于模式昆虫家蚕Bombyx mori¹¹。然而，在其他鳞翅目昆虫（包括一些主要农业害虫）中开展转基因研究仍然具有挑战性。

使用本方案建立转基因草地贪夜蛾品系的主要局限性和关键步骤在于合成高质量的hyPBase mRNA，以及将piggyBac转座组分递送至早期胚胎中。传统piggyBac系统包含两个核心组分：一个携带待插入基因组的外源片段的供体质粒，以及一个提供转座酶的辅助质粒¹²。为了提高转化效率，辅助质粒中通常使用高活性启动子来驱动...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5" 牙科棉卷	PlastCare USA	8542025591	饲养
1 盎司舒芙蕾杯盖	DART	PL1N
1 盎司舒芙蕾杯	DART	P100N	饲养
48 盎司塑料熟食容器	Genpack	AD48	饲养
附加滤光片组（绿色）	NightSea LLC	SFA-BLFS-GR	筛选
硼硅酸盐玻璃	Sutter Instruments	BF100-50-10	注射
硼硅酸盐玻璃	SUTTER INSTRUMENT	BF-100-50-10
解剖显微镜	Nikon	SMZ745T	筛选
轻质镊子	BioQuip	4750	饲养
沟槽防护网	ThermWell Products	VX620	饲养
倒置显微镜	Olympus	IX71	注射
显微注射仪	Narishige	IM-300	注射
微量移液器拉制仪	Sutter Instruments	P-1000	注射
显微镜载玻片	VWR	16004-22	注射
NightSea 全套系统	NightSea LLC	SFA-RB-DIM	筛选
氮气	AWG/Scott-Gross	NI 225	注射
纸巾	Bounty	43217-45074	饲养
Spodoptera frugiperda 人工饲料	Southland Products, Inc	N/A [申请物种/数量]	饲养
Spodoptera frugiperda 卵	Benzon Research, Inc	N/A [申请物种/数量]	饲养
Taq MasterMix			聚合酶混合物