本方案介绍了一种荧光成像方法，该方法利用一类对pH敏感的脂质荧光探针，用于监测细胞外排和内吞循环过程中的脂质膜运输。
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本文内容
摘要
摘要
胞吐/胞吞是一种介导细胞与其环境之间以及不同细胞之间生物分子交换的常见过程。特化细胞利用这一过程执行重要的生理功能，例如β细胞分泌胰岛素以及化学突触释放神经递质。由于其重要的生理意义，胞吐/胞吞一直是细胞生物学中最受关注的研究课题之一。研究人员已开发出多种工具，在基因和蛋白质水平上研究这一过程，因此目前对参与该过程的蛋白质分子机制已有深入了解。然而，针对膜脂质转换（即胞吐/胞吞的物理基础）的测量方法却极为有限。
本文介绍了一类具有pH依赖性荧光特性的新型荧光脂质类似物，并展示了其在追踪质膜与分泌囊泡之间脂质再循环中的应用。借助简单的pH调控，这些类似物还可用于量化脂质在细胞表面与细胞内膜区室间的分布，以及在胞吐/胞吞过程中脂质周转速率的测定。这类新型脂质探针将对细胞生物学、神经科学等多个生物学研究领域具有重要意义。
引言
脂质双分子层是最常见的生物分子组装结构之一，对所有细胞都不可或缺。在细胞外，它形成质膜，作为细胞与其环境之间的界面；在细胞内，它将各种具有特定功能的细胞器分隔开来。脂质膜并非静止不动，而是处于动态变化中，持续经历融合与分裂过程，从而介导生物物质的运输、细胞器的重塑、形态改变以及细胞间通讯。毫无疑问，脂质膜几乎是所有细胞活动的物理基础，其功能障碍在多种疾病中发挥关键作用，范围涵盖癌症1到阿尔茨海默病2。尽管脂质分子的多样性远低于蛋白质，但迄今为止的膜研究主要集中于蛋白质。例如，在胞吐作用中，人们对蛋白质机制的了解远多于对脂质的认识3,4,5。此外，与膜蛋白相比，细胞表面及细胞内膜上脂质的组织结构、分布、动态行为及其稳态调控在很大程度上仍未被充分探索6。
这并不令人意外，因为现代分子生物学技术（如诱变）在研究蛋白质方面比研究脂质具有方法学上的优势。例如，将pH敏感性绿色荧光蛋白（又称pHluorin）转基因标记到囊泡蛋白上，可实现对胞吐/胞吞过程中囊泡蛋白周转量和周转速率的定量测量7,....
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方案
以下方案包括：（1）基于已确立方案22的简化小鼠海马和皮层神经元培养建立流程；（2）用于活神经元成像的落射荧光显微镜系统的简要介绍；（3）在小鼠神经元中加载与成像ND6的详细操作描述；（4）关于利用ND6信号定量膜运输的讨论。所有操作均遵循佛罗里达大西洋大学的生物安全与IACUC指南。ND6的合成方法此前已有报道20。
1. 小鼠海马和皮层培养物的制备
注意：除非另有说明，所有步骤均须在生物安全二级的层流罩内进行。所有工具和材料均须灭菌。
- 使用5号镊子将玻璃盖玻片放入多孔培养板中。
注意：例如，24孔板适用于12 mm
盖玻片。 - 加入适量体积的细胞外基质以包被细胞培养表面（例如，每12 mm
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结果
突触小泡（SV）通过诱发的胞吐/胞吞作用专门负责神经递质的释放27。突触小泡具有高度酸性的腔内环境（即 pH 5.5），这非常适合ND6染色。我们采用高K+刺激来诱发突触小泡的胞吐/胞吞，从而使ND6能够进入突触小泡。正如预期，在加载后，沿神经元突起可见明亮的绿色荧光斑点（图9A）。图4B中的线轮廓显示ND6（绿色曲线）与FM4-64斑点（红色曲线）之间存在强烈重叠。ND6与FM4-64荧光强度之间的高度相关性也进一步表明ND6可特异性标记突触小泡（图9B）。
采用电刺激和高K+刺激分别诱导易释放囊泡池（RRP，即具有高释放概率的突触囊泡）和储备池囊泡（即具有低释放概率的突触囊泡）的释放。两种刺激均引起ND6荧光信号下降（图4C 和 图4E），表明.......
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讨论
基于脂质的染料，如1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青（DiI）和3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO），长期以来被用于显示细胞形态，并追踪神经元轴突投射等细胞过程。苯乙烯基类染料（如FM1-43）已被开发并成功用于胞吐作用的研究34。由于其对细胞膜的亲和力较低，在持续灌流过程中，保留在质膜上的染料会被洗脱，而被内吞的囊泡则可特异性地被染色并保留染料。因此，苯乙烯基染料不适用于对囊泡循环的持续监测。
最近发明的pH敏感型GFP（即pHluorin）使得当其与囊泡膜蛋白（如VAMPII或Synaptophysin）融合时，能够反复观察囊泡的循环过程35。依据相同原理，将pH敏感型荧光探针标记到脂质分子上，可在胞吐/胞吞循环过程中追踪脂质膜的循环14。在这种情况下，ND6作为一种单一的脂质分子，更易于制备，使用更简便，对脂质膜的标记效率更高，对细胞的干扰更小，在细胞膜中的稳定性更好，因此在荧光成像中更为可靠。其膜.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了佛罗里达大西洋大学本科生研究与探索办公室资助（M.J.S.）、佛罗里达州卫生部Ed和Ethel Moore试点项目资助20A17（Q.Z.）、阿尔茨海默病协会资助AARG-NTF-19-618710（Q.Z.）以及美国国家衰老研究所R21资助AG061656-01A1（Q.Z.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Digidata 1440A 数据采集系统 | Molecular Devices | Digidata 1440A | 用于同步刺激与溶液交换 |
| 双通道温度控制器 | Warner Instruments | TC-344B | 用于活细胞成像 |
| 胎牛血清 | OMEGA Scientific | FB-01 | 用于配制解剖和组织培养中使用的 H+20 溶液 |
| Hamamatsu Flash4.0 sCOMS 相机 | Hamamatsu Inc. | C13440-20CU | 高灵敏度相机 |
| 汉克平衡盐溶液 | Sigma | H6648 | 用于配制解剖和组织培养中使用的 H+20 溶液 |
| 加热平台 | Warner Instruments | PH-1 | 用于活细胞成像 |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | 用于组织培养 |
| Micro-G 振动隔离台 | TMC | 63-564 | 用于活细胞成像 |
| Micro-manager | https://micro-manager.org/ | NA | 用于图像采集控制 |
| 多通道在线溶液加热器 | Warner Instruments | SHM-6 | 用于活细胞成像 |
| Neurobasal Plus 培养基 | ThermoFisher Scientific | A3582901 | 用于组织培养 |
| Nikon Ti-E 倒置显微镜 | Nikon | Ti-E/B | 用于活细胞成像 |
| ORCA-Flash4.0 数字 CMOS 相机 | Hamamatsu | C1340-20CU | 用于活细胞成像 |
| 灌流腔室 | Warner Instruments | RC-26G | 用于活细胞成像 |
| 六通道阀控灌流系统 | Warner Instruments | VC-6 | 用于溶液交换 |
| 方波脉冲刺激器 | Grass Instrument | SD9 | 用于电场刺激 |
参考文献
- Polo, S., Pece, S., Di Fiore, P. P. Endocytosis and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 16 (2), 156-161 (2004).
- Eckert, G. P., Wood, W. G., Muller, W. E. Lipid membranes and beta-amyloid: a harmful connection. Current Protein and Pept Science. 11 (5), 319-325 (2010....
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