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利用pH敏感型荧光脂质类似物ND6测量膜脂质周转

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DOI：

10.3791/62717

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2021年7月29日

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1The Brain Institute at Florida Atlantic University, 2Department of Biomedical Sciences, Florida Atlantic University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Florida Atlantic University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种荧光成像方法，该方法利用一类对pH敏感的脂质荧光探针，用于监测细胞外排和内吞循环过程中的脂质膜运输。

摘要

胞吐/胞吞是一种介导细胞与其环境之间以及不同细胞之间生物分子交换的常见过程。特化细胞利用这一过程执行重要的生理功能，例如β细胞分泌胰岛素以及化学突触释放神经递质。由于其重要的生理意义，胞吐/胞吞一直是细胞生物学中最受关注的研究课题之一。研究人员已开发出多种工具，在基因和蛋白质水平上研究这一过程，因此目前对参与该过程的蛋白质分子机制已有深入了解。然而，针对膜脂质转换（即胞吐/胞吞的物理基础）的测量方法却极为有限。

本文介绍了一类具有pH依赖性荧光特性的新型荧光脂质类似物，并展示了其在追踪质膜与分泌囊泡之间脂质再循环中的应用。借助简单的pH调控，这些类似物还可用于量化脂质在细胞表面与细胞内膜区室间的分布，以及在胞吐/胞吞过程中脂质周转速率的测定。这类新型脂质探针将对细胞生物学、神经科学等多个生物学研究领域具有重要意义。

引言

脂质双分子层是最常见的生物分子组装结构之一，对所有细胞都不可或缺。在细胞外，它形成质膜，作为细胞与其环境之间的界面；在细胞内，它将各种具有特定功能的细胞器分隔开来。脂质膜并非静止不动，而是处于动态变化中，持续经历融合与分裂过程，从而介导生物物质的运输、细胞器的重塑、形态改变以及细胞间通讯。毫无疑问，脂质膜几乎是所有细胞活动的物理基础，其功能障碍在多种疾病中发挥关键作用，范围涵盖癌症1到阿尔茨海默病2。尽管脂质分子的多样性远低于蛋白质，但迄今为止的膜研究主要集中于蛋白质。例如，在胞吐作用中，人们对蛋白质机制的了解远多于对脂质的认识3,4,5。此外，与膜蛋白相比，细胞表面及细胞内膜上脂质的组织结构、分布、动态行为及其稳态调控在很大程度上仍未被充分探索6。

这并不令人意外，因为现代分子生物学技术（如诱变）在研究蛋白质方面比研究脂质具有方法学上的优势。例如，将pH敏感性绿色荧光蛋白（又称pHluorin）转基因标记到囊泡蛋白上，可实现对胞吐/胞吞过程中囊泡蛋白周转量和周转速率的定量测量7,8,9。然而，在活体（in vivo）中对膜脂质进行基因改造几乎是不可能的。此外，对蛋白质含量和分布进行定性甚至定量操控，也远比对脂质的操控更为可行10。尽管如此，研究人员已分离并开发出天然和合成的荧光脂质，用于在体外（in vitro）和活体（in vivo）模拟内源性膜脂质11。其中一类广泛使用的荧光脂质是苯乙烯基染料（如FM1-43），这类染料在膜环境中荧光增强，是研究神经元突触囊泡（SV）释放的有力工具12。近年来，环境敏感型脂质染料被发明并广泛用作一类新型报告分子，用于研究多种细胞膜特性，包括膜电位11、相有序性13和分泌过程14。

开发了一类新型的脂质模拟物，其荧光同时对pH敏感（例如pHluorin）和对膜敏感（例如FM1-43），可用于直接测量质膜以及内体/溶酶体中的脂质分布，以及胞吐/胞吞过程中的脂质运输。为此目的，选用了已知具有分子内电荷转移所导致的推拉特性的溶致变色荧光团。在现有的溶致变色荧光团中，1,8-萘酰亚胺（ND）骨架相对易于修饰，适用于多种标记方式，并在光物理性质上具有独特性15，因此已被用于DNA嵌入剂、有机发光二极管以及生物分子传感器16,17,18。

在ND骨架的C4位点连接一个给电子基团可形成推-拉结构，这种结构通过重新分布激发态的电子密度，使偶极矩增大19,20。此类分子内电荷转移可产生较高的量子产率和较大的斯托克斯位移，从而实现明亮且稳定的荧光21。本课题组近期基于ND骨架开发了一系列具有溶致变色特性的脂质类似物，并以较高的合成产率获得这些化合物20。

光谱表征显示，在这些产物中，ND6 具有最佳的荧光特性（图1）20。首先，与异硫氰酸荧光素、罗丹明或绿色荧光蛋白（GFP）等常用荧光染料相比，ND6 的激发峰和发射峰分离良好（分别为约 400 nm 和约 520 nm，见图2A、B），使其在光谱上可与这些染料区分，因而适用于多色成像。其次，ND6 的荧光在胶束存在下增强超过八倍（图2C），表明其具有强烈的膜依赖性。此前在多种活细胞中进行的荧光成像研究表明，ND6 可实现优异的细胞膜染色效果20。第三，当溶液 pH 从 7.5（常见于胞外或胞质环境）降低至 5.5（常见于内体和溶酶体）时，ND6 的荧光强度约增加两倍（图2D），显示出其对 pH 的敏感性。此外，分子动力学模拟表明，ND6 可快速嵌入脂双层中，其 ND 骨架朝向膜外侧，而哌嗪残基则与磷脂头部基团表现出强烈相互作用（图3）。综上所述，这些特性使 ND6 成为一种理想的荧光脂质类似物，可用于可视化和测量胞吐/胞吞过程中的膜脂质更新。

本文介绍了一种利用培养的小鼠海马神经元研究突触小泡（SV）脂质周转速率和动态变化的方法。通过使用高K+ Tyrode溶液刺激神经元，使突触小泡和质膜负载ND6（图4A、B）。随后，用不同的刺激再次激活神经元，接着使用含NH4Cl和pH 5.5的Tyrode溶液处理（图4D）。该方案可实现对不同条件下出胞和内吞速率的定量测量（图4C）。

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方案

以下方案包括：（1）基于已确立方案22的简化小鼠海马和皮层神经元培养建立流程；（2）用于活神经元成像的落射荧光显微镜系统的简要介绍；（3）在小鼠神经元中加载与成像ND6的详细操作描述；（4）关于利用ND6信号定量膜运输的讨论。所有操作均遵循佛罗里达大西洋大学的生物安全与IACUC指南。ND6的合成方法此前已有报道20。

1. 小鼠海马和皮层培养物的制备

注意：除非另有说明，所有步骤均须在生物安全二级的层流罩内进行。所有工具和材料均须灭菌。

  1. 使用5号镊子将玻璃盖玻片放入多孔培养板中。
    注意：例如，24孔板适用于12 mm 静态平衡图，ΣFx=0原理，展示力的平衡，箭头表示力矢量。 盖玻片。
  2. 加入适量体积的细胞外基质以包被细胞培养表面（例如，每12 mm 静态平衡图，ΣFx=0原理，展示力的平衡，箭头表示力矢量。 盖玻片加入75 μL基底膜基质溶液；参见材料表）。
  3. 将准备好的培养板置于组织培养孵育箱中（5% CO2、100%湿度、37 °C），孵育1–4小时，使基底膜基质交联。
  4. 处死动物，打开颅骨，将整个脑组织转移至含有3 mL含20%胎牛血清的汉克平衡盐溶液（HBSS）的35 mm培养皿中（H+20）。沿中线切开脑组织，并在层流通风解剖罩内分离皮层和海马体，以减少污染。
  5. 使用显微剪将组织剪成小块（约1 mm3），并将这些组织转移至含有5 mL H+20的15 mL锥形管中。
  6. 用5 mL H+20洗涤组织三次，再用5 mL HBSS洗涤三次。
  7. 加入1.5 mL含乙二胺四乙酸的1%胰蛋白酶，在37 °C孵育10分钟进行酶消化。
  8. 重复步骤1.6，最后使用真空装置吸除HBSS。
  9. 使用火焰抛光的玻璃移液管，在含有2.95 g/L MgSO4•7H2O的1 mL HBSS中机械解离组织。
  10. 将细胞悬液在400 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  11. 吸除上清液，并将细胞重悬于适量培养基中，使细胞浓度约为10,000,000个细胞/mL。
  12. 以约1,000,000个细胞/cm2的密度接种细胞，并将培养物置于孵育箱中（5% CO2、100%湿度、37 °C）孵育1–4小时，以促进细胞贴附于玻璃盖玻片。
  13. 加入适量培养基（例如，24孔板每孔1 mL）。1周后补充相同体积的新鲜培养基。2周后，每周更换一半原有培养基为新鲜培养基。

2. 活细胞荧光成像的显微镜设置

注意：一个典型的成像装置（图5）至少包括一台倒置荧光显微镜（参见材料表）、带有自动快门的荧光光源、荧光滤光片组（例如，用于成像ND6时，激发光使用405/10 BP，二向色镜使用495 LP，发射光使用510/20 BP）以及一个高灵敏度相机（材料表），所有这些组件均由图像采集软件（材料表）控制。

  1. 准备一个允许温度控制并具有灌流液输入/输出功能的成像室，用于活细胞荧光成像。
    注意：例如，本方案中使用了固定在加热平台上的改良开放式浴槽成像室（图6）。
  2. 设置可编程设备，以便在成像过程中于指定时间点切换灌流液并施加电刺激。
    注意：定量分析需要硬件与软件的同步。例如，在本方案中，成像相机的触发信号输出用于启动计算机程序，该程序控制自动切换装置，进而调控多通道灌流系统和方波刺激器（图7）。
  3. 为同时成像两种或多种荧光报告分子，可通过依次切换滤光片组，或通过同时分光将不同荧光发射信号分离并投射到同一相机上，实现多通道荧光成像。

3. 在神经元培养物中加载和成像ND6

  1. 称取适量 ND6，溶于二甲基亚砜（DMSO）中，室温下使其充分溶解；可短暂超声处理（例如 3 分钟）。使用 0.22 μm 滤膜过滤粗制储备液，以去除较大的染料聚集体。过滤后，使用常规或微量分光光度计在 405 nm 处通过吸收光谱法测定染料浓度，ε = 10,700 M-1 cm-1。
  2. 使用前，用灌流液将储备液稀释至 1 μM 的浓度。储备液应于室温避光保存。
  3. 内体和突触小泡的标记
    1. 为广泛标记内吞膜区室（如内体），将 ND6 储备液（例如 1 mM 的 DMSO 溶液）加入培养基中，终浓度为 1 µM，在 5% CO2、100% 湿度、37 °C 条件下孵育 30 分钟。为减少突触小泡标记程度，可药理学抑制神经元的自发活动。例如，使用河豚毒素（tetrodotoxin）阻断动作电位，或使用 2,3-二氧-6-硝基-1,2,3,4-四氢苯并[f]喹喔啉-7-磺酰胺（NBQX）和 D-(-)-2-氨基-5-膦基戊酸（D-AP5）抑制兴奋性突触传递23。
    2. 为选择性标记突触小泡，采用短暂而强刺激以诱发突触前膜的胞吐/内吞作用。首先，将培养盖玻片转移至含 2 mL 室温正常 Tyrode 液的 35 mm 静态平衡图，ΣFx=0 原理，展示力的平衡，箭头表示力矢量。 培养皿中。其次，将 ND6 储备液用高 K+ Tyrode 液（90 mM KCl）稀释至终浓度 1 μM。第三，用含 ND6 的高 K+ Tyrode 液替换培养皿中的正常 Tyrode 液，室温孵育 2 分钟。
  4. 将已标记 ND6 的细胞培养物转移至成像室，加入预热的含 10 μM NBQX 和 10 μM D-AP5 的正常 Tyrode 液。
  5. 调节灌流速度至约 0.2 mL/s（即每秒 1 滴），开始灌流含 NBQX 和 D-AP5 的预热正常 Tyrode 液，以清除培养物中过量的 ND6。
  6. 调节焦距，选择含有健康且铺展良好、具有连接神经突的细胞的视野。避免含有未溶解染料胶体的区域。
  7. 尝试以不同曝光时间对加载 ND6 的细胞进行成像，以确定最佳成像参数。
    注意：最佳曝光时间下，所得图像中最高像素荧光强度约为比特范围的一半（例如，对于 16 位图像，比特范围为 0 至 65,535），这可在酸性灌流液应用后荧光进一步增强时保留动态范围。所有 ND6 成像均应使用选定的曝光时间。
  8. 设置刺激与灌流程序、帧间隔和总持续时间。例如，在以下程序中，使用 30 秒基线期、10 秒 30 Hz 电场刺激、50 秒恢复期、120 秒 90 mM K+、60 秒恢复期、60 秒含 50 mM NH4Cl 的 Tyrode 液、60 秒 pH 5.5 的 Tyrode 液，帧间隔为 3 秒。
  9. 开始图像采集，同时同步进行刺激与灌流。在成像过程中监控刺激和溶液交换情况。
  10. 成像结束后停止灌流，取出盖玻片，并清洗成像室以备下一次实验使用。

4. 通过 ND6 荧光变化定量膜运输

  1. 备份和/或制作所有图像文件的电子副本。
  2. 选择用于数据提取的分析程序，例如开源图像分析软件 ImageJ24 和/或 FIJI25。
  3. 在分析程序中打开或导入图像堆栈。
  4. 将第一幅图像设为参考图像，并使用如 Rigid Registration26 等功能/插件将其余图像与其对齐，以减少因 xy 漂移引起的伪影。示例图像参见 图8。
  5. 对30秒预基线期间获取的所有图像进行平均，生成一幅参考图像。保存该图像副本以供后续参考。
  6. 设定强度阈值，从基线平均图像生成二值图像。
  7. 在 ImageJ 中使用 Watershed 功能，或在其他程序中使用类似功能，以分离相互连接的神经突或细胞。
  8. 使用 Analyze Particle 功能，设置适当的面积大小和圆形度，圈定对应于细胞膜、内体、溶酶体或突触小结的感兴趣区域（ROIs）。保存所有选定的 ROI。
  9. 在视野内无细胞区域选择四个背景 ROI。
  10. 测量图像堆栈每一帧中每个 ROI 的平均像素强度，并将结果导出用于统计分析。
  11. 计算背景 ROI 的平均强度作为基线噪声，该值将从每个 ROI 的平均像素强度中扣除。
  12. 在施加 pH 5.5 Tyrode 溶液期间，对每个选定 ROI 的平均像素强度取最高的三个值并求平均，得到最大荧光强度，定义为归一化的100%。
  13. 在施加 50 mM NH4Cl 期间，对每个选定 ROI 的平均像素强度取最低的三个值并求平均，设定为最小荧光强度，定义为归一化的0%。
  14. 根据每个 ROI 自身的0%和100%强度计算其相对荧光变化。从单个 ROI 数据中推导平均荧光变化、变化动力学及其他数值/图表。

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结果

突触小泡（SV）通过诱发的胞吐/胞吞作用专门负责神经递质的释放27。突触小泡具有高度酸性的腔内环境（即 pH 5.5），这非常适合ND6染色。我们采用高K+刺激来诱发突触小泡的胞吐/胞吞，从而使ND6能够进入突触小泡。正如预期，在加载后，沿神经元突起可见明亮的绿色荧光斑点（图9A）。图4B中的线轮廓显示ND6（绿色曲线）与FM4-64斑点（红色曲线）之间存在强烈重叠。ND6与FM4-64荧光强度之间的高度相关性也进一步表明ND6可特异性标记突触小泡（图9B）。

采用电刺激和高K+刺激分别诱导易释放囊泡池（RRP，即具有高释放概率的突触囊泡）和储备池囊泡（即具有低释放概率的突触囊泡）的释放。两种刺激均引起ND6荧光信号下降（图4C 和 图4E），表明...

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讨论

基于脂质的染料，如1,1′-二十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚羰花青（DiI）和3,3′-二十八烷基氧杂羰花青高氯酸盐（DiO），长期以来被用于显示细胞形态，并追踪神经元轴突投射等细胞过程。苯乙烯基类染料（如FM1-43）已被开发并成功用于胞吐作用的研究34。由于其对细胞膜的亲和力较低，在持续灌流过程中，保留在质膜上的染料会被洗脱，而被内吞的囊泡则可特异性地被染色并保留染料。因此，苯乙烯基染料不适用于对囊泡循环的持续监测。

最近发明的pH敏感型GFP（即pHluorin）使得当其与囊泡膜蛋白（如VAMPII或Synaptophysin）融合时，能够反复观察囊泡的循环过程35。依据相同原理，将pH敏感型荧光探针标记到脂质分子上，可在胞吐/胞吞循环过程中追踪脂质膜的循环14。在这种情况下，ND6作为一种单一的脂质分子，更易于制备，使用更简便，对脂质膜的标记效率更高，对细胞的干扰更小，在细胞膜中的稳定性更好，因此在荧光成像中更为可靠。其膜...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了佛罗里达大西洋大学本科生研究与探索办公室资助（M.J.S.）、佛罗里达州卫生部Ed和Ethel Moore试点项目资助20A17（Q.Z.）、阿尔茨海默病协会资助AARG-NTF-19-618710（Q.Z.）以及美国国家衰老研究所R21资助AG061656-01A1（Q.Z.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Digidata 1440A 数据采集系统Molecular DevicesDigidata 1440A用于同步刺激与溶液交换
双通道温度控制器Warner InstrumentsTC-344B用于活细胞成像
胎牛血清OMEGA ScientificFB-01用于配制解剖和组织培养中使用的 H+20 溶液
Hamamatsu Flash4.0 sCOMS 相机Hamamatsu Inc.C13440-20CU高灵敏度相机
汉克平衡盐溶液SigmaH6648用于配制解剖和组织培养中使用的 H+20 溶液
加热平台Warner InstrumentsPH-1用于活细胞成像
MatrigelBD Biosciences354234用于组织培养
Micro-G 振动隔离台TMC63-564用于活细胞成像
Micro-managerhttps://micro-manager.org/NA用于图像采集控制
多通道在线溶液加热器Warner InstrumentsSHM-6用于活细胞成像
Neurobasal Plus 培养基ThermoFisher ScientificA3582901用于组织培养
Nikon Ti-E 倒置显微镜NikonTi-E/B用于活细胞成像
ORCA-Flash4.0 数字 CMOS 相机HamamatsuC1340-20CU用于活细胞成像
灌流腔室Warner InstrumentsRC-26G用于活细胞成像
六通道阀控灌流系统Warner InstrumentsVC-6用于溶液交换
方波脉冲刺激器Grass InstrumentSD9用于电场刺激

参考文献

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ND6 pH

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