纯化位移核磁共振：植物代谢组学的新工具

摘要

本文介绍了PSYCHE和SAPPHIRE-PSYCHE在植物代谢谱分析中的应用，包括样品制备和获取最佳纯位移核磁共振谱的详细操作步骤。文中讨论了通过同核去耦合实现分辨率提升的实例，说明该技术有助于更全面地理解植物代谢系统。

摘要

核磁共振（NMR）是代谢组学中使用最强大的工具之一。它是一种高度准确且可重复的方法，不仅能够提供定量数据，还能实现对复杂混合物中代谢物的结构鉴定。

通过¹H核磁共振进行代谢谱分析已被证明在多种植物相关研究中具有重要价值，包括作物 状况评估、采收及采后处理、代谢表型分析、代谢通路研究、基因调控、生物标志物鉴定、化学分类学、质量控制、原产地认证等。然而，由于大量共振信号存在扩展的J-耦合多重性，导致信号重叠严重，这使得谱图分析与解释变得复杂，并成为传统¹H核磁共振代谢谱分析的局限性。

在过去十年中，为克服¹H NMR常规谱图固有的分辨率问题，人们开发出新型的核磁共振宽带同核去耦技术，可使多重峰信号坍缩为单一共振谱线，这类方法通常被称为纯位移（Pure Shift）方法。

本文提供了一种植物提取物制备的逐步操作方案，以及在三种不同植物基质——Vanilla 植物 叶片、马铃薯块茎（S. tuberosum）和南非香瓜茄（P. peruviana）中获取最优纯位移 PSYCHE 和 SAPPHIRE-PSYCHE 谱图的实验流程。同时讨论了与经典谱图相比，分辨率提升在代谢物鉴定、相关性分析及多变量分析中的影响。

引言

构成生物体的全部代谢物——包括生物过程中的底物、中间产物和终产物——在1998年被统称为“代谢组”（metabolome）。众所周知，代谢组与表型密切相关，在植物中尤其受到关注，因为它反映了基因型与环境之间的直接相互作用^1,2。因此，对植物代谢组谱的表征变得极为重要。通过鉴定和定量生物标志物（关键代谢物）以及代谢模式，已能够实现对物种、品种、发育阶段、病原性疾病或环境条件（如昼夜和季节变化、土壤类型、水分胁迫、机械胁迫、采收及采后处理）等之间的区分^3,4,5。

质谱法（MS）和核磁共振（NMR）波谱法是目前实现这一目标最常用的分析平台。与MS方法不同，NMR是一种高度可重复、无偏倚、可定量、准确且非破坏性的技术，所需样品前处理极少，因此适用于代谢组学研究。然而，与MS方法相比，NMR固有的低灵敏度是一个局限性。近年来，通过使用高场磁体、低温探针、微线圈装置以及动态核极化（DNP）方法，NMR的灵敏度已得到显著提升。例如，采用后一种方法时，灵敏度的提升幅度可达两个到三个数量级^6,

方案

1. 样品制备

1. 酸浆果
   1. 放置100-200 g新鲜 将果实放入搅拌机容器中，4 °C 条件下静置 30 分钟，然后在实验室搅拌机中匀浆。
   2. 立即转移果汁至50 mL塑料管中，用液氮速冻后冻干4至5天至完全干燥。
   3. 使用电动研磨机将冻干材料研磨成细粉。
      注意：由于该粉末具有强吸湿性，需快速操作以处理干燥物质。
   4. 称取1 g研磨后的材料，加入10 mL超纯水，涡旋振荡1 min。
   5. 在10 °C下超声处理20分钟，然后在23,000 × g 10 °C 下孵育 20 分钟。
   6. 回收上清液，并通过13 mm聚四氟乙烯（PTFE）0.45 µm针头滤器过滤。
   7. 将1 mL过滤后的提取物冻干至干燥，然后将所得固体重新悬浮于0.9 mL pH 4的200 mM草酸钠缓冲液中。涡旋混匀。
   8. 将所得样品冻干至完全干燥，然后溶于0.9 mL含有5 mM 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d的重水（D₂O）中。₄ 酸钠盐（TMSP-d₄).
   9. 使用微量移液器将0.6 mL样品加入核磁共振管中。
2. 香草 叶片
   1. 采集叶片，用湿润的纸巾擦拭清洁后，立即在液氮中整体冷冻。

结果

NMR 谱图分析
PSYCHE 实验通过将耦合共振峰坍缩为单峰，提高了谱图分辨率²¹，从而减少了峰重叠，有助于化学位移归属和数据分析。纯位移 NMR 可应用于植物提取物。本文展示了其在三种不同基质中的应用：香草叶片、马铃薯块茎和 Physalis peruviana 果实。从图 S8-S11中可明显看出，这些植物提取物谱图的分辨率得到了显著提升。

为了评估这些脉冲序列对NMR信号分辨率的影响，采用信号最大高度10%处的谱线宽度（以频率单位表示），即W₁₀，针对多种类型的共振进行了计算，所有类型均以通过以下方法获得的谱图为例说明 香草属 sp 提取物 - 纯化位移与经典方法的对比 ¹核磁共振氢谱 - 图4总体而言，耦合共振的扩展达到了 W₁₀ 1 到 60 Hz 的值，而单峰在 1 到 10 Hz 之间.......

讨论

代谢物的结构鉴定与定量是代谢组学表征中的关键问题，这些数据经过多变量分析后，有助于更深入地理解所研究的生物系统。样品制备和数据采集是需要优化的关键环节，以确保获得可靠的结果。

本文描述并图示了三种不同植物基质进行核磁共振（NMR）分析的样品制备方法。与任何提取方法一样，每克材料所使用的溶剂量以及所选溶剂的物理性质将决定最终提取物的化学组成及所提取代谢物的浓度。在NMR代谢组学分析中，pH值、独立样品提取之间的重现性以及NMR管中最终提取物的量也是需要优化的关键因素。代谢组学中重现性的重要性在于避免引入非相关性变异，从而导致不可靠的结果。根据我们的经验，使用干燥并研磨后的植物材料可获得最佳提取条件。对于南非醉茄（Cape gooseberries），干燥后的产物极难操作（高度吸湿性），因此需先将新鲜果实均质化，再进行冷冻干燥。

在谱图采集过程中，纯化位移（Pure Shift）实验设置尤为关键，因为错误的参数可能导致分段和重耦合伪影。理解纯化位移实验原理背后的理论（该理论已在其他文献中得到广泛综述

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
77500 系列 Freezone 4.5 升台式冷冻干燥机	Labconco	77500
Bruker Avance III 500 MHz 核磁共振波谱仪，配备 5 mm TCI Z-梯度低温探头	Bruker Corporation
Labconco 7310000 系列 Centrivap 冷冻离心浓缩仪	Labconco	7310000
重水	Sigma-Aldrich	151882
研磨机 MKM6003	Bosch	MKM6003
Waring 8011S 型 Hgb2wts3 搅拌机	Waring	Hgb2wts3
氘代甲醇	Sigma-Aldrich	151947