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方法文章

纯化位移核磁共振：植物代谢组学的新工具

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DOI：

10.3791/62719

⸱

2021年7月31日

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

本文内容

摘要

本文介绍了PSYCHE和SAPPHIRE-PSYCHE在植物代谢谱分析中的应用，包括样品制备和获取最佳纯位移核磁共振谱的详细操作步骤。文中讨论了通过同核去耦合实现分辨率提升的实例，说明该技术有助于更全面地理解植物代谢系统。

摘要

核磁共振（NMR）是代谢组学中使用最强大的工具之一。它是一种高度准确且可重复的方法，不仅能够提供定量数据，还能实现对复杂混合物中代谢物的结构鉴定。

通过1H核磁共振进行代谢谱分析已被证明在多种植物相关研究中具有重要价值，包括作物 状况评估、采收及采后处理、代谢表型分析、代谢通路研究、基因调控、生物标志物鉴定、化学分类学、质量控制、原产地认证等。然而，由于大量共振信号存在扩展的J-耦合多重性，导致信号重叠严重，这使得谱图分析与解释变得复杂，并成为传统1H核磁共振代谢谱分析的局限性。

在过去十年中，为克服1H NMR常规谱图固有的分辨率问题，人们开发出新型的核磁共振宽带同核去耦技术，可使多重峰信号坍缩为单一共振谱线，这类方法通常被称为纯位移（Pure Shift）方法。

本文提供了一种植物提取物制备的逐步操作方案，以及在三种不同植物基质——Vanilla 植物 叶片、马铃薯块茎（S. tuberosum）和南非香瓜茄（P. peruviana）中获取最优纯位移 PSYCHE 和 SAPPHIRE-PSYCHE 谱图的实验流程。同时讨论了与经典谱图相比，分辨率提升在代谢物鉴定、相关性分析及多变量分析中的影响。

引言

构成生物体的全部代谢物——包括生物过程中的底物、中间产物和终产物——在1998年被统称为“代谢组”（metabolome）。众所周知，代谢组与表型密切相关，在植物中尤其受到关注，因为它反映了基因型与环境之间的直接相互作用1,2。因此，对植物代谢组谱的表征变得极为重要。通过鉴定和定量生物标志物（关键代谢物）以及代谢模式，已能够实现对物种、品种、发育阶段、病原性疾病或环境条件（如昼夜和季节变化、土壤类型、水分胁迫、机械胁迫、采收及采后处理）等之间的区分3,4,5。

质谱法（MS）和核磁共振（NMR）波谱法是目前实现这一目标最常用的分析平台。与MS方法不同，NMR是一种高度可重复、无偏倚、可定量、准确且非破坏性的技术，所需样品前处理极少，因此适用于代谢组学研究。然而，与MS方法相比，NMR固有的低灵敏度是一个局限性。近年来，通过使用高场磁体、低温探针、微线圈装置以及动态核极化（DNP）方法，NMR的灵敏度已得到显著提升。例如，采用后一种方法时，灵敏度的提升幅度可达两个到三个数量级6,7。迄今为止，近20%已发表的代谢组学研究基于NMR技术，且这一比例正在上升7。

尽管质子核磁共振（Proton NMR）是核磁共振代谢组学指纹分析中最常用且最灵敏的实验方法，但它也存在一些缺点。首先，样品中检测到的所有1H NMR信号都分布在对应于质子化学位移范围的一个较窄窗口内，导致谱图拥挤。其次，同核标量耦合会使信号分裂为多个组分（信号多重性），将质子信号扩展到更宽的频率范围内，进一步加剧谱图的拥挤和信号重叠，使谱图解析更加复杂。此外，核磁共振代谢组学常用于分析通常含有50至300种在核磁共振可观测浓度范围内的分子的混合物，由此产生的谱图复杂，包含200至2000个峰。

同核去耦质子核磁共振（也称为纯位移技术）是一种将多重峰信号坍缩为单个峰的方法。该技术是提高拥挤谱图中信号分辨率的优良工具8,9,10，因此在植物代谢组学研究中具有重要应用价值11。

在过去十年中，新型的Pure Shift脉冲序列不断涌现，其灵敏度和去耦性能均得到提升。其应用范围也不断扩大，从分子结构解析12,13、代谢流量组学14、混合物归属15,16,17、扩散测量18、对映体区分19到共聚物中的单元分布20等众多领域。

从历史上看，宽带纯化学位移实验因灵敏度低且处理方法复杂，限制了其在生物提取物分析中的应用8。2014年，Foroozandeh 等人发表了一种新的纯化学位移实验方法——PSYCHE（通过啁啾激发实现纯化学位移，Pure Shift Yielded by Chirp Excitation），该方法基于反向-z-COSY脉冲序列，可实现优异的同核去耦并提高灵敏度21。然而，由于PSYCHE是一种二维干涉图实验，其数据采集以时域数据片段（chunk）方式进行，因此在片段边缘会因J耦合调制失真而产生周期性边带伪影。在复杂混合物中，这些伪影的信号强度可能超过极低浓度代谢物所产生的信号，从而阻碍分析11。目前有两种方法可用于消除此类伪影：TSE-PHYCHE22，以及近期对PSYCHE实验的改进方法SAPPHIRE-PSYCHE（通过残余J耦合进动的周期性相位增量实现边带平均，Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution）23。

2019年，我们首次证明11，SAPPHIRE-PSYCHE纯位移方法能够在几乎无灵敏度损失的情况下消除伪影23，并可用于分析复杂的生物混合物，例如Physalis peruviana（俗称秘鲁苦苹果）果实提取物11。我们表明，这些方法可提升代谢组学数据分析的性能，包括代谢物归属、相关性分析和多变量系数分析11。自此以后，已有多个针对不同生物基质的纯位移代谢组学研究相继开展，涉及软珊瑚24、金丝桃植物25、蜂蜜26,27、茶叶27、薄荷油26以及核桃28，进一步证明了该技术作为代谢组学分析新工具的重要性。然而矛盾的是，这些研究中的绝大多数采用的是标准且易于实现的PSYCHE脉冲序列（可从任意波谱仪数据库中获取），而非性能更优的SAPPHIRE-PSYCHE脉冲序列。后者虽然表现更佳，但需要对脉冲序列有更深入的理解才能正确设置。

本文旨在帮助新用户将Pure Shift方法应用于植物研究，特别是香草属（Vanilla sp）（V. planifolia 和 V. pompona）29、马铃薯块茎（S. tuberosum）30 以及南非香瓜茄（P. peruviana）31 的叶片研究。文中详细描述了样品制备、核磁共振实验设置、数据采集和数据分析过程。此外，本实验方案还包含关键提示，以帮助刚进入该领域的研究人员正确建立PSYCHE和SAPPHIRE-PSYCHE实验，用于植物代谢组学分析。

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方案

1. 样品制备

  1. 酸浆果
    1. 放置100-200 g新鲜 将果实放入搅拌机容器中，4 °C 条件下静置 30 分钟，然后在实验室搅拌机中匀浆。
    2. 立即转移果汁至50 mL塑料管中，用液氮速冻后冻干4至5天至完全干燥。
    3. 使用电动研磨机将冻干材料研磨成细粉。
      注意：由于该粉末具有强吸湿性，需快速操作以处理干燥物质。
    4. 称取1 g研磨后的材料，加入10 mL超纯水，涡旋振荡1 min。
    5. 在10 °C下超声处理20分钟，然后在23,000 × g 10 °C 下孵育 20 分钟。
    6. 回收上清液，并通过13 mm聚四氟乙烯（PTFE）0.45 µm针头滤器过滤。
    7. 将1 mL过滤后的提取物冻干至干燥，然后将所得固体重新悬浮于0.9 mL pH 4的200 mM草酸钠缓冲液中。涡旋混匀。
    8. 将所得样品冻干至完全干燥，然后溶于0.9 mL含有5 mM 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d的重水（D₂O）中。4 酸钠盐（TMSP-d4).
    9. 使用微量移液器将0.6 mL样品加入核磁共振管中。
  2. 香草 叶片
    1. 采集叶片，用湿润的纸巾擦拭清洁后，立即在液氮中整体冷冻。
    2. 将叶片破碎成小片，冷冻干燥4天直至完全干燥。
    3. 使用电动研磨机将干燥物质研磨成细粉。
    4. 称取50 mg研磨样品，加入0.75 mL含0.1% TMSP（w/w）的pH 6.0磷酸缓冲液（溶于重水）和0.75 mL甲醇-d4。涡旋振荡1分钟。
    5. 在25 °C下超声处理20分钟。
    6. 以 13,000 × g 离心 g 25 °C 下孵育 10 分钟。
    7. 回收上清液（约1.3–1.4 mL），并通过13 mm聚四氟乙烯（PTFE）0.45 µm针头滤器过滤。
    8. 使用移液器将0.6 mL过滤后的样品加入核磁共振管中。
  3. 马铃薯块茎
    1. 去皮并切片4到8个块茎。立即将约125 g样品放入直立袋中，并在液氮中速冻。
      ​注意：操作过程中为避免氧化，需保持马铃薯湿润。
    2. 冻干4至6天，直至完全干燥。
    3. 使用电动研磨机将干燥物质研磨成细粉。
    4. 称取160 mg研磨后的块茎，加入1.6 mL去离子水，涡旋振荡1分钟。
    5. 在10 °C下超声处理45分钟。
    6. 在 23,000 x g 下离心 g 10 °C 下孵育 20 分钟。
    7. 回收上清液（约1.5–1.6 mL），在4°C下使用冷冻离心真空浓缩仪蒸发至干燥，持续16 h。
    8. 将所得固体（20–25 mg）加入0.9 mL pH 4的100 mM草酸钠缓冲液，涡旋混匀，于10 °C下蒸发16小时。
    9. 将所得固体溶于0.9 mL含有3 mM TMSP的重水（D₂O）中。
    10. 在10 °C条件下以23,000 × g离心5分钟，并通过13 mm聚四氟乙烯（PTFE）0.45 µm针头滤器将上清液直接过滤至核磁共振（NMR）样品管中。
      ​注意：本实验中，为减少1000多个样品的制备步骤，直接将滤液收集至核磁共振（NMR）样品管中。

2. 核磁共振数据采集与处理

  1. 核磁共振初始设置
    1. 将样品转移至核磁共振波谱仪。
    2. 调节并匹配探头。
    3. 固定并调节样品。
    4. 校准90°硬脉冲。使用任意标准流程校准90°脉冲。
    5. 运行标准的一维质子核磁共振谱。
  2. PSYCHE 实验
    1. 从Bruker Topspin序列库中选择reset_psyche_1d脉冲序列（图 S1）。使用以下标准参数：5 kHz 谱宽（SW2），至少1或2秒的弛豫恢复延迟（D1），16次虚拟扫描（DS），每组64或128个复数数据点（L31），以及64或128次扫描（NS）（图 S1).
      注意：L31 是每个纯位移区块中获取的复杂数字点数，最好设置为 2 的幂次。21
    2. 设置所需的CHIRP脉冲翻转角激发（CNST61）和10 kHz的CHIRP脉冲带宽（CNST60）（图 S2).
      注意：PSYCHE 实验基于反向 z-COSY 方案；因此，CHIRP 脉冲的翻转角需要较小，以避免产生重耦合伪影图1）。绝对强度随激发翻转角的增大而增加。周期性伪影也随之增强，扩散至整个谱图并增大其强度 "噪声" (图1）。该 "噪声" 成为标准噪声和分段伪影的组合。在灵敏度和低重耦合伪影之间的一个良好折衷是将 CNST61 设为 20°。19,22
    3. 将硬脉冲长度（P1）设为先前校准的值，PSYCHE 形状脉冲长度设为 30 ms（P49）图 S2).
      注意：校准硬脉冲值非常重要，因为形状脉冲的功率将根据此值自动计算。
    4. 选择 Crp_psyche.20 (SPNAM 37) 形状脉冲用于 PSYCHE 模块（图S2).
    5. 设置在 PSYCHE 模块期间施加的脉冲场梯度强度（GPZ0）。选择 RECT.1 作为梯度形状脉冲（GPNAM 0）图 S2).
      注意：在 PSYCHE 序列中通常施加一个弱磁场梯度，其强度一般为梯度最大强度的 1% 至 4%，具体取决于探头类型。
    6. 设置采集的块数以重建纯相位位移FID（TD1）图 S3).
      注意：PSYCHE 以伪二维实验方式采集，其中 TD1 为纯位移干涉图块的数量。谱图分辨率取决于谱宽（SW1）和采集的总数据点数，总数据点数为 TD1×2×L31。通常，采用 16 或 32 个块，每块包含 64 或 128 个复数点，即可提供足够的数字分辨率。由于 PSYCHE 以干涉图方式记录，增加块的数量可提高数字分辨率，但同时也会延长总采集时间。19. 同核的 J-耦合在每个区块中演化，导致振荡 J 调制模式21,23经过傅里叶变换后，会产生依赖于块长度的周期性边带伪影图2）。为了减少伪影，该区块的持续时间必须较短，通常小于 16 ms（区块持续时间 = 2*in0: 图 S1）。如果方块持续时间较长，请减小 L31。
    7. 使用布鲁克公司的 Proc_reset AU 程序处理数据并进行傅里叶变换。
      注意：我们建议使用零填充和正弦钟形截短函数对谱图进行变换（图 S4).
  3. SAPPHIRE-PSYCHE 实验
    1. 选择 SAPPHIRE-PSYCHE 脉冲序列并设置脉冲序列参数。标准参数如下：5 kHz 谱宽（SW3），至少 1 或 2 秒的弛豫延迟（D1），16 次虚扫描（DS），每次增量采集 8 或 16 次扫描（NS），D2 设置为 14 ms图 S5).
      注意：该序列不在布鲁克（Bruker）的标准序列库中，但可通过曼彻斯特核磁共振方法学小组网站获取该序列及相应的处理程序（https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426）。23. D2 延迟可确保每次 J 调制增量时 T2 弛豫保持恒定。D2 必须大于 1/4*SW1 + p16 + 2*d16。23
    2. 设置所需的 CHIRP 脉冲翻转角激发（CNST20）和 10 kHz 的 CHIRP 脉冲带宽（CNST21）（图 S6).
      注意：与常规 PSYCHE 实验相同，CHIRP 脉冲翻转角需较短，以避免重耦合伪影。CNST20 = 20° 在灵敏度与低重耦合伪影之间提供了良好折衷。21,23,25.
    3. 将硬脉冲长度（P1）设为先前校准的值，PSYCHE 形状脉冲长度设为 30 ms（P40）图 S6).
      注意：必须校准硬脉冲的数值，因为形状脉冲的功率将据此自动计算。
    4. 为 PSYCHE 模块选择 PSYCHE_Saltire_10kHz_30m 形状脉冲（图 S6).
    5. 设置在 PSYCHE 模块期间施加的脉冲场梯度强度（GPZ10）。选择 RECT.1 作为梯度形状脉冲（GPNAM 10）图 S7).
      注意：在 PSYCHE 序列中通常施加一个弱磁场梯度，其强度为梯度最大值的 1% 至 4%，具体数值取决于探头。
    6. 设置SAPPHIRE的数量 J F2（TD2）中的调制增量（图 S7).
      注意：通常 8 个增量即可有效抑制边带伪影（图2 和 3最终纯化位移FID的扫描总数为NS*TD2。23
    7. 设置F1和F2谱窗（SW1和SW2）图 S5).
      注意：SW2 = SW3/(2×TD2) 且 SW3/SW1 = TD2×N，其中 TD2 和 N 为偶数整数23SAPPHIRE-PSYCHE 实验以伪三维方式采集，其中 F2 编码 J-耦合伪影相位调制与F1纯位移干涉图采集20由于SAPPHIRE-PSYCHE能够消除 J 调制边带，干涉图纯位移区块的持续时间可能比常规PSYCHE更长（纯位移区块持续时间 = 1/SW1），通常在20至40毫秒之间（图2。然而，较长的数据块采集会导致更高的 J-偶联演化，这将需要更多 J-将相位调制增量与强边带的消除相耦合23.
    8. 设置纯位移区块的数量（TD1）（图 S7).
      注意：由于 SAPPHIRE-PSYCHE 需要补偿 J-偶联 第一块的相位调制需要额外采集一个数据块。通常，17（16+1）或33（32+1）个数据块可提供足够的数字分辨率23.
    9. 执行 pm_pshift 和 pm_fidadd AU 程序处理数据，随后进行傅里叶变换23.
      注意：我们建议使用零填充和正弦钟形截短函数对谱图进行变换（图 S4).

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结果

NMR 谱图分析
PSYCHE 实验通过将耦合共振峰坍缩为单峰，提高了谱图分辨率21，从而减少了峰重叠，有助于化学位移归属和数据分析。纯位移 NMR 可应用于植物提取物。本文展示了其在三种不同基质中的应用：香草叶片、马铃薯块茎和 Physalis peruviana 果实。从图 S8-S11中可明显看出，这些植物提取物谱图的分辨率得到了显著提升。

为了评估这些脉冲序列对NMR信号分辨率的影响，采用信号最大高度10%处的谱线宽度（以频率单位表示），即W10，针对多种类型的共振进行了计算，所有类型均以通过以下方法获得的谱图为例说明 香草属 sp 提取物 - 纯化位移与经典方法的对比 1核磁共振氢谱 - 图4总体而言，耦合共振的扩展达到了 W10 1 到 60 Hz 的值，而单峰在 1 到 10 Hz 之间...

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讨论

代谢物的结构鉴定与定量是代谢组学表征中的关键问题，这些数据经过多变量分析后，有助于更深入地理解所研究的生物系统。样品制备和数据采集是需要优化的关键环节，以确保获得可靠的结果。

本文描述并图示了三种不同植物基质进行核磁共振（NMR）分析的样品制备方法。与任何提取方法一样，每克材料所使用的溶剂量以及所选溶剂的物理性质将决定最终提取物的化学组成及所提取代谢物的浓度。在NMR代谢组学分析中，pH值、独立样品提取之间的重现性以及NMR管中最终提取物的量也是需要优化的关键因素。代谢组学中重现性的重要性在于避免引入非相关性变异，从而导致不可靠的结果。根据我们的经验，使用干燥并研磨后的植物材料可获得最佳提取条件。对于南非醉茄（Cape gooseberries），干燥后的产物极难操作（高度吸湿性），因此需先将新鲜果实均质化，再进行冷冻干燥。

在谱图采集过程中，纯化位移（Pure Shift）实验设置尤为关键，因为错误的参数可能导致分段和重耦合伪影。理解纯化位移实验原理背后的理论（该理论已在其他文献中得到广泛综述

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究由秘鲁国家科学、技术和技术创新委员会（CONCYTEC）——科研人员吸引计划 Cienciactiva 项目资助，合同编号 # 008-2017-FONDECYT。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
77500 系列 Freezone 4.5 升台式冷冻干燥机Labconco77500
Bruker Avance III 500 MHz 核磁共振波谱仪，配备 5 mm TCI Z-梯度低温探头Bruker Corporation
Labconco 7310000 系列 Centrivap 冷冻离心浓缩仪Labconco7310000
重水Sigma-Aldrich151882
研磨机 MKM6003BoschMKM6003
Waring 8011S 型 Hgb2wts3 搅拌机WaringHgb2wts3
氘代甲醇Sigma-Aldrich151947

参考文献

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