本文详细描述了人多能干细胞来源的小肠和结肠类器官的生成、维持及表征方法。这些方法旨在提高实验可重复性，扩大可扩展性，并减少类器官接种和传代所需的工作时间。
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摘要
摘要
肠道区域特化是指在胃肠道（GI）发育过程中，赋予其特定区域独特形态与功能的过程。肠道的区域特化由多种发育通路驱动，其中包括骨形态发生蛋白（BMP）通路。基于正常的肠道区域特化机制，研究人员已建立一种从人多能干细胞（hPSCs）——包括人胚胎干细胞（hES）和诱导性多能干细胞（iPSCs）——生成人结肠类器官（HCOs）的方法。通过为期三天的BMP信号诱导，足以将中/后肠管样培养物定向分化为特异性表达富含AT序列结合蛋白2（SATB2）的HCOs，这些HCOs包含人类结肠中存在的所有主要上皮细胞类型以及共发育的间充质细胞。在此关键的模式形成阶段若省略BMP刺激（或加入BMP抑制剂NOGGIN），则会形成人类肠道类器官（HIOs）。HIOs和HCOs在形态和分子特征上分别类似于人类发育中的小肠和结肠。尽管HIOs和HCOs在研究人类肠道发育方面具有重要价值，但其生成过程仍具挑战性。本文介绍了HIOs和HCOs的生成、维持与表征方法，并提供了实验方案中的关键步骤及常见问题的解决方案。
引言
由于对人类胎儿组织的使用存在限制，研究人类结肠发育十分困难。动物模型具有不可估量的价值，历史上常通过小鼠的遗传学方法来研究肠道发育。然而，小鼠与人类在肠道发育方面存在差异，限制了小鼠作为模型系统的适用性。例如，尽管小鼠小肠和结肠的隐窝形成发生在出生后，但人类出生时已具有完全形成的隐窝1。此外，人类小肠和结肠中存在一些在小鼠中未发现的细胞类型，包括小肠中表达胃动素（motilin, MLN）的肠内分泌细胞2，以及结肠中表达黏蛋白5B（mucin 5B, MUC5B）的杯状细胞3,4。因此，建立一种能够准确模拟结肠发育早期阶段动态分子事件的细胞培养系统显得尤为重要。因此，将人多能干细胞（hPSCs）定向分化为具有结肠特征的细胞，为研究人类结肠发育提供了一个强有力的模型。
已开发出相关方案以促进可重复性5，同步且高效地形成类肠结构6 类结肠类器官7 来自hPSCs。这些方案采用逐步分化程序，模拟胎儿肠道和结肠的发育过程（图1。首先， 定形内胚层由人多能干细胞经Activin A（一种Nodal类似物）处理而生成。将定形内胚层暴露于高水平的WNT和成纤维细胞生长因子（FGF）可诱导其发生形态发生，转化为CDX2+ 中后肠管类球体。中肠/后肠类球体随后被包埋于细胞外基质（ECM）中，并通过短暂调控BMP信号通路定向分化为HIOs或HCOs。使用NOGGIN抑制BMP信号或仅添加生长培养基可诱导形成HIOs，其形态类似于人类近端小肠。
通过使用BMP2激活BMP信号通路，中/后肠类球体被诱导形成具有上皮和间充质模式特征的结肠类器官（HCOs），且其模式特征得以维持7HCOs 含有富含结肠、表达 MUC5B 的杯状细胞，并能够生成结肠特异性的表达胰岛素样 5（INSL5）的肠内分泌细胞。从 HCOs 中分离的间充质表达同源框 A13（HOXA13）和 HOXD13，这些基因也在人原代结肠间充质中表达。8需要牢记的是，模式化步骤发生在分化方案的第7至10天。这一为期三天的阶段足以诱导结肠模式化，且该模式在后续延长培养中仍可维持。 体外 培养
以下所述方案适用于熟悉无饲养层hPSC培养的研究人员。对于不熟悉此类hPSC培养的研究人员，建议参加由Stem Cell Technologies或辛辛那提儿童医院多能干细胞中心（PSCF）等机构提供的hPSC培训课程。起始hPSC的质量至关重要，会影响所有后续步骤。本方案从已培养4天、准备传代的hPSC开始。
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方案
1. 人肠道和结肠类器官的生成
- 制备细胞外基质包被的培养板
- 向50 mL离心管中加入50 mL冷的DMEM培养基。
- 移取一份4倍浓度的hESC认证ECM（参见 材料表从 -80 °C 冰箱中取出并在冰上解冻。
注意：请参考产品分析证书以确定配制4倍浓缩液所需的经ESC验证的ECM体积。 - 如果hESC鉴定合格的ECM未完全解冻，可从50 mL离心管中取750 µL DMEM与ECM混合。
- 将DMEM/hESC合格的ECM混合物转移至含有DMEM的50 mL锥形管中，充分混匀。每块24孔细胞培养板的每个孔中加入0.5 mL，共处理4块板。
- 轻轻摇动培养板，使细胞外基质（ECM）均匀覆盖整个孔表面，确保完全覆盖。使用封口膜密封已包被ECM的培养板，并置于生物安全柜中室温孵育至少1小时。将包被好的ECM培养板于4 °C保存，可存放至多2周或直至使用。
- hPSCs 单细胞接种
- 将包被有细胞外基质的24孔板置于生物安全柜中30分钟，使其达到室温。
- 将mTeSR1完全培养基、细胞解离溶液和高级DMEM置于37 °C水浴中，预热30分钟。
- 验证hPSCs的融合度至少达到85%，且分化程度最低。如有必要，去除已分化的细胞。
- 在50 mL锥形管中配制铺板培养基，组分如下：13 mL mTeSR1和13 µL 10 mM Y-27632 Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。
注意：Y-27632 可抑制失巢凋亡，提高单细胞存活率。 - 从6孔板中收集细胞时，吸出3至4个孔的培养基，每孔用2 mL高级DMEM洗涤一次。
- 吸弃高级DMEM，每孔加入1 mL细胞解离溶液。将培养板置于5% CO₂培养箱中孵育5–7分钟。237 °C 培养箱。在显微镜下检查细胞是否处于悬浮状态。
- 使用5 mL移液管上下吹打4至5次，以分散残留的细胞团块。
- 向每个孔中加入 2 mL 高级 DMEM，轻轻吹打 4–5 次，转移至 15 mL 圆锥管中。在 300 × g 室温下持续3分钟。
- 从离心管中吸除培养基，注意不要吸走细胞沉淀，加入6 mL预先配制好的含ROCK抑制剂的mTeSR1培养基。用移液器轻柔吹打3-4次，使细胞重悬，随后将细胞悬液转移至装有其余mTeSR1/ROCK抑制剂培养基的50 mL离心管中。剧烈吹打重悬4-5次，使用血细胞计数板进行细胞计数。
- 在接种细胞前，吸出24孔板中的细胞外基质。用移液器轻轻吹打细胞2-3次，重新悬浮细胞，每孔加入0.5 mL细胞悬液。
注意：最佳铺板密度需由实验人员确定。此处，每孔的最佳细胞数量为 80,000–200,000 个细胞。 - 轻轻将培养板顺时针摇晃3次，逆时针摇晃3次，前后摇晃3次，再左右摇晃3次，以均匀分散细胞。
- 将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中2 培养箱中孵育24小时。
注意：在最初几小时内不要移动培养板，以确保细胞在孔内充分分散。 - 24 小时后（图2A），吸除废液培养基，每孔加入0.5 mL mTeSR1培养基，于37 °C、5% CO₂条件下再次孵育2 24 小时（图2B），然后进入下一步。
- 从人多能干细胞（hPSCs）分化为定型内胚层（DE）
- 在15 mL圆锥形离心管中，加入13 mL Activin Day 1培养基（参见 材料表），13 µL 100 µg/mL Activin A 和 1.95 µL 100 µg/mL BMP4。将培养基在37 °C水浴中预热。
- 从24孔板中吸除mTeSR1培养基，每孔加入0.5 mL Activin Day 1培养基。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中2 培养箱中孵育24小时。24小时后检查细胞。
注意：应能明显观察到广泛的细胞死亡，如图所示。 图2C尽管单层细胞看起来较为稀疏，但细胞克隆已经扩展。 - 在15 mL锥形管中，将12.5 µL浓度为100 µg/mL的Activin A加入12.5 mL Activin Day 2培养基中，配制Activin Day 2完全培养基。将该管置于37 °C水浴中。
- 从 CO₂ 培养箱中取出 24 孔分化培养板2 培养箱，移除用过的培养基。每孔加入0.5 mL预热的Activin Day 2培养基，将培养板放回CO₂培养箱中2 孵育箱中孵育24小时。
注意：添加培养基时应小心操作。切勿将培养基直接加入孔中央，以免冲散单层细胞。应沿孔壁缓慢加入培养基。次日将形成完整的细胞单层，细胞死亡极少。此时细胞融合度应达到约90%至95%（图 2D). - 在15 mL圆底管中，将12.5 µL浓度为100 µg/mL的Activin A加入12.5 mL Activin Day 3培养基中，配制Activin Day 3完全培养基。将试管置于37 °C水浴中。
- 吸除用过的培养基，每孔加入0.5 mL Activin Day 3培养基。
注意：添加培养基时应小心操作。切勿将培养基直接加入孔中央，以免导致单层细胞脱落。应沿孔壁缓慢加入培养基。次日，单层细胞应达到完全汇合状态，此阶段应仅有极少或无细胞死亡。若在加入Activin Day 3培养基24小时后单层细胞仍未汇合，则不应尝试生成中后肠类球体。请参考 图 2E 在进行中后肠类球体生成之前，DE单层细胞应具备理想的形态特征。 - 优化定型内胚层分化时，对单层细胞进行叉头框A2蛋白（FOXA2）和Y染色体性别决定区框转录因子17（SOX17）的免疫荧光（IF）染色。
- 定向前肠内胚层分化为中后肠类球体
- 在50 mL锥形管中加入25 mL含FGF4的中后肠诱导培养基（不含CHIR99021），置于37 °C水浴中30 min。
- 在培养基温热后，加入7.5 µL CHIR99021，以配制完整的中后肠诱导培养基。
- 移除用过的培养基，每孔加入 0.5 mL 中后肠诱导培养基，于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养2 24 小时。
- 单层细胞在次日发生凝聚后（图3A），弃去旧培养基，加入新鲜的中后肠诱导培养基，将培养板放回37 °C、5% CO₂培养箱中2 孵育箱中孵育24小时。
注意：在中后肠诱导48小时后，管状结构将变得明显，如图所示 图3B第3天，中后肠类球体将开始从单层细胞中出芽，如图所示。 图3C. - 为避免更换培养基时丢弃漂浮的类球体，将旧培养基转移至15 mL离心管中，在300 × g 孵育1分钟。将类球体重悬于12.5 mL新鲜的中后肠诱导培养基中，每孔加入0.5 mL至同一24孔板中，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养。2 24小时。
- 第4天，后肠诱导（图3D），通过将培养基收集至15 mL离心管中，离心（300 × g 孵育1分钟。随后进行下一步，将中后肠类球体包埋于细胞外基质（ECM）中。
- 中后肠类球体在细胞外基质中的接种与图案化
关键词：类球体，中后肠，细胞外基质，图案化，三维培养，肠道发育，干细胞
- 解冻 ECM 4 °C 过夜孵育基底膜基质后再进行包埋。
注意：此细胞外基质（ECM）与适用于人胚胎干细胞的细胞外基质不同。ECM 应置于冰上，将适量体积的 ECM 在冰上分装至预冷的 1.5 mL 微量离心管中。 表1 包含有关细胞外基质（ECM）体积的信息。确保在将类球体包埋的液滴中，ECM体积至少占75%。 - 将24孔板置于37 °C培养箱中预热。
- 使用1000 µL移液器收集所有24孔板中的悬浮类球体，并转移至15 mL锥形离心管中。在300 × g 室温下孵育1分钟。吸除大部分培养基，但保留铺板所需的液体体积（表1).
- 用剪刀剪去1000 µL和200 µL移液枪吸头的尖端。取出预热的24孔板。
- 将悬浮的类球体混合后，转移适当体积至置于冰上的细胞外基质（ECM）管中，然后用移液器吹打混匀，使类球体与ECM充分重悬并混合均匀。
- 使用剪去尖端的200 µL枪头吸取65 µL类球体与细胞外基质（ECM）的混合物，加入24孔板每个孔的中央。为确保形成良好的ECM液滴，在排液过程中应缓慢轻柔地提起移液枪。
注意：每孔接种30-100个球状体。 - 轻轻将培养板转移至37 °C、5% CO₂的培养箱中2 培养箱中孵育5分钟。
- 将培养皿倒置，孵育15–25分钟，以帮助细胞外基质液滴维持圆顶状结构。
- 孵育期间，准备所需的培养基并预热。待ECM凝固后，向每孔加入0.5 mL HIO-或HCO-模式化培养基，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育。2请参见 图3E 用于显示类球体在细胞外基质中图像。
- 将类球体在图案化培养基中培养3天。
- 3 天后，将 HIO 或 HCO 诱导培养基更换为常规生长培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养2.
注意：此时间点（第10天）的类器官处于早期阶段。根据项目目标，部分早期类器官可用于早期模式形成分析，具体步骤见第2节。
- 解冻 ECM 4 °C 过夜孵育基底膜基质后再进行包埋。
- 人肠道和结肠类器官的扩增与传代
- 第10天后，每3天更换一次培养基。
注意：根据类器官的铺板密度和生长情况，可能需要更频繁地更换培养基。应在培养基中的酚红（pH指示剂）变黄之前进行换液。 - 将类器官培养至第21天（图 3F).
注意：BMP2处理将导致从球体生长出的类器官数量减少（约为HIOs的三分之一）。因此，生成HCOs时需要接种更多的球体。
- 第10天后，每3天更换一次培养基。
- 第21天类器官的分割
- 观察类器官。
注意：由于类器官的生长和扩张，到第21天时细胞外基质（ECM）几乎已降解，因此需在第21天进行类器官传代。 - 通过剪切末端来准备1000 µL和200 µL移液器吸头。
- 将24孔Nunc板置于37 °C培养箱中预热。
- 将适量体积的ECM分装至预冷的1.5 mL离心管中（表1).
- 轻轻刮取细胞外基质 用1000 µL移液枪头吸取含有类器官的液滴，并反复吹打数次以解离细胞外基质（ECM）。
- 将混合物转移至60 mm培养皿中，在显微镜下观察类器官。如有必要，使用无菌镊子将类器官彼此分离，注意分离过程不得损伤类器官的上皮结构。
- 将类器官转移至15 mL锥形管中，在300 × g 30秒。吸除上清液，离心管中保留约1 mL培养基。
注意：培养基的体积可根据实验目的进行调整。若需在每滴细胞外基质中培养更多类器官，可减少培养基体积；若需减少类器官数量，则可增加培养基体积。 - 将类器官充分混匀，取适当体积转移至置于冰上的细胞外基质（ECM）管中，然后通过移液吹打重悬类器官与ECM，使其充分混匀。
- 使用剪裁过的200 µL枪头，将65 µL类球体与ECM的混合物加入24孔板每个孔的中央。
注意：吸液时必须先吸取类器官，再吸取细胞外基质（ECM）。因此，在分配混合液时，类器官应位于ECM液滴的上部。 - 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 孵育5分钟。
- 将培养板倒置放置，持续15-25分钟，以帮助ECM液滴维持圆顶状结构。
- 向每个孔中加入 0.5 mL HIO/HCO 扩增培养基，在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育2.
注意：模式化后，HIO 和 HCO 的出芽培养基相同。 - 每2-3天更换一次培养基，直至第35天（图3G).
- 观察类器官。
2. 通过逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）验证类器官的模式形成
- 在收集RNA之前，按照制造商的说明配制1x RNA裂解缓冲液。
- 弃去旧培养基，向24孔板的每个孔中加入350 µL裂解缓冲液。使用1 mL移液器反复吹打，使类器官裂解。为获得更好的裂解效果，可在最大转速下短暂涡旋5秒。
- 将所有样品保存在-80 °C，直至进行RNA提取。准备提取时，从-80 °C冰箱中取出RNA样品，在冰上解冻10分钟。在室温下剧烈涡旋管子10-15分钟，以确保样品完全裂解。
- 再次将样品置于冰上，并按照制造商的说明进行RNA提取。如果暂不进行下一步操作，将RNA样品转移至-80 °C冰箱保存。
- 采用标准方法进行RNA提取、DNA酶处理、cDNA合成和RT-qPCR。引物名称和序列列表请参见表2。
3. 通过免疫荧光验证类器官的模式形成
- 类器官的收集与固定
- 吸除相应孔中的 HIO 或 HCO 培养基，每孔加入 1 mL 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）。使用剪切过的 200 µL 移液枪头将类器官从细胞外基质（ECM）中解离。上下吹打以使 ECM 大块与类器官分离。
- 将类器官转移至 15 mL 圆锥形离心管中，加满冰 PBS，轻轻颠倒混匀。静置使类器官自然沉降，随后吸除 PBS。
注意：若类器官未能自然沉降，可在 300 × g 条件下离心 1 分钟。 - 吸除 PBS，加入 1 mL 冰冷的 ECM 降解溶液。将离心管置于冰上，在旋转平台上轻柔振荡，孵育 10–15 分钟。
注意：将离心管倾斜 45° 角，以确保类器官与细胞回收溶液充分混合。10–15 分钟后，类器官应沉降至管底，表明 ECM 已完全消化。 - 向管中加入冷 PBS 至 15 mL，通过反复颠倒充分混匀。待类器官沉降至管底后，吸除 PBS，加入 1 mL 预冷的 4% 多聚甲醛以固定类器官。将类器官在冰上用 4% 多聚甲醛固定 1 小时。
- 用冰 PBS 加满离心管，水平放置于摇床上，4 °C 过夜。次日，将多聚甲醛/PBS 溶液倒入指定废液容器中，并按照步骤 3.1.2 的方法用 15 mL 冰 PBS 洗涤一次。
- 吸除 PBS，向管中加入 PBS 配制的 30% 蔗糖溶液。将离心管水平放置于摇床上，4 °C 过夜。
- 次日，将类器官包埋于 7 mm × 7 mm × 5 mm 的模具中，使用 OCT 包埋剂，并通过干冰/乙醇浴快速冷冻。
- 用实验室擦拭纸擦干组织块，包裹于纸巾中，置于 -80 °C 冰箱中过夜。次日，使用冷冻切片机将组织切成 5 µm 厚的切片，并贴附于载玻片上。将载玻片储存于 -80 °C。
- 类器官的免疫荧光染色
- 从 -80 °C 冰箱中取出载玻片，按照标准操作流程进行免疫荧光染色。
- 为载玻片加盖盖玻片，在室温下避光干燥至少 2 小时或过夜，随后进行成像。
- 使用共聚焦显微镜的 25 倍物镜对载玻片进行成像。
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结果
在中/后肠诱导阶段成功生成类球体表明模式化诱导成功。对悬浮的类球体及单层细胞进行 CDX2 的免疫荧光染色，以确认模式化正确。尽管在定型内胚层（DE）阶段的染色可反映 DE 诱导的效果，但若 DE 诱导效率不足，则无法形成类球体。为检测 DE 诱导效率，需进行 FOXA2 和 SOX17 的免疫荧光染色和/或 RT-qPCR 分析。
在模式形成阶段之后，HOX因子的表达是判断模式形成是否成功最佳指标。HOX因子主要在肠和结肠间充质中表达8,9因此，HOX 因子的表达将反映间充质的模式形成。前部 HOX 因子 mRNA 的表达 HOXD3 在NOGGIN处理的HIOs中应最高，在表皮生长因子（EGF）处理的HIOs中较低，在BMP处理的HCOs中最低。相反， HOXA13 和 HOXD13 HIOs 中的 mRNA 表达水平应较低，而 HCOs 中应较高（图4
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讨论
将hPSCs分化为HIOs和HCOs是一个复杂的过程，每一步均需进行质量控制。起始的hPSCs在启动向定型内胚层（DE）分化前应保持最低限度的自发分化。优化用于DE分化的hPSCs接种密度对该方案的成功至关重要。为确保DE分化的质量，应进行FOXA2和SOX17的免疫荧光（IF）检测，以评估DE分化的效率。DE分化后，应有超过80%的处理细胞对FOXA2和SOX17呈阳性染色。一旦确定了最佳接种密度，可在多个实验中使用相同的密度，以获得相似的成功率。在成功完成DE分化后，中/后肠诱导应具有很高的效率。在细胞外基质（ECM）中接种后，使用BMP2对中/后肠类球体进行模式诱导会降低类器官从球体形成的效率（约15%）。因此，与HIOs相比，HCOs的生成应每ECM液滴接种2至3倍数量的球体。
不同细胞系进行定型内胚层（DE）分化时所需的最适密度各不相同。然而，某些细胞系仅使用Activin A难以有效分化为DE。如果多次实验均失败，可在第1天的Activin A培养基中添加5–15 ng/mL的BMP4。已有研究表明，添加BMP4可通过抑制多能性因子SOX2来改善DE分化效果
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
Múnera 实验室由以下机构资助：NIH/NCI 5U54CA210962-02 南卡罗来纳州癌症差异研究中心（SC CADRE）、NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 消化与肝脏疾病 COBRE 项目，以及 NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC 消化疾病研究核心中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% 牛血清白蛋白（BSA）溶液 | N/A | N/A | N/A |
| 15 mL Corning 管 | Falcon | 21008-918 | N/A |
| 30% 蔗糖 | N/A | N/A | 在 PBS 中配制。 |
| 5% 正常驴血清 | 杰克逊免疫研究实验室 | 017-000-121 | N/A |
| 50 mL Corning 管 | Falcon | 21008-951 | N/A |
| Accutase | 赛默飞世尔科技 | A1110501 | 细胞解离液；将5 mL的Accutase分装至10 mL离心管中，共分装20管，于-20℃保存 °C，最长可保存6个月。使用前置于4℃ °使用前于4°C过夜。 |
| 激活素A | 细胞导向系统 | GFH6-100x10 | 将冻干粉以100重悬 µg/mL，溶于含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌PBS中。分装38 µ将 Activin A 加入预冷的微量离心管中，并于 -80 保存 °C（试管自收到之日起12个月内有效）。 |
| Activin 第1天培养基（RPMI 1640） | 康宁 | MT10041CV | 使用非必需氨基酸（NEAA，Corning 11140050），并在 4 ℃ 保存 °C. 基础第1天培养基：500 mL RPMI 1640 和 500 mL NEAA。配制Activin第1天培养基时，加入13 mL基础第1天培养基，13 µl of 激活素A（100 µ克/毫升），以及 2 µl of BMP4（100 µ微克/毫升）。基础培养基在添加生长因子前可稳定保存长达3周，但添加生长因子后应立即使用。 |
| Activin 第2天培养基（RPMI 1640，0.2% FBS，体积比） | Hyclone | SH30070.03T | 使用非必需氨基酸（Corning 11140050），并于 4 ℃ 保存 °C. 基础第2天培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 1 mL 0.2% 血清。配制Activin第2天培养基时，加入12.5 mL基础第2天培养基和12.5 mL µL of Activin A (100 µg/mL）。基础培养基在添加生长因子前可稳定保存长达3周，但添加生长因子后应立即使用。 |
| Activin 第3天培养基（RPMI 1640，2% FBS 体积比） | Hyclone | SH30070.03T | 使用非必需氨基酸（Corning 11140050），并在 4 ℃ 保存 °C. 基础第3天培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 10 mL 2% 血清。配制Activin第3天培养基时，加入12.5 mL基础第3天培养基和12.5 mL µL of 激活素A (100 µg/mL）。基础培养基可稳定保存长达3周，但在添加生长因子后应立即使用。 |
| Alexa Fluor 488 驴抗山羊 | 赛默飞世尔科技 | A11055 | 1:500 稀释（二抗） |
| Alexa Fluor 488 驴抗兔 | 赛默飞世尔科技 | A21206 | 1:500 稀释倍数（二抗） |
| Alexa Fluor 546 驴抗小鼠 | 赛默飞世尔科技 | A10036 | 1:500 稀释（二抗） |
| Alexa Fluor 647 驴抗小鼠 | 赛默飞世尔科技 | A31571 | 1:500 稀释倍数（二抗） |
| 基模 | Fisher | 22-363-552 | N/A |
| 基础肠道培养基（高级DMEM） | Gibco | 12491015 | 配制基础肠道培养基时，加入500 mL DMEM、500 mL N2（Gibco 17-502-048）、500 mL B27（Gibco）、500 mL L-谷氨酰胺以达到2 mM L-谷氨酰胺（Corning A2916801）、5 mL 100 U/mL 青霉素-链霉素（Gibco 15-140-122）以及7.5 mL 1 M HEPES 溶液稀释至 15 mM HEPES。 基础培养基可稳定保存长达3周，但在添加生长因子后应立即使用。 |
| 伯乐CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | 伯乐（Bio-Rad） | N/A | 其他qRT-PCR系统也可使用。 |
| 细胞回收溶液 | 康宁 | 354253 | 细胞外基质降解溶液 |
| CHIR99021 | Reprocell | 4000410 | 加入 2.15 mL DMSO 配制成 10 mM 溶液进行重悬。配制 50 µL 等分试样，于 -20 保存 °C. 将粉末在 4℃ 下保存 °避光，4°C保存。 |
| CTRL HIO成像培养基 | N/A | N/A | 基础肠道培养基和100 ng/mL EGF |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:100 稀释（二抗） |
| DE单层细胞 | N/A | N/A | 单层细胞已在先前步骤中制备（第4.4节）。 |
| Dispase | Gibco | 17105041 | 将冻干粉重悬于高级DMEM培养基（Gibco MT15090CV）中，配制成终浓度为1 mg/mL的溶液。使用Millipore滤器灭菌管通过真空抽滤对溶液进行过滤除菌。分装为10 mL每份（1 mg/mL），于-20℃保存。 °C，最长可保存6个月。使用前置于4℃ °使用前于4°C过夜保存。 |
| EGF | 赛默飞世尔科技 | 236-EG-01M | 配制 100 ng/mL EGF 时，将 500 µg/mL，加入2 mL无菌PBS至1 mg EGF中，配制成500 µg/mL EGF 溶液。分装 100 µ20 支试管中加入 EGF。 |
| Fisherbrand 6 cm 培养皿（带透明盖） | Fisher | FB0875713A | N/A |
| Fisherbrand 细胞刮刀 | Fisher | 08-100-240 | N/A |
| Fisherbrand B级透明玻璃螺口小瓶（带盖） | Fisher | 03-338B | N/A |
| Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管 | Fisher | 13-678-2D0 | N/A |
| Fluoromount G 封片剂 | VWR | 100241-874 | N/A |
| Gibco 高级 DMEM | Gibco | 12-491-023 | N/A |
| 山羊抗E-钙黏蛋白 | R&D 系统 | AF648 | 1:400 稀释（一抗） |
| 山羊抗SOX17 | R&D 系统 | AF1924 | 1:500 稀释（一抗） |
| HCOs 图案化培养基 | N/A | N/A | 基础肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL BMP2。配制BMP2时，向BMP2小瓶中加入1 mL无菌的含0.1% BSA的4 mM HCl（100 µg). 分装 25 µ4管BMP4溶液，每管1 L。 基础培养基可稳定保存长达3周，但在添加生长因子后应立即使用。 |
| 血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | Z359629 | N/A |
| 人类多能干细胞（hPSC） | 多能干细胞中心 | N/A | 在 Matrigel 包被的 24 孔板（Thermo Scientific 73520-906）中接种细胞。 |
| 冰冻的4%多聚甲醛溶液（PFA） | N/A | N/A | N/A |
| 冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS） | N/A | N/A | pH 必须为 7.4。 |
| ImmEdge 疏水屏障笔 | Vector Laboratories | 101098-065 | N/A |
| 诱导性多能干细胞（iPSCs） | 多能干细胞中心（辛辛那提儿童医院医学中心） | N/A | 其他hESC或iPSC细胞系也可使用，但需针对每种细胞系优化本实验方案。 |
| Leica切片机 | N/A | N/A | N/A |
| LSM 880 | 共聚焦显微镜 | ||
| Matrigel 基底膜基质 | 康宁 | 354234 | N/A |
| Matrigel hESC-认证基质 | 康宁 | 354277 | 准备4份Matrigel分装液，每份体积足以配制出用于4个6孔板的稀释Matrigel。 |
| 中后肠诱导培养基（RPMI 1640） | 康宁 | MT10041CV | 非必需氨基酸（Corning 11140050），2% FBS（体积分数）（Hyclone SH30070.03T），3 µM CHIR99021 和 500 ng/mL FGF4。基础培养基可稳定保存长达3周，但在添加生长因子后应立即使用。 |
| 中后肠类球体 | N/A | N/A | N/A |
| 默克生命科学 Steriflip 无菌一次性真空滤器装置 | MilliporeSigma | SCGP00525 | N/A |
| 小鼠抗 CDX2 | BioGenex | MU392-UC | 1:300 稀释（一抗） |
| 小鼠抗FOXA2 | Abnova/Novus | H00003170-M01 | 1:500 稀释度 |
| mTeSR1 完全生长培养基 | 干细胞技术 | 85870 | 将100 mL mTeSR补充剂（85870）加入400 mL mTeSR培养基（85870）中，混匀后分装至50 mL离心管中，注意避免污染。4 ℃保存°C，直至使用。 |
| 默里氏透明液（又称BABB） | 默里的 | N/A | 1:2 苄醇与苯甲酸苄酯 |
| NOG HIO 图案化培养基 | N/A | N/A | 基础肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL NOGGIN（分装 25） µ250 中的 g NOGGIN µ含0.1% BSA的无菌PBS |
| NucleoSpin RNA | Takara | 740955.25 | 可使用其他RNA提取试剂盒。 |
| Nunclon Delta 表面组织培养皿，24 孔（Nunc） | 赛默飞世尔科技 | 73521-004 | N/A |
| Nunclon Delta 表面组织培养板，24 孔，Matrigel 包被 | 赛默飞世尔科技 | 73521-004 | N/A |
| Nunclon Delta 表面组织培养皿，6 孔（Nunc） | 赛默飞世尔科技 | 73520-906 | N/A |
| Nunclon Delta 表面组织培养皿，6 孔，包被有 Matrigel | 赛默飞世尔科技 | 73520-906 | N/A |
| HIOs、CTRL HIOs 和 HCOs 的类器官生长培养基 | N/A | N/A | 基础肠道培养基和100 ng/mL EGF（终浓度） |
| 磷酸盐缓冲液，含 0.5% Triton X（PBS-T） | N/A | N/A | N/A |
| 引物 | Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT) | N/A | 引物列于方案中的表2。 |
| 兔抗 CDX2 | Cell Marque | EPR22764Y | 1:100 稀释（一抗） |
| 兔抗 SATB2 | Cell Marque | EP281 | 1:100 稀释（一抗） |
| 重组人BMP-4蛋白 | R&D系统 | 314-BP-010 | 将冻干粉以100重悬 µg/mL，溶于含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌4 mM盐酸溶液中。将4.17 mL盐酸溶液加入45.83 mL分子生物学用水中，定容至50 mL，得到1 M盐酸溶液。然后加入200 µ将1 M HCl溶液取0.2 mL加入49.8 mL分子生物学级水中，总体积为50 mL，配制成4 mM HCl。随后将0.05 g BSA加入50 mL 4 mM HCl中，过滤除菌。将无菌的4 mM HCl含0.1% BSA溶液分装至33个微量离心管中，分装完毕后于-20 ℃保存。 °C. 加入100 µ向 BMP4 小瓶（10）中加入 l 的无菌 4 mM HCl 0.1% BSA µg) 配制 100 的 BMP4 溶液 µg/mL |
| 重组人 FGF-4 蛋白 | R&D系统 | 235-F4-01M | 以100重悬 µg/mL，溶于含0.1%牛血清白蛋白的无菌PBS中。将0.05 g BSA加入50 mL PBS中配制成0.1% BSA，经0.22 μm滤膜过滤。 µM BSA 以灭菌 BSA。将 0.1% BSA 每管 10 mL 分装至 5 支试管中。在 10 mL 无菌 0.1% BSA 中加入 1 mg FGF-4。分装 250 µ将 L 分装至预冷的 40 个微量离心管中，于 -80 保存 °C. |
| ROCK抑制剂Y-27632 | Tocris | 1254 | 最终浓度为 10 mM（10 mmol/L）。用 DMSO 溶解至 10 mM 并过滤除菌。每支小瓶中加入 3 mL 无菌 PBS。分装 100 µROCK抑制剂L，分装至30个管中，于-20℃保存 °C. |
| SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | 11-754-250 | N/A |
| SuperFrost Plus 显微镜载玻片 | |||
| Tissue Tek O.C.T. 包埋剂 | VWR | 25608-930 | N/A |
参考文献
- Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
- Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
- van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
- Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
- Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
- Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
- Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
- Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
- Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
- Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
- Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
- Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
- Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
- Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
- Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
- Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
- McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
- Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
- Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).
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