Method Article

人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持和表征

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里描述了生成、维持和表征人类多能干细胞衍生的小肠和结肠类器官的详细方法。这些方法旨在提高可重复性、扩大可扩展性并减少类器官铺板和传代所需的工作时间。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肠道区域规范描述了一个过程，通过该过程，独特的形态和功能被赋予发育中的胃肠道 （GI） 的确定区域。肠道中的区域规范由多种发育途径驱动，包括骨形态发生蛋白 （BMP） 途径。基于正常的区域规范，开发了一种从人多能干细胞 （hPSC） 生成人结肠类器官 （HCO） 的方法，其中包括人胚胎干细胞 （hES） 和诱导多能干细胞 （iPSC）。BMP 信号传导的 3 天诱导将中/后肠管培养物充分模式化为特殊的富含 AT 的序列结合蛋白 2 （SATB2） 表达的 HCO，其中包含人结肠中存在的所有主要上皮细胞类型以及共同发育的间充质细胞。在这个关键模式期间省略 BMP（或添加 BMP 抑制剂 NOGGIN）导致人肠道类器官 （HIO） 的形成。HIO 和 HCOs 在形态和分子上分别类似于人类发育中的小肠和结肠。尽管 HIO 和 HCO 可用于研究人类肠道发育，但 HIO 和 HCO 的生成具有挑战性。本文介绍了生成、维护和表征 HIO 和 HCO 的方法。此外，还提供了协议中的关键步骤和故障排除建议。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于对人类胎儿组织的使用受到限制，研究人类结肠发育很困难。动物模型具有不可估量的价值，历史上曾用于小鼠的遗传方法以研究肠道发育。然而，小鼠和人类肠道发育之间的差异限制了小鼠作为模型系统的适用性。例如，虽然小鼠的小肠和结肠中的隐窝形成发生在出生后，但人类出生时就有完全形成的隐窝1。此外，人类小肠和结肠包含小鼠中没有的细胞类型，包括小肠中表达胃动素 （MLN） 的肠内分泌细胞2 和结肠中表达粘蛋白 5B （MUC5B） 的杯状细胞 3,4。因此，拥有一个能够准确模拟定义结肠发育早期阶段的动态分子事件的细胞培养系统非常重要。因此，指导 hPSCs 产生具有结肠特征的细胞为研究人类结肠发育提供了一个强大的模型。

已经开发了方案，以促进 hPSC 可重现5、同步和高效地形成肠样6 和结肠样类器官7 。这些方案使用模拟胎儿肠道和结肠发育的逐步分化程序（图 1）。首先，通过用 Activin A（一种 Nodal 模拟物）处理，从人多能干细胞中产生最终内胚层。最终内胚层暴露于高水平的 WNT 和成纤维细胞生长因子 （FGF） 诱导形态发生为 CDX2 + 中/后肠管球体。然后将中肠/后肠球体嵌入细胞外基质 （ECM） 中，并通过 BMP 信号转导的瞬时作形成 HIO 或 HCO。使用 NOGGIN 或单独添加生长培养基抑制 BMP 信号传导会导致 HIO 的形成，类似于人类近端小肠。

通过使用 BMP2 激活 BMP 信号传导，中/后肠球体被图案化为 HCO，HCO 保留在上皮和间充质7 中。HCO 包含富含结肠、表达 MUC5B 的杯状细胞，能够产生表达结肠特异性胰岛素样 5 （INSL5） 的肠内分泌细胞。来自 HCO 的分离间充质表达同源框 A13 （HOXA13） 和 HOXD13，它们也在人原代结肠间充质8 中表达。重要的是要记住，图案化步骤发生在分化方案的第 7-10 天。这三天的时间足以诱导结肠模式，该模式在长时间 的体外 培养后得以维持。

下面描述的方案适用于熟悉无饲养层 hPSC 培养的研究人员。对于不熟悉此类 hPSC 培养的研究人员，建议参加 hPSC 培训课程，例如 Stem Cell Technologies 或辛辛那提儿童医院的多能干细胞设施 （PSCF） 提供的培训课程。起始 hPSC 的质量至关重要，会影响所有下游步骤。接下来的方案将从已经生长 4 天并准备分裂的 hPSC 开始。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 人类肠道和结肠类器官的产生

  1. 制备 ECM 涂层板
    1. 将 50 mL 冷 DMEM 培养基加入 50 mL 锥形管中。
    2. 从 -80 °C 冰箱中取出 4x hESC 合格的 ECM 等分试样（参见 材料表），并在冰上解冻。
      注：请参阅产品的分析证书，以确定制备 4x 储备液所需的 ESC 合格 ECM 的体积。
    3. 如果符合 hESC 要求的 ECM 未完全解冻，请从 50 mL 锥形管中取出 750 μL DMEM，并与 ECM 混合。
    4. 将符合 DMEM/hESC 要求的 ECM 混合物转移到含 DMEM 的 50 mL 锥形管中并充分混合。每孔添加 0.5 mL 到 4 x 24 孔细胞培养板中。
    5. 摇动板，将 ECM 均匀地分布在整个孔中，以确保覆盖整个表面。使用封口膜，密封 ECM 涂层板，并在室温下在生物安全柜中放置至少 1 小时。将 ECM 包被的板在 4 °C 下储存长达 2 周或直到需要为止。
  2. hPSCs 单细胞铺板
    1. 将 ECM 涂层的 24 孔板放入生物安全柜中 30 分钟，使其达到室温。
    2. 将mTeSR1完全培养基、细胞分离溶液和高级DMEM置于37°C水浴中，让它们预热30分钟。
    3. 验证 hPSC 是否至少达到 85% 汇合且分化最小。如有必要，去除任何分化的细胞。
    4. 在 50 mL 锥形管中制备铺板培养基，如下所示：13 mL mTeSR1 和 13 μL 10 mM Y-27632 Rho 相关蛋白激酶 （ROCK） 抑制剂。
      注意：Y-27632 抑制失巢凋亡并增加单细胞的存活率。
    5. 要从 6 孔板中收集细胞，请从 3 至 4 个孔中吸出培养基，并用每孔 2 mL 高级 DMEM 洗涤一次。
    6. 吸出高级 DMEM，并将 1 mL 细胞解离溶液分配到每个孔中。将板在 5% CO2、37 °C 培养箱中孵育 5-7 分钟。在显微镜下检查细胞是否处于悬浮状态。
    7. 通过使用 5 mL 移液器上下移液 4-5 次来解离任何剩余的细胞团块。
    8. 向每个孔中加入 2 mL 高级 DMEM，轻轻上下移液 4-5 次，然后转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以 300 × g 离心细胞 3 分钟。
    9. 从试管中吸出培养基而不吸出细胞沉淀，并加入 6 mL 制备的 mTeSR1 加 ROCK 抑制剂培养基。通过上下吹打 3-4 次轻轻重悬细胞，然后将悬浮液转移到 50 mL 管内的其余 mTeSR1/ROCK 抑制剂培养基中。剧烈重悬 4-5 次，并使用血细胞计数器计数细胞。
    10. 在铺板细胞之前从 24 孔板中吸出 ECM。通过上下吹打 2-3 次再次重悬细胞，并在每个孔中分配 0.5 mL 细胞悬液。
      注意：最佳电镀密度需要由实验者确定。在这里，最佳细胞数量为每孔 80,000-200,000 个细胞。
    11. 顺时针轻轻摇动板 3 次，逆时针 3 次，前后 3 次，左右 3 次，以均匀分散细胞。
    12. 将板转移到 37 °C、5% CO2 培养箱中并孵育 24 小时。
      注：最初几个小时内不要干扰板，以确保细胞在孔内正确分散。
    13. 24 小时后（图 2A），吸出用过的培养基，每孔加入 0.5 mL 的 mTeSR1，在 37 °C、5% CO2 下再次孵育 24 小时（图 2B），然后进行下一步。
  3. 确定性内胚层 （DE） 与 hPSC 的分化
    1. 在 15 mL 锥形管中，加入 13 mL 激活素第 1 天培养基（参见 材料表）、13 μL 100 μg/mL 激活素 A 和 1.95 μL 100 μg/mL BMP4。在 37 °C 水浴中加热培养基。
    2. 从 24 孔板中吸出 mTeSR1 培养基，每孔加入 0.5 mL Activin Day 1 培养基。将板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中并孵育 24 小时。24 小时后检查细胞。
      注意：广泛的细胞死亡应该是明显的，如图 2C 所示。虽然单层看起来稀疏，但细胞集落会扩大。
    3. 通过在 15 mL 锥形管中将 12.5 μL 100 μg/mL 激活素 A 添加到 12.5 mL 激活素第 2 天培养基中来制备激活素第 2 天完全培养基。将试管置于 37 °C 水浴中。
    4. 从 CO2 培养箱中取出 24 孔分化板，并去除用过的培养基。每孔分配 0.5 mL 预热的 Activin Day 2 培养基，然后将板放回 CO2 培养箱中 24 小时。
      注：分配培养基时应小心。不要直接在孔的中心分配培养基，因为这会分离单层中的细胞。小心地沿孔侧面分配培养基。第二天，形成单层细胞，细胞死亡可以忽略不计。细胞现在应该达到 ~90% 至 95% 的汇合度（图 2D）。
    5. 通过在 15 mL 锥形管中将 12.5 μL 100 μg/mL 激活素 A 添加到 12.5 mL 激活素第 3 天培养基中来制备激活素第 3 天完全培养基。将试管置于 37 °C 水浴中。
    6. 去除用过的培养基，每孔分配 0.5 mL Activin Day 3 培养基。
      注意：分配培养基时应小心。不要直接在孔的中心分配培养基，因为这会分离单层中的细胞。小心地沿孔侧面分配培养基。第二天，单层应达到完全汇合，在此阶段几乎没有细胞死亡。如果在添加 Activin Day 3 培养基后 24 小时单层未汇合，请勿尝试生成中后肠球体。在继续生成中后肠球体之前，请参阅 图 2E 以了解 DE 单层的理想形态。
    7. 在优化 DE 分化时，对叉头盒 A2 蛋白 （FOXA2） 和性别决定区 Y （SRY）-盒转录因子 17 （SOX17） 的表达进行单层免疫荧光 （IF） 染色。
  4. DE 分化为中后肠球体
    1. 在 50 mL 锥形管中，加入 25 mL 含 FGF4（无CHIR99021）的中后肠诱导培养基，并将其置于 37 °C 水浴中 30 分钟。
    2. 要制备完整的中后肠诱导培养基，请在培养基温热后加入 7.5 μL CHIR99021。
    3. 取出用过的培养基，每孔分配 0.5 mL 中后肠诱导培养基，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 24 小时。
    4. 第二天单层内细胞浓缩后（图 3A），用新鲜的中后肠诱导培养基替换用过的培养基，并将板放回 37 °C、5% CO2 培养箱中 24 小时。
      注意：中后肠诱导 48 小时后，管状结构将很明显，如图 3B 所示。中后肠球体将在第 3 天开始从单层中出芽，如图 3C 所示。
    5. 为避免在更换培养基时丢弃漂浮的球体，请将旧培养基转移到 15 mL 试管中，并以 300 × g 离心 1 分钟。将球体重悬于 12.5 mL 新鲜的中后肠诱导培养基中，每孔加入 0.5 mL 到同一个 24 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 下孵育 24 小时。
    6. 在后肠诱导的第 4 天（图 3D），通过将培养基收集到 15 mL 管中，然后以 300 × g 离心 1 分钟，从板孔中收获漂浮的球体。继续下一步，将中后肠球体嵌入 ECM 中。
  5. ECM 中/后肠球体的电镀和图案化
    1. 包埋前在 4 °C 下解冻 ECM 基底膜基质过夜。
      注意：此 ECM 与经 hESC 认证的 ECM 不同。应将 ECM 置于冰上，并将适当体积的 ECM 分装到冰上预冷的 1.5 mL 微量离心管中。 表 1 包含有关 ECM 卷的信息。确保 ECM 的体积至少为微球将嵌入的液滴中的 75%。
    2. 在 37 °C 培养箱中加热 24 孔板。
    3. 使用 1000 μL 移液器从所有 24 孔中收集浮动球体，并将它们转移到 15 mL 锥形管中。在室温下以 300 × g 离心球体 1 分钟。吸出大部分培养基，但保留铺板所需的体积（表 1）。
    4. 通过切开 1000 μL 和 200 μL 移液器吸头的末端来制备它们。取出预热的 24 孔板。
    5. 混合浮动球体，将适当体积转移到置于冰上的 ECM 管中，然后通过移液重悬球体和 ECM 以充分混合。
    6. 用切割的 200 μL 移液器吸头取 65 μL 球状体和 ECM 混合物，并加载到 24 孔板中每个孔的中心。为确保形成良好的 ECM 液滴，请在分配混合物时轻轻缓慢地提起移液管。
      注意：每孔板 30-100 个球体。
    7. 轻轻地将板转移到 37 °C、5% CO2 培养箱中并孵育 5 分钟。
    8. 将板倒置并孵育 15-25 分钟，这将有助于 ECM 液滴保持圆顶状结构。
    9. 在孵育过程中，准备所需的培养基并加热。ECM 固化后，在每个孔中加入 0.5 mL 的 HIO 或 HCO 模式化培养基，并在 37 °C、5% CO2 下孵育。有关 ECM 中球体的图像，请参见 图 3E 。
    10. 将球体在图案培养基中培养 3 天。
    11. 3 天后，将 HIO 或 HCO 模式培养基更换为正常生长培养基，并在 37 °C、5% CO2 下孵育。
      注意：此时（第 10 天）的类器官是早期类器官。根据项目目标，一些早期类器官可用于早期模式分析，如第 2 节所述。
  6. 人肠道和结肠类器官的生长和传代
    1. 第 10 天后，每 3 天更换一次生长培养基。
      注：根据铺板密度和类器官的生长，可能需要更频繁地更换培养基。应在培养基中的酚红（pH 指示剂）变为黄色之前更换培养基。
    2. 孵育类器官直至第 21 天（图 3F）。
      注意：BMP2 处理将导致从球体生长的类器官数量减少（比 HIO 少 ~3 倍）。因此，需要电镀更多的球体来生成 HCO。
  7. 第 21 天类器官的分裂
    1. 检查类器官。
      注意：类器官需要在第 21 天分裂，因为由于类器官的生长和扩增，ECM 在第 21 天几乎降解。
    2. 切开 1000 μL 和 200 μL 移液器吸头的末端，准备它们。
    3. 在 37 °C 培养箱中加热 24 孔 Nunc 板。
    4. 将适当体积的 ECM 分装到预冷的 1.5 mL 试管中（表 1）。
    5. 用 1000 μL 移液器吸头轻轻刮擦带有类器官的 ECM 液滴，然后上下移液数次以打碎 ECM。
    6. 将混合物转移到 60 mm 培养皿中，并在显微镜下检查类器官。如有必要，使用无菌镊子将类器官彼此分离。确保分离不会损坏类器官的上皮。
    7. 将类器官转移到 15 mL 锥形管中，并以 300 × g 离心 30 秒。吸出上清液，在试管中留下 ~1 mL 培养基。
      注意：培养基的体积可以根据实验的目的进行更改。如果每个 ECM 液滴需要更多的类器官，则可以减少培养基体积。但是，如果需要较少的类器官，则可以增加培养基体积。
    8. 将类器官充分混合，将适当体积转移到置于冰上的 ECM 管中，然后通过移液重悬类器官和 ECM 以充分混合。
    9. 使用切割的 200 μL 移液器吸头，将 65 μL 球状体和 ECM 混合物添加到 24 孔板的每个孔的中心。
      注意：在移液过程中，首先吸收类器官，然后吸收 ECM 至关重要。因此，在分配混合物时，类器官位于 ECM 液滴的顶部。
    10. 将板放入 37 °C、5% CO2 培养箱中 5 分钟。
    11. 将板再倒置 15-25 分钟，以帮助 ECM 液滴保持圆顶状结构。
    12. 在每个孔中加入 0.5 mL 的 HIO/HCO 生长培养基，并在 37 °C、5% CO2 下孵育。
      注：图案化后，HIO 和 HCO 的生长培养基相同。
    13. 每 2-3 天更换一次培养基，直到第 35 天（图 3G）。

2. 通过逆转录定量聚合酶链反应 （RT-qPCR） 验证类器官的模式化

  1. 在收集 RNA 之前，请按照制造商的说明准备 1x RNA 裂解缓冲液。
  2. 丢弃用过的培养基，向 24 孔板的每个孔中加入 350 μL 裂解缓冲液。通过使用 1 mL 移液器上下移液来裂解类器官。为了更好地裂解，以最大速度短暂涡旋 5 秒。
  3. 将所有样品保持在 -80 °C，直到准备好进行 RNA 提取。准备好后，从 -80 °C 冰箱中取出 RNA 样品，并在冰上解冻 10 分钟。在室温下剧烈涡旋试管 10-15 分钟，以确保样品完全裂解。
  4. 将样品再次放在冰上，然后按照制造商的说明进行 RNA 提取。如果尚未准备好，请将 RNA 样品转移到 -80 °C 冰箱中进行下一步。
  5. 使用标准方法进行 RNA 提取、DNAse 处理、cDNA 合成和 RT-qPCR。有关引物名称和序列的列表，请参阅 表 2 。

3. 通过免疫荧光验证类器官的模式

  1. 类器官的收集和固定
    1. 从适当的孔中吸出 HIO 或 HCO 培养基，并向每个孔中加入 1 mL 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。使用切割的 200 μL 移液器吸头将类器官从 ECM 上解离。上下移液以将大块 ECM 与类器官分离。
    2. 将类器官转移到 15 mL 锥形管中，用冰冷的 PBS 填充管的其余部分，然后倒置管子轻轻混合。让类器官在重力作用下沉降并吸出 PBS。
      注：如果类器官未因重力而沉降，则以 300 × g 离心 1 分钟。
    3. 吸出 PBS 并加入 1 mL 冰冷的 ECM 降解溶液。将试管在冰上轻轻摇动，在冰上放置 10-15 分钟。
      注：将试管倾斜 45° 角，以使类器官和细胞回收溶液适当混合。10-15 分钟后，类器官应沉降到试管底部，表明 ECM 完全消化。
    4. 在试管中加入冷 PBS，最多 15 mL;将试管倒置数次，充分混匀。当类器官沉降到试管底部时，吸出 PBS 并加入 1 mL 预冷的 4% 多聚甲醛以固定类器官。将类器官与 4% 多聚甲醛在冰上孵育 1 小时。
    5. 用冰冷的PBS填充管的其余部分，并将其水平放置在4°C的摇摆平台上过夜。第二天，将多聚甲醛/PBS 丢弃在指定的废液容器中，并用 15 mL 冰冷的 PBS 洗涤一次，如步骤 3.1.2 所述。
    6. 吸出 PBS 并用 PBS 中的 30% 蔗糖填充试管。将管子水平放置在 4 °C 的摇床平台上过夜。
    7. 第二天，将类器官用 OCT 培养基包埋在 7 mm x 7 mm x 5 mm 的基础模型中，并使用干冰/乙醇浴进行快速冷冻。
    8. 用实验室湿巾擦干块，用纸巾包裹，并在 -80 °C 冰箱中放置过夜。第二天，使用低温恒温器将 5 μm 切片切到显微镜载玻片上。将载玻片储存在 -80 °C。
  2. 类器官的免疫荧光染色
    1. 从 -80 °C 冰箱中处理载玻片，并使用标准方案进行 IF 染色。
    2. 将盖玻片套在载玻片上并在室温下干燥，避光至少 2 小时或过夜，然后再成像。
    3. 使用共聚焦显微镜的 25 倍物镜对载玻片进行成像。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在中/后肠诱导阶段成功生成球体表明模式化成功。在浮动球体和单层上对 CDX2 进行 IF 染色，以确认图案化正确。尽管最终内胚层 （DE） 阶段的染色可以表明 DE 诱导的有效性，但如果没有有效的 DE 诱导，就不可能生成球状体。为了测试 DE 诱导的效率，对 FOXA2 和 SOX17 进行 IF 染色和/或 RT-qPCR。

在模式化阶段之后，HOX 因子的表达是模式化成功的最佳指标。HOX 因子主要在肠道和结肠间充质中表达 8,9。因此，HOX 因子表达将反映间充质的模式化。前 HOX 因子 HOXD3 的 mRNA 表达在 NOGGIN 处理的 HIO 中应最高，在上皮生长因子 （EGF） 处理的 HIO 中较低，在 BMP 处理的 HCO 中最低。相反，HOXA13 和 HOXD13 mRNA 在 HIO 中应较低，在 HCO 中应较高（图 4...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSC 分化为 HIO 和 HCO 是一个复杂的过程，需要对每个步骤进行质量控制。在开始分化为 DE 之前，起始 hPSC 需要具有最小的分化。优化用于 DE 分化的 hPSC 的密度对于实验步骤的成功至关重要。为确保 DE 分化的质量，请对 FOXA2 和 SOX17 执行 IF 以确定 DE 分化的效率。DE 分化应导致超过 80% 的处理细胞对 FOXA2 和 SOX17 染色呈阳性。一旦确定了最佳密度，就可以将相同的密度用于多个实验，并取得类似的成功。成功区分 DE 后，中/后肠诱导应该是高效的。在 ECM 中铺板后，用 BMP2 对中/后肠球体进行图案化会降低球体形成类器官的效率 （~15%）。因此，与 HIO 相比，每个 ECM 气泡用于 HCO 生成的球体数量增加 2 至 3 倍。

DE 分化的最佳密度因细胞系而异。然而，一些细胞系很难单独使用激活素 A 分化为 DE。如果多次实验失败，则向第 1 天的激活素 A 培养基中加入 5-15 ng/mL 的 BMP4。BMP4 的添加已被证明可以通过抑制...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有需要披露的利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Múnera 实验室由 NIH/NCI 5U54CA210962-02 南卡罗来纳州癌症差异研究中心 （SC CADRE）、NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE 在消化和肝病中资助，以及 NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC 消化疾病研究核心中心。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1% 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液不适用不适用不适用
15 mL 康宁管隼21008-918不适用
30% 蔗糖不适用不适用PBS 制作。
5% 普通驴精华液杰克逊免疫研究实验室017-000-121不适用
50 mL 康宁管隼21008-951不适用
AccutaseThermo ScientificA1110501细胞脱离溶液;将 5 mL Accutase 等分到 10 mL 管中，共 20 管，并储存在 -20 度;C 长达 6 个月。放置在 4 >使用前C过夜。
激活素A细胞引导系统GFH6-100x10将冻干粉末复溶为100&微量;含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌PBS中的g / mL。等分试样 38 µL 激活素 A 放入预冷微量离心管中并储存在 -80 度;C（管子自收到之日起 12 个月后过期）。
激活素第 1 天培养基 （RPMI 1640）康宁MT10041CV使用非必需氨基酸（NEAA，康宁11140050）并储存在 4 &°C。基本第 1 天培养基：500 mL RPMI 1640 和 500 mL NEAA。制备激活素第 1 天培养基时，加入 13 mL 碱性第 1 天培养基，13 & 微量;l 激活素 A （100 µg/mL），和 2 & 微量;BMP4 的 l （100 µ克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
激活素第 2 天培养基（RPMI 1640,0.2% FBS 体积/体积）Hyclone （海克隆）SH30070.03吨使用非必需氨基酸（康宁11140050）并储存在 4 °C。第 2 天基本培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 1 mL 0.2% 血清。制备激活素第 2 天培养基时，加入 12.5 mL 碱性第 2 天培养基和 12.5 &激活素 A 的 L （100 &克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
激活素第 3 天培养基（RPMI 1640,2% FBS 体积/体积）Hyclone （海克隆）SH30070.03吨使用非必需氨基酸（康宁11140050）并储存在 4 °C。第 3 天基本培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 10 mL 2% 血清。制备激活素第 3 天培养基时，加入 12.5 mL 碱性第 3 天和 12.5 &激活素 A 的 L （100 &克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
Alexa Fluor 488 驴防山羊Thermo ScientificA110551：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 488 驴防兔Thermo ScientificA212061：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 546 驴防鼠Thermo ScientificA100361：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 647 驴防鼠Thermo ScientificA315711：500 稀释（二抗）
底座模具渔夫22-363-552不适用
基础性肠道培养基（高级 DMEM）吉布科12491015 制备碱性肠道培养基时，加入500mL DMEM，500mL N2（Gibco 17-502-048），500mL B27（Gibco），500mL L-谷氨酰胺，得到2 mM L-谷氨酰胺（康宁A2916801），5 mL 100 U/mL青霉素-链霉素（Gibco 15-140-122）和7.5 mL 1 M HEPES 可获得 15 mM HEPES。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
Biorad CFX96 触摸式实时荧光定量 PCR 检测系统比奥拉德不适用可以使用其他qRT-PCR系统。
细胞回收解决方案康宁354253ECM 降解解决方案
CHIR99021复原细胞4000410通过在10mM下加入2.15mL DMSO来复溶。准备 50 µL 等分试样并储存在 -20 °C 将粉末储存在 4 &g 度;C、避光。
CTRL HIO 图案化介质不适用不适用碱性肠道培养基和 100 ng/mL EGF。
DAPI的西格玛-奥尔德里奇D95421：100 稀释（二抗）
DE单层不适用不适用单层是在前面的步骤中生成的（第 4.4 节）。
分散酶吉布科17105041将冻干粉末重悬于高级DMEM（Gibco MT15090CV）中至1mg / mL终浓度。使用 Millipore 过滤器灭菌管通过真空过滤溶液进行灭菌。制作 10 mL 等分试样 （1 mg/mL） 并储存在 -20 &g 度;C 长达 6 个月。放置在 4 >使用前C过夜。
EGF的Thermo Scientific236-EG-01M制备 100 ng/mL EGF 时，重构 500 &无菌 PBS 中的 g/mL。接下来，将 2 mL 无菌 PBS 添加到 1 mg EGF 中，制成 500 &g/mL EGF 溶液。等分试样 100 µ20 管中的 L EGF。
Fisherbrand 6 厘米培养皿，带透明盖渔夫FB0875713A不适用
Fisherbrand 细胞提升器渔夫08-100-240不适用
Fisherbrand B 级透明玻璃螺纹小瓶，带瓶盖渔夫03-338B不适用
Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液器渔夫13-678-2D0不适用
Fluoromount G 载玻片封片介质大众100241-874不适用
Gibco 高级 DMEM吉布科12-491-023不适用
山羊抗E-钙粘蛋白R&D 系统AF648型1：400 稀释度（一抗）
山羊抗SOX17R&D 系统AF19241：500 稀释度（一抗）
HCOs图案化培养基不适用不适用碱性肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL BMP2。制备BMP2时，向BMP2小瓶（100µ等分试样 25 & 微量;4 管中的 L BMP4 溶液。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
血细胞计数器西格玛-奥尔德里奇Z359629不适用
人类多能干细胞 （hPSC）多能干细胞设施不适用将细胞接种在基质胶包被的 24 孔板 （Thermo Scientific 73520-906） 中。
冰冷的 4% 多聚甲醛溶液 （PFA）不适用不适用不适用
冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS）不适用不适用pH 值必须为 7.4。
ImmEdge 疏水阻隔笔载体实验室101098-065不适用
诱导多能干细胞 （iPSC）多能干细胞设施（辛辛那提儿童医院医疗中心）不适用可以使用其他hESC或iPSC系，但需要针对每个细胞系优化方案。
徕卡切片机不适用不适用不适用
LSM 880共聚焦显微镜
基质胶基底膜基质康宁354234不适用
基质素 hESC 合格基质康宁354277准备 4 x 基质胶等分试样，其体积足以为 4 x 6 孔培养皿制作足够的稀释基质胶。
中后肠诱导培养基（RPMI 1640）康宁MT10041CV非必需氨基酸（康宁 11140050），2% FBS 体积/体积（Hyclone SH30070.03T），3 和微量;M CHIR99021 和 500 ng/mL FGF4。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
中后肠球体不适用不适用不适用
MilliporeSigma Steriflip 无菌一次性真空过滤机组毫孔西格玛SCGP00525不适用
小鼠抗CDX2生物基因MU392-UC型1：300 稀释（一抗）
小鼠抗FOXA2阿布诺瓦/诺瓦斯H00003170-M011：500 稀释
mTeSR1完全生长培养基干细胞技术85870将 100 mL mTeSR 补充剂 （85870） 加入一个 400 mL mTeSR 培养基 （85870） 中，并等分放入 50 mL 试管中，同时避免污染。储存在 4°C 直到使用。
Murray's Clear 解决方案（也称为 BABB）默里的不适用1：2苯甲酸苄酯和苯甲醇。
NOG HIO 图案培养基不适用不适用碱性肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL NOGGIN（分配 25 &250 & 微量中的 NOGGIN 克;l 含0.1%BSA的无菌PBS）。
核旋RNA宝740955.25可以使用其他RNA分离试剂盒。
Nunclon delta 表面组织培养皿 24 孔 （Nunc）Thermo Scientific73521-004不适用
Nunclon delta 表面组织培养皿 24 孔，涂有基质胶Thermo Scientific73521-004不适用
Nunclon delta 表面组织培养皿 6 孔 （Nunc）Thermo Scientific73520-906不适用
Nunclon delta表面组织培养皿6孔包被 矩阵。Thermo Scientific73520-906不适用
HIO、CTRL HIO 和 HCO 的生长培养基不适用不适用碱性肠道培养基和 100 ng/mL EGF（终浓度）
磷酸盐缓冲盐水，0.5% Triton X （PBS-T）不适用不适用不适用
引综合 DNA 技术公司 （IDT）不适用引物列在方案的表2中。
兔抗CDX2细胞品牌EPR22764Y1：100 稀释度（一抗）
兔抗SATB2细胞品牌第281话1：100 稀释度（一抗）
重组人 BMP-4 蛋白R&D 系统314-BP-010型将冻干粉末复溶为100&微量;g/mL 在含有 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的无菌 4 mM HCl 中。将 4.17 mL HCl 溶液加入 45.83 mL 分子水中，总计 50 mL 1 M HCl。然后加200µL 1 M HCl 至 49.8 mL 分子级水，总计 50 mL 4 mM HCl。接下来，将 0.05 g BSA 添加到 50 mL 的 4 mM HCl 中并过滤以使其无菌。将无菌的 4 mM HCl 0.1% BSA 等分到 33 微量离心管中，总计并储存在 -20 °C。加入 100 &μ;l 无菌 4 mM HCl 0.1% BSA 到 BMP4 小瓶中（10 & micro;g） 制备100&微量的BMP4溶液;克/毫升。
重组人 FGF-4 蛋白R&D 系统235-F4-01米在 100 和微量下复构;含有0.1%牛血清白蛋白的无菌PBS中的g / mL。在 50 mL PBS 中加入 0.05 g BSA 以制得 0.1% BSA。过滤器 0.22 & 微;M BSA 对 BSA 进行灭菌。将 10 mL 0.1% BSA 等分于 5 个试管中。在10mL无菌0.1%BSA中加入1mg FGF-4。等分试样 250 µ将L放入预冷的40微量离心管中，并储存在-80°C。
ROCK抑制剂Y-27632托克里斯1254最终浓度为 10 mM （10 mmol/L）。以 10 mM 重悬于 DMSO 中并过滤灭菌。向每个小瓶中加入 3 mL 无菌 PBS。Aliqout 100 & 微型;L ROCK抑制剂装在30管中，并储存在-20°C。
SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒Thermo Scientific11-754-250不适用
SuperFrost Plus 显微镜载玻片
Tissue Tek OCT 化合物大众25608-930不适用

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles