人多能干细胞来源的肠道和结肠类器官的生成、维持和表征

Summary

这里描述了生成、维持和表征人类多能干细胞衍生的小肠和结肠类器官的详细方法。这些方法旨在提高可重复性、扩大可扩展性并减少类器官铺板和传代所需的工作时间。

Abstract

肠道区域规范描述了一个过程，通过该过程，独特的形态和功能被赋予发育中的胃肠道 （GI） 的确定区域。肠道中的区域规范由多种发育途径驱动，包括骨形态发生蛋白 （BMP） 途径。基于正常的区域规范，开发了一种从人多能干细胞 （hPSC） 生成人结肠类器官 （HCO） 的方法，其中包括人胚胎干细胞 （hES） 和诱导多能干细胞 （iPSC）。BMP 信号传导的 3 天诱导将中/后肠管培养物充分模式化为特殊的富含 AT 的序列结合蛋白 2 （SATB2） 表达的 HCO，其中包含人结肠中存在的所有主要上皮细胞类型以及共同发育的间充质细胞。在这个关键模式期间省略 BMP（或添加 BMP 抑制剂 NOGGIN）导致人肠道类器官 （HIO） 的形成。HIO 和 HCOs 在形态和分子上分别类似于人类发育中的小肠和结肠。尽管 HIO 和 HCO 可用于研究人类肠道发育，但 HIO 和 HCO 的生成具有挑战性。本文介绍了生成、维护和表征 HIO 和 HCO 的方法。此外，还提供了协议中的关键步骤和故障排除建议。

Introduction

由于对人类胎儿组织的使用受到限制，研究人类结肠发育很困难。动物模型具有不可估量的价值，历史上曾用于小鼠的遗传方法以研究肠道发育。然而，小鼠和人类肠道发育之间的差异限制了小鼠作为模型系统的适用性。例如，虽然小鼠的小肠和结肠中的隐窝形成发生在出生后，但人类出生时就有完全形成的隐窝¹。此外，人类小肠和结肠包含小鼠中没有的细胞类型，包括小肠中表达胃动素 （MLN） 的肠内分泌细胞² 和结肠中表达粘蛋白 5B （MUC5B） 的杯状细胞 ^3,4。因此，拥有一个能够准确模拟定义结肠发育早期阶段的动态分子事件的细胞培养系统非常重要。因此，指导 hPSCs 产生具有结肠特征的细胞为研究人类结肠发育提供了一个强大的模型。

已经开发了方案，以促进 hPSC 可重现⁵、同步和高效地形成肠样⁶ 和结肠样类器官⁷ 。这些方案使用模拟胎儿肠道和结肠发育的逐步分化程序（图 1）。首先，通过用 Activin ....

Protocol

1. 人类肠道和结肠类器官的产生

1. 制备 ECM 涂层板
   1. 将 50 mL 冷 DMEM 培养基加入 50 mL 锥形管中。
   2. 从 -80 °C 冰箱中取出 4x hESC 合格的 ECM 等分试样（参见 材料表），并在冰上解冻。
      注：请参阅产品的分析证书，以确定制备 4x 储备液所需的 ESC 合格 ECM 的体积。
   3. 如果符合 hESC 要求的 ECM 未完全解冻，请从 50 mL 锥形管中取出 750 μL DMEM，并与 ECM 混合。
   4. 将符合 DMEM/hESC 要求的 ECM 混合物转移到含 DMEM 的 50 mL 锥形管中并充分混合。每孔添加 0.5 mL 到 4 x 24 孔细胞培养板中。
   5. 摇动板，将 ECM 均匀地分布在整个孔中，以确保覆盖整个表面。使用封口膜，密封 ECM 涂层板，并在室温下在生物安全柜中放置至少 1 小时。将 ECM 包被的板在 4 °C 下储存长达 2 周或直到需要为止。
2. hPSCs 单细胞铺板
   1. 将 ECM 涂层的 24 孔板放入生物安全柜中 30 分钟，使其达到室温。
   2. 将mTeSR1完全培养基、细胞分离溶液和高级DMEM置于37°C水浴中，让它们预热30分钟。
   ....

Results

在中/后肠诱导阶段成功生成球体表明模式化成功。在浮动球体和单层上对 CDX2 进行 IF 染色，以确认图案化正确。尽管最终内胚层 （DE） 阶段的染色可以表明 DE 诱导的有效性，但如果没有有效的 DE 诱导，就不可能生成球状体。为了测试 DE 诱导的效率，对 FOXA2 和 SOX17 进行 IF 染色和/或 RT-qPCR。

在模式化阶段之后，HOX 因子的表达是模式化成功的最佳指标。HOX 因子主要在肠道和结肠间充质中表达 ^8,9。因此，HOX 因子表达将反映间充质的模式化。前 HOX 因子 HOXD3 的 mRNA 表达在 NOGGIN 处理的 HIO 中应最高，在上皮生长因子 （EGF） 处理的 HIO 中较低，在 BMP 处理的 HCO 中最低。相反，HOXA13 和 HOXD13 mRNA 在 HIO 中应较低，在 HCO 中应较高（图 4.......

Discussion

hPSC 分化为 HIO 和 HCO 是一个复杂的过程，需要对每个步骤进行质量控制。在开始分化为 DE 之前，起始 hPSC 需要具有最小的分化。优化用于 DE 分化的 hPSC 的密度对于实验步骤的成功至关重要。为确保 DE 分化的质量，请对 FOXA2 和 SOX17 执行 IF 以确定 DE 分化的效率。DE 分化应导致超过 80% 的处理细胞对 FOXA2 和 SOX17 染色呈阳性。一旦确定了最佳密度，就可以将相同的密度用于多个实验，并取得类似的成功。成功区分 DE 后，中/后肠诱导应该是高效的。在 ECM 中铺板后，用 BMP2 对中/后肠球体进行图案化会降低球体形成类器官的效率 （~15%）。因此，与 HIO 相比，每个 ECM 气泡用于 HCO 生成的球体数量增加 2 至 3 倍。

DE 分化的最佳密度因细胞系而异。然而，一些细胞系很难单独使用激活素 A 分化为 DE。如果多次实验失败，则向第 1 天的激活素 A 培养基中加入 5-15 ng/mL 的 BMP4。BMP4 的添加已被证明可以通过抑制.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% 牛血清白蛋白 （BSA） 溶液	不适用	不适用	不适用
15 mL 康宁管	隼	21008-918	不适用
30% 蔗糖	不适用	不适用	PBS 制作。
5% 普通驴精华液	杰克逊免疫研究实验室	017-000-121	不适用
50 mL 康宁管	隼	21008-951	不适用
Accutase	Thermo Scientific	A1110501	细胞脱离溶液;将 5 mL Accutase 等分到 10 mL 管中，共 20 管，并储存在 -20 度;C 长达 6 个月。放置在 4 >使用前C过夜。
激活素A	细胞引导系统	GFH6-100x10	将冻干粉末复溶为100&微量;含有0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无菌PBS中的g / mL。等分试样 38 µL 激活素 A 放入预冷微量离心管中并储存在 -80 度;C（管子自收到之日起 12 个月后过期）。
激活素第 1 天培养基 （RPMI 1640）	康宁	MT10041CV	使用非必需氨基酸（NEAA，康宁11140050）并储存在 4 &°C。基本第 1 天培养基：500 mL RPMI 1640 和 500 mL NEAA。制备激活素第 1 天培养基时，加入 13 mL 碱性第 1 天培养基，13 & 微量;l 激活素 A （100 µg/mL），和 2 & 微量;BMP4 的 l （100 µ克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
激活素第 2 天培养基（RPMI 1640,0.2% FBS 体积/体积）	Hyclone （海克隆）	SH30070.03吨	使用非必需氨基酸（康宁11140050）并储存在 4 °C。第 2 天基本培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 1 mL 0.2% 血清。制备激活素第 2 天培养基时，加入 12.5 mL 碱性第 2 天培养基和 12.5 &激活素 A 的 L （100 &克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
激活素第 3 天培养基（RPMI 1640,2% FBS 体积/体积）	Hyclone （海克隆）	SH30070.03吨	使用非必需氨基酸（康宁11140050）并储存在 4 °C。第 3 天基本培养基：500 mL RPMI 1640、500 mL NEAA 和 10 mL 2% 血清。制备激活素第 3 天培养基时，加入 12.5 mL 碱性第 3 天和 12.5 &激活素 A 的 L （100 &克/毫升）。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
Alexa Fluor 488 驴防山羊	Thermo Scientific	A11055	1：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 488 驴防兔	Thermo Scientific	A21206	1：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 546 驴防鼠	Thermo Scientific	A10036	1：500 稀释（二抗）
Alexa Fluor 647 驴防鼠	Thermo Scientific	A31571	1：500 稀释（二抗）
底座模具	渔夫	22-363-552	不适用
基础性肠道培养基（高级 DMEM）	吉布科	12491015	制备碱性肠道培养基时，加入500mL DMEM，500mL N2（Gibco 17-502-048），500mL B27（Gibco），500mL L-谷氨酰胺，得到2 mM L-谷氨酰胺（康宁A2916801），5 mL 100 U/mL青霉素-链霉素（Gibco 15-140-122）和7.5 mL 1 M HEPES 可获得 15 mM HEPES。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
Biorad CFX96 触摸式实时荧光定量 PCR 检测系统	比奥拉德	不适用	可以使用其他qRT-PCR系统。
细胞回收解决方案	康宁	354253	ECM 降解解决方案
CHIR99021	复原细胞	4000410	通过在10mM下加入2.15mL DMSO来复溶。准备 50 µL 等分试样并储存在 -20 °C 将粉末储存在 4 &g 度;C、避光。
CTRL HIO 图案化介质	不适用	不适用	碱性肠道培养基和 100 ng/mL EGF。
DAPI的	西格玛-奥尔德里奇	D9542	1：100 稀释（二抗）
DE单层	不适用	不适用	单层是在前面的步骤中生成的（第 4.4 节）。
分散酶	吉布科	17105041	将冻干粉末重悬于高级DMEM（Gibco MT15090CV）中至1mg / mL终浓度。使用 Millipore 过滤器灭菌管通过真空过滤溶液进行灭菌。制作 10 mL 等分试样 （1 mg/mL） 并储存在 -20 &g 度;C 长达 6 个月。放置在 4 >使用前C过夜。
EGF的	Thermo Scientific	236-EG-01M	制备 100 ng/mL EGF 时，重构 500 &无菌 PBS 中的 g/mL。接下来，将 2 mL 无菌 PBS 添加到 1 mg EGF 中，制成 500 &g/mL EGF 溶液。等分试样 100 µ20 管中的 L EGF。
Fisherbrand 6 厘米培养皿，带透明盖	渔夫	FB0875713A	不适用
Fisherbrand 细胞提升器	渔夫	08-100-240	不适用
Fisherbrand B 级透明玻璃螺纹小瓶，带瓶盖	渔夫	03-338B	不适用
Fisherbrand 一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液器	渔夫	13-678-2D0	不适用
Fluoromount G 载玻片封片介质	大众	100241-874	不适用
Gibco 高级 DMEM	吉布科	12-491-023	不适用
山羊抗E-钙粘蛋白	R&D 系统	AF648型	1：400 稀释度（一抗）
山羊抗SOX17	R&D 系统	AF1924	1：500 稀释度（一抗）
HCOs图案化培养基	不适用	不适用	碱性肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL BMP2。制备BMP2时，向BMP2小瓶（100µ等分试样 25 & 微量;4 管中的 L BMP4 溶液。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
血细胞计数器	西格玛-奥尔德里奇	Z359629	不适用
人类多能干细胞 （hPSC）	多能干细胞设施	不适用	将细胞接种在基质胶包被的 24 孔板 （Thermo Scientific 73520-906） 中。
冰冷的 4% 多聚甲醛溶液 （PFA）	不适用	不适用	不适用
冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	不适用	不适用	pH 值必须为 7.4。
ImmEdge 疏水阻隔笔	载体实验室	101098-065	不适用
诱导多能干细胞 （iPSC）	多能干细胞设施（辛辛那提儿童医院医疗中心）	不适用	可以使用其他hESC或iPSC系，但需要针对每个细胞系优化方案。
徕卡切片机	不适用	不适用	不适用
LSM 880			共聚焦显微镜
基质胶基底膜基质	康宁	354234	不适用
基质素 hESC 合格基质	康宁	354277	准备 4 x 基质胶等分试样，其体积足以为 4 x 6 孔培养皿制作足够的稀释基质胶。
中后肠诱导培养基（RPMI 1640）	康宁	MT10041CV	非必需氨基酸（康宁 11140050），2% FBS 体积/体积（Hyclone SH30070.03T），3 和微量;M CHIR99021 和 500 ng/mL FGF4。基础培养基可稳定长达 3 周，但应在添加生长因子后立即使用。
中后肠球体	不适用	不适用	不适用
MilliporeSigma Steriflip 无菌一次性真空过滤机组	毫孔西格玛	SCGP00525	不适用
小鼠抗CDX2	生物基因	MU392-UC型	1：300 稀释（一抗）
小鼠抗FOXA2	阿布诺瓦/诺瓦斯	H00003170-M01	1：500 稀释
mTeSR1完全生长培养基	干细胞技术	85870	将 100 mL mTeSR 补充剂 （85870） 加入一个 400 mL mTeSR 培养基 （85870） 中，并等分放入 50 mL 试管中，同时避免污染。储存在 4°C 直到使用。
Murray's Clear 解决方案（也称为 BABB）	默里的	不适用	1：2苯甲酸苄酯和苯甲醇。
NOG HIO 图案培养基	不适用	不适用	碱性肠道培养基，100 ng/mL EGF 和 100 ng/mL NOGGIN（分配 25 &250 & 微量中的 NOGGIN 克;l 含0.1%BSA的无菌PBS）。
核旋RNA	宝	740955.25	可以使用其他RNA分离试剂盒。
Nunclon delta 表面组织培养皿 24 孔 （Nunc）	Thermo Scientific	73521-004	不适用
Nunclon delta 表面组织培养皿 24 孔，涂有基质胶	Thermo Scientific	73521-004	不适用
Nunclon delta 表面组织培养皿 6 孔 （Nunc）	Thermo Scientific	73520-906	不适用
Nunclon delta表面组织培养皿6孔包被 矩阵。	Thermo Scientific	73520-906	不适用
HIO、CTRL HIO 和 HCO 的生长培养基	不适用	不适用	碱性肠道培养基和 100 ng/mL EGF（终浓度）
磷酸盐缓冲盐水，0.5% Triton X （PBS-T）	不适用	不适用	不适用
引	综合 DNA 技术公司 （IDT）	不适用	引物列在方案的表2中。
兔抗CDX2	细胞品牌	EPR22764Y	1：100 稀释度（一抗）
兔抗SATB2	细胞品牌	第281话	1：100 稀释度（一抗）
重组人 BMP-4 蛋白	R&D 系统	314-BP-010型	将冻干粉末复溶为100&微量;g/mL 在含有 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 的无菌 4 mM HCl 中。将 4.17 mL HCl 溶液加入 45.83 mL 分子水中，总计 50 mL 1 M HCl。然后加200µL 1 M HCl 至 49.8 mL 分子级水，总计 50 mL 4 mM HCl。接下来，将 0.05 g BSA 添加到 50 mL 的 4 mM HCl 中并过滤以使其无菌。将无菌的 4 mM HCl 0.1% BSA 等分到 33 微量离心管中，总计并储存在 -20 °C。加入 100 &μ;l 无菌 4 mM HCl 0.1% BSA 到 BMP4 小瓶中（10 & micro;g） 制备100&微量的BMP4溶液;克/毫升。
重组人 FGF-4 蛋白	R&D 系统	235-F4-01米	在 100 和微量下复构;含有0.1%牛血清白蛋白的无菌PBS中的g / mL。在 50 mL PBS 中加入 0.05 g BSA 以制得 0.1% BSA。过滤器 0.22 & 微;M BSA 对 BSA 进行灭菌。将 10 mL 0.1% BSA 等分于 5 个试管中。在10mL无菌0.1%BSA中加入1mg FGF-4。等分试样 250 µ将L放入预冷的40微量离心管中，并储存在-80°C。
ROCK抑制剂Y-27632	托克里斯	1254	最终浓度为 10 mM （10 mmol/L）。以 10 mM 重悬于 DMSO 中并过滤灭菌。向每个小瓶中加入 3 mL 无菌 PBS。Aliqout 100 & 微型;L ROCK抑制剂装在30管中，并储存在-20°C。
SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒	Thermo Scientific	11-754-250	不适用
SuperFrost Plus 显微镜载玻片
Tissue Tek OCT 化合物	大众	25608-930	不适用