活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录

Summary

在这里，我们描述了从幼虫4 C. elegans 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的详细方案。

Abstract

秀丽隐杆线虫 自1963年推出以来，一直是生物学研究的重要模型系统。然而， 秀丽隐杆线虫 尚未充分利用其核提取物（如 体外 转录和DNA复制）进行生物反应的生化研究。在生化研究中使用 秀丽隐杆线虫 的一个重大障碍是破坏线虫厚厚的外角质层，而不会牺牲核提取物的活性。虽然有几种方法用于破坏角质层，例如Dounce均质化或超声处理，但它们通常会导致蛋白质不稳定。没有建立从幼虫或成年 秀丽隐杆线虫 中分离活性核蛋白用于 体外 反应的方案。在这里，该协议详细描述了使用Balch均质机对幼虫4 C.秀丽隐杆线虫的 均质化。Balch均质机使用压力缓慢地迫使动物通过狭窄的间隙，在此过程中破坏角质层。Balch 均质机的统一设计和精密加工允许在实验之间对动物进行一致的研磨。分馏从Balch均质机获得的匀浆产生功能活性核提取物，可用于 体外 方法测定 秀丽隐杆线虫的转录活性。

Introduction

小型，自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种简单而强大的模式生物，用于解决广泛的生物学问题。自1963年引入以来，线虫对于回答神经生物学，新陈代谢，衰老，发育，免疫和遗传学方面的问题非常宝贵¹。该动物的许多特征使其成为理想的模式生物，包括较短的生成时间，RNA干扰的有效性，透明的身体以及其细胞谱系和神经系统的完整图谱。

虽然线虫对科学的贡献是巨大的，但它们在阐明真核转录系统方面没有得到充分利用，我们对这些机制的大部分理解来自使用酵母，果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物^的研究2。阻止研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质层、糖蛋白和脂质组成，使秀丽隐杆线虫从幼虫期到成年期都耐通过化学或机械力提取蛋白质³。使用秀丽隐杆线虫核提取物的体外转录系统曾经开发出来，但由于系统范围有限，未被广泛采用，使用Dounce均质机制备提取物可能导致蛋白质不稳定^4，5。

与先前利用Dounce均质机破坏 秀丽隐杆线虫 的核提取物分离协议不同，该协议使....

Protocol

1. 媒体准备

1. 按照制造商的说明准备无菌溶菌汤（LB）琼脂平板和液体培养基。
2. 条纹 大肠杆菌 （大肠杆菌）菌株OP50在LB琼脂平板上。将细菌条纹在37°C下孵育过夜。
3. 孵育后将 大肠杆菌 OP50条纹板储存在4°C。如果用parafilm包裹， 大肠杆菌 OP50板可以在4°C下安全储存2周，以防止水分流失。
4. 使用 表1中的配方准备2L线虫生长培养基（NGM）。
   注:制霉菌素是可选的。制霉菌素有助于防止霉菌和其他真菌污染物在NGM板上生长。当取下盖子进行浇注和播种 大肠杆菌 OP50时，直径为150毫米的大板具有更高的捕获真菌孢子的机会。制霉菌素可以以10，000单位/mL的价格从供应商处购买预混合在无菌溶液中，也可以作为无菌粉末购买并与无菌水混合。制霉菌素不能被高压灭菌，也不能被有效地过滤灭菌。在实验室中混合制霉菌素溶液时，注意无菌技术至关重要。高压灭菌器1M _CaCl2，1M _KPO4 pH 6.0和1 M _MgSO4 在121°C下15分钟。过滤溶解在95%乙醇中后，通过0.22μm过滤器对胆固醇进行灭菌。
5. 将试剂加入培养基后，将NGM倒入40个150mm培养皿中。每个 150 mm 培养皿需要 50 mL 才能灌装。让NGM板在室....

Results

按照概述的步骤应产生功能性核提取物 （图1），研磨或洗涤步骤的偏差可能导致活性差或产量低。如果获得功能性 秀丽隐杆线虫 核提取物，当添加到前面描述的 体外测定中 时，它将转录DNA模板上CMV启动子下游的区域。所得RNA转录本可以使用常规方法从核蛋白和DNA模板中纯化。如果没有模板DNA，逆转录和随后的PCR产物只能是核提取物转录的RNA的结果。PCR产物可以在琼脂糖凝胶上可视化，DNA条带的强度可以指示核蛋白和RNA分离的质量。弱能带强度可能是由于加热或缓冲液制备不良而使核提取物失活引起的。过强的条带强度可能是由于RNA纯化不良或DNA酶消化不当而导致的DNA污染的结果。一致且成功的核分离将产生相似强度的条带，转录和PCR阴性对照均不应具有可见的PCR产物（图2）。

Discussion

秀丽隐杆线虫 是一种研究真核转录系统的有吸引力的模式生物，因为它的维护成本低，易于遗传操作。这里描述了从L4 C. elegans 中一致分离功能活性核提取物的方案。虽然该协议侧重于可视化转录活性，但转录后产生的cDNA可以使用RT-qPCR进行定量，以获得更精确的转录活性测量⁸。这种从 秀丽隐杆线虫 中分离核蛋白的方法可以帮助扩大真核转录机制的研究。由于 秀丽隐杆线虫 不是培养皿或酵母菌落中的细胞培养物，而是一种自由漫游的动物，因此分离和研究其核提取物可以更清楚地了解转录机制如何随时间或各种环境而变化。这使得研究人员能够利用 秀丽隐杆线虫的 低成本和弹性。 秀丽隐杆线虫 与其他模式生物或细胞培养物不同，当细菌或酵母污染出现时，秀丽隐杆线虫会更加宽容。秀 丽隐杆线虫 的种群可以使用既定的协议轻松清除污染，在污染发生时节省时间和精力⁹。总体而言，与从供应商处购买核提取物或处理不太宽容的模式生物相比，使用秀 丽隐杆.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
耗材和试剂
0.2 mL 8 联管 &平条盖，透明	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL 独立 PCR 管	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL 无菌微管	Genesee Scientific	24-282S
100% 绝对分子级乙醇	Fisher Scientific	BP2818
100% 乙醇，Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL 血清移液管	VWR international	89130-898
150 mm 培养皿	Tritech Research	T3325
15 mL 锥形离心管	Genesee Scientific	28-103
20 mL 塑料注射器	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject 注射器	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL 真空过滤杯 0.22 µm PES、Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL 锥形离心管	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL 血清移液管	VWR international	89130-902
5 mL 血清移液管	VWR international	89130-896
琼脂，Criterion	VWR International	C7432
琼脂糖	Denville Scientific	CA3510-6
防酒精标志	VWR International	52877-310
Bacto 蛋白胨	VWR International	90000-264
秀丽隐杆线虫	CGC	N2
二氯化钙	Millipore Sigma	C4901
胆固醇	Millipore Sigma	C8667
对照 DNA 寺庙克隆引物，正向 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3'
对照 DNA 寺庙克隆引物，正向 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3'
去离子水
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA 凝胶染料，SYBR 安全	Invitrogen	S33102
DNA 分子量标准混合物，O'基因标尺	Fisher Scientific	SM1173
DNA 上样染料，6x TriTrack	Fisher Scientific
DNase，Baseline-ZERO	Lucigen
干冰
大肠杆菌 OP50 菌株	CGC	OP50
冰醋酸	Fisher Scientific	A38
甘油	Millipore Sigma	G6279
HeLa 核提取物体外转录系统，HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes 溶液，1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
盐酸 37%	Millipore Sigma	P0662
次氯酸盐漂白	Clorox
LB 肉汤	Millipore Sigma	L3022
二氯化镁	Millipore Sigma	M8266
硫酸镁	Millipore Sigma	M7506
中等重量培养皿	Fisher Scientific	02-202-101
显微镜载玻片，Vista vision	VWR International	16004-368
分子级水，Hypure	Hyclone Laboratories
制霉菌素	Millipore Sigma	N1638
PCR 系统，带预混物 A	Lucigen
氯化钾	Millipore Sigma	P39111
磷酸氢二钾	Millipore Sigma	P3786
磷酸二氢钾	Millipore Sigma	P0662
蛋白酶抑制剂，停止一次性使用混合物 100x	ThermoFisher Scientific	78430
蛋白检测试剂盒，Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
逆转录试剂盒， Sensiscript	Qiagen	205211
RNA 提取试剂盒 RNeasy 微量试剂盒	Qiagen	74004
RNase 抑制剂	Applied Biosystems
氯化钠	VWR International	BDH9286-12KG
氢氧化钠	Millipore Sigma	1-09137
无菌针头过滤器，带 0.2 & 微量;m 聚醚砜膜	VWR international	28145-501
蔗糖	VWR international	200-334-9
转录引物，正向 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3'
转录引物，反向 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3'
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
吐温20	Millipore Sigma	P2287
设备
-20 °C 培养箱	ThermoFisher Scientific
20 °C 培养箱	ThermoFisher Scientific
37 °C 培养箱	Forma Scientific
4 °C 冰箱	ThermoFisher Scientific-80
°C 冰箱	Eppendorf
高压灭菌	Sanyo
Balch 匀浆器， isobiotec 细胞匀浆器	Isobiotec
台式涡旋仪	Fisher Scientific	2215365
离心机， Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
离心机， VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
解剖显微镜、Leica M80	Leica Microsystems
荧光计、Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
凝胶成像系统、iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
凝胶系统	ThermoFisher Scientific
加热块	VWR International	12621-048
微量离心机， Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
移液器 L-1000 XLS+， Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
移液器L-10 XLS+移液器、Rainin		17014388
L-200 XLS+移液器、	Rainin	17014391
热循环仪、Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010