此处，我们介绍一种从4龄幼虫阶段分离活性核提取物的详细方案 秀丽隐杆线虫 并可视化转录活性在其中的活动 体外 系统
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摘要
摘要
秀丽隐杆线虫 自1963年引入以来，一直是生物学研究的重要模式系统。然而 秀丽隐杆线虫 在利用其核提取物进行生物反应的生化研究中尚未得到充分利用，例如 体外 转录和DNA复制。使用该方法的一个重大障碍是 秀丽隐杆线虫 在生化研究中，一个关键挑战是在不损害核提取物活性的前提下破坏线虫厚实的外角质层。尽管已有多种方法用于破坏角质层，例如Dounce匀浆或超声处理，但这些方法常导致蛋白质不稳定。目前尚无从幼虫或成虫中分离具有活性的核蛋白的成熟方案。 秀丽隐杆线虫 用于 体外 反应。在此，本方案详细描述了四龄幼虫的匀浆化过程 秀丽隐杆线虫 使用Balch匀浆器。Balch匀浆器利用压力将动物缓慢挤过狭窄缝隙，从而在此过程中破坏角质层。Balch匀浆器结构均一、加工精密，可在不同实验间实现动物样品均一且可重复的研磨。将Balch匀浆器获得的匀浆液进行分级分离，可得到具有功能活性的核提取物，可用于 体外 检测转录活性的方法 秀丽隐杆线虫.
引言
小型自由生活的线虫Caenorhabditis elegans是一种结构简单但功能强大的模式生物，可用于研究广泛的生物学问题。自1963年引入以来，该线虫在神经生物学、代谢、衰老、发育、免疫和遗传学等领域的问题解答中发挥了不可估量的作用1。这种生物具备多种使其成为理想模式生物的特征，包括较短的世代时间、高效的RNA干扰效应、透明的身体，以及完整的细胞谱系图和神经系统图谱。
尽管线虫对科学的贡献巨大，但其在阐明真核生物转录系统方面的应用仍显不足，目前我们对这些机制的理解主要来自利用酵母、果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物所开展的研究2。阻碍研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质蛋白、糖蛋白和脂质组成，使得从幼虫期到成虫期的C. elegans均能抵抗化学或机械力诱导的蛋白质提取3。曾有研究建立了一种使用C. elegans核提取物的体外转录系统，但由于该系统应用范围有限，且提取过程中使用Dounce匀浆器可能导致蛋白质不稳定，因而未被广泛采用4,5。
与之前使用Dounce匀浆器破碎线虫（C. elegans）来制备核提取物的方案不同，本方案采用Balch匀浆器。Balch匀浆器由两个主要部件组成：一个碳化钨球和一块带有贯穿通道的不锈钢块。将碳化钨球装入Balch匀浆器中，并在两端加盖以密封研磨腔。两个垂直端口可连接注射器，通向研磨腔。当样品通过注射器从一侧推至另一侧经过研磨腔时，注射器产生的压力迫使样品通过碳化钨球与腔壁之间的狭窄缝隙。这种缓慢而持续的压力使样品不断破碎，直至其颗粒大小均匀并能轻松通过该缝隙。通过稳定而温和的压力迫使线虫（C. elegans）通过狭窄缝隙，可使虫体破裂，将其内容物释放到周围的缓冲液中。更换更小尺寸的碳化钨球可进一步缩小缝隙，从而破碎刚释放出的细胞，使细胞核游离进入缓冲液。随后通过多次离心步骤，将细胞核与其他细胞碎片分离，从而获得纯净的核提取物。相比Dounce匀浆器，Balch匀浆器具有多项优势：该系统可处理大量线虫，使单次实验即可获得较大量的活性蛋白；碳化钨球与不锈钢块经过精密加工，可在多个样品间实现一致的研磨效果；厚重的钢块可作为散热片，均匀地将热量从研磨腔导出，防止蛋白变性。
分离后，在将核提取物用于任何生物化学实验之前，必须验证其转录活性。传统上，转录活性通过使用放射性标记的核苷酸来追踪和可视化新合成的RNA进行测定。然而，放射性标记可能带来操作负担，因其在使用和处置过程中需要采取特殊防护措施。6技术进步使得研究人员如今能够采用危害更小或更简便的方法，通过定量实时荧光PCR（qRT-PCR）等技术来检测极微量的RNA。7. 本文所述方案介绍了一种从四龄幼虫（L4）中分离活性核提取物的方法 秀丽隐杆线虫 并可视化转录活性在其中的 体外 系统.
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方案
1. 培养基制备
- 根据制造商说明，制备无菌的溶菌肉汤（LB）琼脂平板和液体培养基。
- 在LB琼脂平板上划线接种大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli） OP50菌株。将细菌划线平板于37 °C培养过夜。
- 培养后将E. coli OP50划线平板保存于4 °C。若用封口膜包裹以防止水分流失，E. coli OP50平板可在4 °C安全保存2周。
- 按照表1中的配方制备2 L线虫生长培养基（NGM）。
注意：制霉菌素为可选成分。制霉菌素有助于防止霉菌及其他真菌污染物在NGM平板上生长。直径较大的150 mm平板在打开皿盖倾注和接种E. coli OP50时，更易沾染真菌孢子。制霉菌素可从供应商处购买预先配制的无菌溶液（10,000单位/mL），也可购买无菌粉末后溶于无菌水中。制霉菌素不能高压灭菌，也无法有效通过滤膜除菌。在实验室中配制制霉菌素溶液时，必须严格注意无菌操作。将1 M CaCl2、1 M KPO4 （pH 6.0）和1 M MgSO4在121 °C下高压灭菌15分钟。胆固醇溶于95%乙醇后，经0.22 µm滤膜过滤除菌。 - 将试剂加入培养基后，将NGM倒入四十个150 mm的培养皿中。每个150 mm培养皿需加入50 mL培养基。让NGM平板在室温下冷却过夜。
- 从之前的划线平板中取E. coli OP50接种至两个含有25 mL无菌LB液体培养基的50 mL锥形管中。将培养液置于37 °C、200 rpm的摇床培养箱中培养24小时。
注意：为保证一致性，应使用同一单菌落接种两个锥形管。若操作困难，可在制备NGM平板的前一天，将单菌落接种至5 mL无菌LB液体培养基（装于50 mL锥形管中），并在37 °C、200 rpm摇床培养箱中培养16小时。新鲜液体培养物可在4 °C保存最多两天。接种时，向两份25 mL液体培养基中各加入25 µL新鲜液体培养物，并在相同条件下培养。 - 用1 mL新鲜的E. coli OP50液体培养物接种新鲜NGM平板，并使用火焰灭菌的涂布棒在平板表面无菌、均匀涂布，形成覆盖大部分平板的大片细菌菌苔，注意避免将细菌涂至平板边缘。让E. coli OP50在室温下生长72–96小时，或直至出现明显致密的菌苔。
注意：接种24小时后，将新接种的NGM平板转移至带盖容器中，以减少水分流失并延长平板使用寿命。
2. 动物准备与漂白同步化
- 转移5只喂养充分的野生型成年 gravid 雌虫 秀丽隐杆线虫 到每个接种了新鲜大肠杆菌的10个NGM平板中 E. coli OP50，共50只动物。
- 让动物产卵，子代在20 °C下培养至发育为怀卵成虫阶段。
- 使用15 mL M9缓冲液（表2收集来自十个维持培养板的新近喂食的野生型饱食成虫 将动物转移至已标记的15 mL锥形管中。
- 以 1,000 x 离心动物样本 g 3分钟，使所有动物沉降至管底。
- 在另一个已标记的15 mL锥形管中，将2 mL次氯酸钠溶液与5 mL 1 N NaOH混合，用于次氯酸钠同步处理。涡旋混匀溶液，确保充分混合。
注意：含次氯酸钠的氢氧化钠溶液需在配制当天使用，以确保有效性。 - 使用10 mL无菌移液管轻轻吸除离心后样品的上清液。尽量彻底去除M9缓冲液，以提高样品破碎效率。
- 向动物沉淀物中加入500 µL漂白剂+NaOH溶液，并启动计时器，计时4分钟。
- 用手或使用摇床，轻轻摇动离心管，彻底分散动物沉淀，使动物在次氯酸钠（bleach）+ 氢氧化钠（NaOH）溶液中自由移动。持续摇动离心管，保持4分钟全程摇动。
注意：所需漂白剂加氢氧化钠溶液的量可能因待同步动物沉淀物的大小而异。请事先使用不同数量的动物以及不同量的漂白剂加氢氧化钠溶液优化该技术。 - 4分钟后，在解剖显微镜下检查破碎效率。确保大多数怀卵成虫已被破碎，并释放出内部物质，包括卵。
- 如果未将动物体解剖打开，可将离心管在最大转速下短暂涡旋振荡，然后再次在显微镜下检查。
注意：尽管卵对漂白剂加氢氧化钠溶液具有抗性，但并非完全不受影响。卵暴露于漂白剂加氢氧化钠溶液的时间不应超过必要时长。在动物裂解步骤中停留过久可能导致子代发育异常。 - 向破碎的动物溶液中加入10 mL M9缓冲液。
- 将卵和残余物在1,000 x g条件下离心 g 3 分钟。
- 用移液器小心吸去上清液，注意不要触碰到管底含有全部卵的新沉淀。
- 加入另外10 mL M9缓冲液，再次以1,000 x g离心3分钟 g.
- 重复步骤 2.13–2.14 两次，以确保残留的次氯酸钠 + 氢氧化钠溶液完全去除。
- 第三次M9缓冲液洗涤后，移除上清液，并加入10 mL S-基础缓冲液（表2).
- 倒置试管，使底部的沉淀物破碎，从而将卵均匀悬浮于缓冲液中。
- 将试管置于摇床上，于20 °C轻轻摇动22小时，使卵孵化并发育至幼虫1期（L1）停滞阶段。
- 22小时后，将含有同步化L1幼虫的离心管在1000 x g下离心3分钟 g.
- 用移液器吸弃上清液，管中保留约1 mL缓冲液。
- 使用微量移液器搅动动物沉淀，使L1期动物在剩余缓冲液中形成均匀的悬浮液。
- 将一滴均匀悬浮的L1幼虫转移至已接种并标记的150 mm NGM平板上 E. coli OP50
- 使用解剖显微镜通过目测计数每滴中L1动物的数量，计算每滴的动物密度。带有完全生长菌苔的大肠杆菌的150 mm NGM平板 E. coli OP50 可支持多达 500 只 L1 期线虫发育至产卵成虫期。
- 将L1动物转移到六块150 mm NGM平板上 E. coli OP50。确保不要过量接种平板。
注意：如果无法确定动物在L1至成年 gravid 期之间是否有充足的食物，应减少每个培养皿中的动物数量，并使用更多的培养皿。 - 让动物在 20 °C 下生长 72 小时，直至其发育至产卵成虫阶段并开始产卵。
- 对已同步且营养充足的野生型成年 gravid 蚊虫进行第二轮漂白同步处理。
- 将同步的L1期动物放置于十块接种有细菌的150 mm NGM平板上 E. coli OP50，每板约1,000个动物。
- 让新同步的L1动物在20 °C下生长48小时，直至发育至L4阶段。
注意：目标是获得约 700 - 800 µL 的 L4 动物沉淀。动物数量过多可能导致使用 Balch 匀浆器时困难，这会增加操作匀浆器时的肌肉负担，并可能因压力升高导致注射器泄漏。
3. 巴尔奇匀浆器的准备
- 按照表3和表4中所述配制低渗缓冲液和高渗缓冲液。
注意：低渗缓冲液和高渗缓冲液可预先配制，并在4 °C下安全保存。 - 用70%乙醇充满Balch匀浆器的研磨室进行清洗，然后用去离子水冲洗研磨室以去除残留的乙醇。
注意：避免使用任何腐蚀性试剂清洗Balch匀浆器。使用乙醇和去离子水充分冲洗即可达到清洁效果。 - 将直径为7.9820 mm（18 µm间隙）的碳化钨球插入研磨室中。
- 用盖帽封闭Balch匀浆器筒体的两端，并使用提供的拇指螺丝固定盖帽。
- 每份样品准备5 mL“完全低渗缓冲液”：加入5 µL 1 M DTT（终浓度：1 mM DTT）和100 µL 100倍蛋白酶抑制剂一次性混合液（终浓度：2倍）。将缓冲液置于冰上保存。
- 每份样品准备5 mL“完全高渗缓冲液”：加入5 µL 1 M DTT（终浓度：1 mM DTT）和100 µL 100倍蛋白酶抑制剂一次性混合液（终浓度：2倍）。将缓冲液置于冰上保存。
注意：完全低渗缓冲液和完全高渗缓冲液应在配制当天使用，不得储存后再次使用。将1 M DTT分装成一次性使用 aliquot，于-20 °C保存。将蛋白酶抑制剂一次性混合液于4 °C保存。 - 用无菌2 mL注射器吸取1 mL“完全低渗缓冲液”，轻轻冲洗Balch匀浆器的研磨室。在研磨室内保留约500 µL的“完全低渗缓冲液”。
- 将冲洗后的匀浆器置于冰上，冷却30分钟。
注意：在研磨动物组织前，匀浆器必须充分冰冻。研磨过程中因摩擦产生热量可能导致核蛋白变性。确保金属匀浆器处于极低温状态，以防止此类情况发生。务必避免周围冰块融化的水进入匀浆器。使用两个无菌注射器堵住匀浆器两端的孔洞，防止意外液体进入研磨室。
4. 动物采集
注意：提供了一份快速参考指南，标注了动物采集、破碎和分级处理的主要步骤（图1）。
- 用 M9 缓冲液收集饲养良好的 L4 期动物至 15 mL 圆锥形离心管中，在 1000 × g 条件下离心 3 分钟。弃去上清液，并持续洗涤动物沉淀，直至上清液澄清。
- 用 3 mL 4 °C 低渗缓冲液洗涤动物，再次在 1000 × g 条件下离心 3 分钟。
注意：在最后一次使用 4 °C 低渗缓冲液洗涤时，动物可能会粘附在管壁上。此现象正常，可能导致在弃去上清液时少量动物损失。 - 弃去低渗缓冲液，并向动物沉淀中加入 1 mL "完全低渗缓冲液"。将动物悬液转移至一支新的 2 mL 无菌注射器中。
注意：使用移液器将动物转移至注射器时，可轻轻吹打无菌的 0.1% Tween20 溶液，以润湿移液器吸头内壁，从而减少动物因粘附吸头壁而造成的损失。
5. 组分分离
- 在冰上，将动物通过装有7.9820 mm钢珠的Balch匀浆器研磨腔，轻轻推入一支新的无菌注射器中。重复将动物通过研磨腔进行30个完整循环。
注意：“完整循环”定义为注射器活塞一次完整的上下运动。
此研磨步骤使用7.9820 mm钢珠（18 µm滚珠轴承）。 - 完成30个循环后，尽可能将动物悬液从Balch匀浆器中取出，并将注射器针头朝下存放于1.7 mL微量离心管中。
- 从研磨腔中取出7.9820 mm钢珠，用去离子水清洗。干燥后将其放回标记好的管中。
- 将7.9880 mm（12 µm间隙）钢珠插入研磨腔，并重新密封匀浆器。
- 再次用1 mL预冷的“完全低渗缓冲液”冲洗研磨腔。
- 将悬液进行25个完整循环的研磨。
- 完成25个循环后，将动物悬液从Balch匀浆器中取出，转移至洁净的1.7 mL微量离心管中，并置于冰上保存。
注意：使用70%乙醇和去离子水拆卸并清洗Balch匀浆器。务必确保将7.9880 mm钢珠放回正确的管中。 - 将悬液在500 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀动物体和碎片。
- 用移液器吸取40 µL上清液至标记为“输入组分”的管中，并置于冰上保存。
注意：所有标签均需使用耐酒精记号笔书写，以防后续字迹模糊。 - 将剩余上清液转移至新的1.7 mL离心管中，注意避免触碰管底的沉淀，随后弃去沉淀。
- 将上清液在4,000 × g、4 °C条件下离心5分钟，沉淀细胞核。
- 小心转移上清液，避免扰动已沉淀的细胞核，将其转移至新的1.7 mL离心管中，并标记为“胞质组分”。
注意：将胞质组分进一步在17,000 × g、4 °C条件下离心30分钟，以去除任何残留的不溶性物质，并将其用作Western blot的阴性对照（特别是针对核蛋白）。 - 用500 µL“完全低渗缓冲液”洗涤细胞核沉淀，将沉淀转移至新的1.7 mL离心管中。将悬浮液在4,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 弃去上清液，在细胞核沉淀中加入500 µL新鲜的“完全低渗缓冲液”，并将悬液转移至新的1.7 mL离心管中。再次在4,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
- 去除上清液，将沉淀溶解于40 µL“完全高渗缓冲液”中。将新的细胞核悬液转移至新的1.7 mL离心管中，标记为“核组分”，并置于冰上保存。
- 使用荧光定量试剂盒测定三个组分的蛋白浓度。
注意：通过该方法获得的核蛋白浓度通常在1–2 µg/µL之间。 - 将核组分按每管含6 µg核蛋白分装至单次使用管中，置于干冰-乙醇浴中速冻，随后于-80 °C保存，以备后续使用。
6. 转录实验
- 打开热块并预热至 30 °C。
- 从 Nulcear Extract in vitro 转录系统中取出以下组分：50 mM MgCl2、Nuclear Extract 1x Transcription Buffer、100 mM rATP、100 mM rCTP、100 mM rGTP、100 mM rUTP 以及 CMV 启动子阳性对照模板。置于冰上解冻。
注意：使用高保真聚合酶扩增阳性对照 DNA 模板，并将其分装为标准化的单次使用 aliquot 后储存。 - 在配制 10 mM 工作液前，将解冻的 rNTPs 混匀并短暂离心。
注意：将每种 rATP、rCTP、rGTP 和 rUTP 各取 2 µL 加入 12 µL H2O 中，使每种 rNTP 浓度达到 10 mM。必要时可按比例放大。 - 将 rNTP 混合液分装至已标记的单次使用离心管中，于 -20 °C 保存以备后续使用。
- 在一支新标记为 "Mastermix" 的 1.5 mL 离心管中，按照 表 5 所列添加每种反应所需的试剂
- 将 14 µL Mastermix 转移至每个反应管中
- 向每个反应管中加入 11 µL 减去（相当于 5 µg 核提取物体积）的 1x Transcription Buffer。
- 向每个反应管中加入 5 µg 核提取物。
- 轻轻弹击反应管以混匀内容物，混匀后短暂离心，确保无反应物附着在管壁上。
- 在 30 °C 下孵育反应体系 30 分钟。
- 立即加入 RNA 提取试剂盒提供的 400 µL RLT 缓冲液以终止反应。
注意：此时可安全暂停实验。样品可在 -80 °C 保存，待后续使用 RNA 提取试剂盒进行纯化处理。
7. RNA 纯化
- 使用RNA提取试剂盒中提供的无RNase DNase试剂盒配制DNase I储存液。将冻干的DNase I溶于550 µL无RNase的水中，轻轻混匀，切勿涡旋。将DNase I溶液分装至每管10 µL的单次使用离心管中，于-20 °C保存。
- 使用分子生物学级乙醇和无RNase的水配制70%和80%乙醇溶液。
- 在开始纯化前，将样品和试剂转移至无RNase的工作区域。
- 向每个样品中加入400 µL 70%乙醇，轻轻吹打混匀。
- 将400 µL样品转移至已标记的RNA提取离心柱（配有2 mL收集管）中，在8,500 × g下离心30秒，弃去穿流液。
- 对剩余样品重复步骤7.5，弃去穿流液。
- 向每个离心柱中加入350 µL RW1缓冲液（RNA提取试剂盒），在8,500 × g下离心30秒，弃去穿流液。
- 向一份10 µL的DNase I储存液中加入70 µL RDD缓冲液（RNA提取试剂盒），轻轻混匀，切勿涡旋。
- 将DNase I孵育混合液（80 µL）直接加至离心柱膜上，在室温孵育15分钟。
注意：务必确保将DNase I溶液加至膜表面，避免溶液附着在柱壁或O型圈上造成损失。 - 孵育15分钟后，向各离心柱中加入350 µL RW1缓冲液，在8,500 × g下离心30秒，弃去穿流液。
- 将离心柱转移至新的2 mL收集管中，向每个离心柱中加入500 µL RPE缓冲液（RNA提取试剂盒），在8,500 × g下离心30秒以洗涤膜，弃去穿流液。
- 向每个离心柱中加入500 µL 80%乙醇，在8,500 × g下离心30秒，弃去穿流液。
- 将离心柱转移至新的2 mL收集管中，保持柱盖打开，于17,900 × g下离心5分钟，弃去穿流液。
- 将离心柱放入已标记的1.7 mL离心管中，向离心柱膜中心直接加入17 µL无RNase的水，室温静置1分钟，然后在17,900 × g下离心1分钟。
- 弃去离心柱，保留含有新纯化RNA样品的1.7 mL离心管。
8. DNA 消化
- 将两个加热模块分别预热至 37 °C 和 65 °C。
- 向每个样品中加入 2 µL 的 10x 反应缓冲液。
- 向每个样品中加入 1 µL（1 MBU）DNase。
- 将移液器调至 10 µL，上下吹打混合溶液，轻柔混匀。切勿涡旋振荡。
- 将 RNA 样品在 37 °C 下孵育 30 分钟，以消化残留的 DNA。
- 将样品置于 65 °C 加热模块上孵育 10 分钟，以灭活 DNase。
注意：可在本步骤暂停，将 RNA 储存于 -80 °C，待后续进行逆转录反应。
9. 逆转录
- 设置热循环仪程序时，在孵育步骤前增加一个额外的 1 小时、37 °C 预热步骤，以预热热循环仪。在准备样品的同时运行带有“预热步骤”的程序，使热循环仪升至 37 °C。当逆转录样品准备好后，跳过 37 °C 预热步骤，直接进入实际孵育步骤（表 6）。如果热循环仪不具备跳过功能，则在孵育前增加一个 1 分钟、37 °C 的步骤。在暂停系统并加入已准备好的样品前，确保热循环仪已升至设定温度。
- 用无 RNase 的 H2O 配制 10 µM 的转录反向引物工作液，并置于冰上保存。
- 将逆转录试剂盒中的 10x 缓冲液、dNTP 混合物（每种 dNTP 5 mM）、RNase 抑制剂和逆转录酶置于冰上解冻。
- 按照 表 7 所列成分，在洁净的 0.2 mL PCR 管中配制每反应所需的主混合液（Mastermix）。
- 将 18 µL 主混合液分装至每个样品对应的新的 0.2 mL PCR 管中。
- 向各标记好的管中分别加入 2 µL 经 DNase 处理的 RNA 样品。
- 将样品置于已预热的热循环仪中，在 37 °C 孵育 1 小时。
- 逆转录完成后，将样品转移至 -20 °C 保存，或直接进行下一步操作。
注意：可在本步骤暂停；cDNA 可在 -20 °C 保存以备后续使用。
10. 特异性产物扩增
- 在冰上解冻：cDNA、10 µM 转录正向引物和10 µM 转录反向引物，以及PCR 2x Premix A。
注意：将PCR 2x Premix A分装成较小体积，以缩短解冻时间。 - 在洁净的0.2 mL PCR管中加入表8中列出的组分，配制主混合液（每反应）。
- 将24 µL主混合液分装至各洁净并标记好的0.2 mL PCR管中，每管对应一个样本。
- 向各对应PCR管中分别加入1 µL各样本的cDNA。
- 将样本放入热循环仪中，采用表9中所述的程序条件进行孵育。
- 孵育结束后，将PCR产物于4 °C保存，或于-20 °C长期保存。
11. 凝胶分析
- 使用1x TAE缓冲液制备含有2% w/v 琼脂糖和1x凝胶染料的凝胶。
- 以50 V和300 mA的条件电泳运行PCR产物1小时，或直至条带完全分离。
- 使用凝胶成像仪中预设的自动曝光程序对凝胶进行成像。
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结果
按照上述步骤操作应可获得具有功能的核提取物(图 1)，若研磨或洗涤步骤出现偏差，可能导致活性不佳或得率低下。若成功获得具有功能的C. elegans核提取物，则将其加入前述的体外检测体系后，可转录DNA模板上CMV启动子下游的区域。所产生的RNA转录本可通过常规方法从核蛋白和DNA模板中纯化出来。在无DNA模板的情况下，逆转录及后续PCR产物只能来源于核提取物所转录的RNA。PCR产物可在琼脂糖凝胶上进行观察，DNA条带的强度可反映核蛋白与RNA分离的质量。条带信号微弱可能是由于核提取物因加热失活或缓冲液配制不当所致。条带信号过强则可能源于DNA污染，原因包括RNA纯化不充分或DNase消化不完全。稳定且成功的核提取应产生强度相近的条带，且转录和PCR的阴性对照均应无可见的PCR产物(图 2)。
...
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讨论
C. elegans 是研究真核生物转录系统的理想模式生物，因其培养成本低且易于进行遗传操作。本文描述了一种从 L4 期 C. elegans 中稳定分离功能活性核提取物的实验方案。尽管本方案重点在于可视化转录活性，但转录后产生的 cDNA 可通过 RT-qPCR 进行定量，从而更精确地测量转录活性8。该从 C. elegans 中分离核蛋白的方法有助于拓展对真核生物转录机制的研究。由于 C. elegans 并非培养皿中的细胞培养物或酵母菌落，而是一种自由活动的多细胞动物，因此对其核提取物的研究可更清晰地揭示转录机制在不同时间或环境条件下的动态变化。这使得研究人员能够充分利用 C. elegans 成本低廉且生命力强的优势。C. elegans 与其他模式生物或细胞培养体系不同，在出现细菌或酵母污染时具有更强的耐受性。一旦发生污染，可利用已建立的实验方案轻松清除 C. elegans 群体中的污染物，从而节省处理污染所耗费的时间与精力
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披露
作者无任何竞争利益需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院MIRA基金（R35GM124678，授予J. S.）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>耗材与试剂 | |||
| 0.2 mL 8联管 & 平板盖片，透明 | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL 单个 PCR 管 | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL 无菌微量离心管 | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% 绝对分子级乙醇 | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% 乙醇，Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL 血清移液管 | VWR 国际公司 | 89130-898 | |
| 150 mm 培养皿 | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL 塑料注射器 | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject 注射器 | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL 真空滤杯，0.22 µm PES，Stericup Millipore Express Plus | 默克生命科学 | SCGPU10RE | |
| 50 mL 锥形离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339652 | |
| 50 mL 血清移液管 | VWR 国际公司 | 89130-902 | |
| 5 mL 血清移液管 | VWR 国际 | 89130-896 | |
| 琼脂，Criterion | VWR International | C7432 | |
| 琼脂糖 | 德文特科学 | CA3510-6 | |
| 酒精检测标记物 | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto蛋白胨 | VWR International | 90000-264 | |
| 秀丽隐杆线虫 | CGC | N2 | |
| 氯化钙 | 默克生命科学 | C4901 | |
| 胆固醇 | Millipore Sigma | C8667 | |
| 对照DNA模板克隆引物，正向5′’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| 对照DNA模板克隆引物，正向5′’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| 去离子水 | |||
| 二硫苏糖醇 | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA凝胶染料，SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA分子量标准混合物，O’基因尺 | Fisher Scientific | SM1173 | |
| 6x TriTrack DNA上样缓冲液 | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase，Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| 干冰 | |||
| 大肠杆菌 OP50 菌株 | CGC | OP50 | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A38 | |
| 甘油 | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa 核提取物体外转录系统，HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| HEPES溶液，1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| 盐酸 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| 次氯酸盐漂白剂 | Clorox | ||
| LB肉汤 | Millipore Sigma | L3022 | |
| 二氯化镁 | Millipore Sigma | M8266 | |
| 硫酸镁 | Millipore Sigma | M7506 | |
| 中等重量称量皿 | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| 显微镜载玻片，Vista Vision | VWR International | 16004-368 | |
| 分子级水，Hypure | Hyclone 实验室 | SH30538 | |
| 制霉菌素 | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR系统，含预混液A的FailSafe | Lucigen | FS99100 | |
| 氯化钾 | 默克生命科学 | P39111 | |
| 磷酸氢二钾 | Millipore Sigma | P3786 | |
| 磷酸二氢钾 | Millipore Sigma | P0662 | |
| 蛋白酶抑制剂，Halt 单次使用混合液 100x | 赛默飞世尔科技 | 78430 | |
| 蛋白定量试剂盒，Qubit | 赛默飞世尔科技 | Q33211 | |
| 逆转录试剂盒，Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA提取试剂盒 RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase 抑制剂 | 应用生物系统公司 | N8080119 | |
| 氯化钠 | VWR International | BDH9286-12KG | |
| 氢氧化钠 | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| 无菌注射器滤器，孔径0.2 µm 聚醚砜膜 | VWR 国际公司 | 28145-501 | |
| 蔗糖 | VWR International | 200-334-9 | |
| 转录引物，上游 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| 转录引物，反向 5’-cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween 20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| <强>仪器设备 | |||
| -20 °C 培养箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 20 °C孵箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 37 °C 培养箱 | Forma Scientific | ||
| 4 °C型冰箱 | 赛默飞世尔科技 | ||
| -80 °C 冷冻箱 | Eppendorf | ||
| 高压灭菌 | Sanyo | ||
| Balch匀浆器，isobiotec细胞匀浆器 | Isobiotec | ||
| 台式涡旋振荡器 | Fisher Scientific | 2215365 | |
| 离心机，Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| 离心机，VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| 解剖显微镜，Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Qubit 2.0 荧光计 | Invitrogen | Q32866 | |
| 凝胶成像系统，iBright FL1500 | 赛默飞世尔科技 | A44241 | |
| 凝胶系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| 加热块 | VWR International | 12621-048 | |
| 微型离心机，Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+，Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+，Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+，Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+，Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| 摇床平台 | VWR International | ||
| Thermocycler，Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
参考文献
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7(2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87(2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
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