方法文章

建立用于模拟肌萎缩侧索硬化症的电生理平台：采用区域特异性人多能干细胞来源的星形胶质细胞与神经元

5.4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62726

⸱

2021年8月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种用于诱导人源多能干细胞分化为脊髓星形胶质细胞和神经元，并将其共培养以进行电生理记录的方法。

摘要

人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）和神经元（hiPSC-N）为研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）的病理生理机制提供了有力工具 体外多电极阵列（MEA）记录是一种用于记录大量神经元群体的电场电位并随时间分析神经网络活动的方法。先前的研究已表明，当使用促进脊髓星形胶质细胞表型的分化技术获得的人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）与具有区域特异性的脊髓来源人诱导多能干细胞运动神经元（MN）共培养时，相较于无hiPSC-A共培养或与啮齿类动物星形胶质细胞共培养的情况，能够促进神经元的成熟并增强其电生理活性。本文描述了一种将脊髓区域特异性hiPSC-A与hiPSC-MN共培养，并利用MEA记录其电生理活动的方法。尽管本文所述的分化方案专门针对具有脊髓区域特异性的星形胶质细胞和神经元，但该共培养平台亦可应用于其他谱系特异性分化所得的星形胶质细胞与神经元，包括皮层来源的hiPSC-A与hiPSC-N。这些实验方案旨在提供一种电生理检测手段，以研究胶质细胞与神经元之间的相互作用，并为在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中具有治疗潜力的药物筛选提供平台。 多电极阵列, 人诱导多能干细胞, 星形胶质细胞, 运动神经元, 脊髓, 电生理记录, 共培养, 肌萎缩侧索硬化症

引言

人诱导多能干细胞来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）和神经元（hiPSC-N）是研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理生理机制的有力工具 体外 为药物发现策略提供转化研究范式1研究人员已证明，hiPSC-A 与 hiPSC-N 的共培养可促进两类细胞在形态学、分子水平、电生理学及药理学方面的成熟，形成复杂的神经元网络以及类似体内的星形胶质细胞-神经元相互作用 体内 对应物2,3类似的共培养实验可以重现肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理生物学的特征，例如星形胶质细胞介导的神经毒性4,5 神经元过度兴奋性6此外，随着分化方案的进步，人诱导性多能干细胞（hiPSC）可被分化为具有区域特异性的神经亚型，包括皮层和脊髓来源的hiPSC-A和hiPSC-N7,8这些策略为模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）中皮层和脊髓运动神经元的病理变化以及星形胶质细胞对二者的影響提供了可能。然而，这需要一种可重复的功能性检测方法来确定这些效应。

最近研究表明，多电极阵列（MEA）记录特别适用于神经元-星形胶质细胞共培养体系的电生理表征2。与单细胞电生理分析不同，这些高密度电极阵列能够在不破坏培养条件且保持细胞膜完整性的前提下，被动记录大量神经元的细胞外场电位。这类平台特别适用于长期记录培养细胞的细胞及网络活动，以及其对药理学干预的响应。最后，当星形胶质细胞作为培养体系中的变量存在时，MEA记录可为星形胶质细胞与神经元之间的双向相互作用提供功能性见解2,9。

本文展示了一种经过先前验证的、用于将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为脊髓来源的hiPSC星形胶质细胞（hiPSC-A）和hiPSC运动神经元（MN）的优化方案2。该脊髓来源hiPSC-A分化方案可稳定获得星形胶质细胞培养物，其中分别有高达80%、50%和90%的细胞表达S100钙结合蛋白B（S100β）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和同源框B4（HOXB4），表明细胞具有成熟的胶质细胞特性及脊髓区域特异性2,10。hiPSC-MN分化方案所产生的神经元中，>90%表达胆碱乙酰转移酶（ChAT），提示其具备成熟α运动神经元的身份特征2。此外，本方案还描述了生成hiPSC-A/MN共培养体系的技术，已有研究证实，与无星形胶质细胞或与啮齿类星形胶质细胞共培养的神经元相比，此类共培养体系中的神经元在Sholl分析和免疫荧光显微镜观察下表现出更复杂的形态结构2。尽管上述描述主要针对脊髓来源的hiPSC-A和hiPSC-N，但该方法的一个独特优势在于：先独立培养星形胶质细胞和神经元，再于后续时间点进行共培养的策略，可推广应用于研究其他特定脑区来源的神经元-星形胶质细胞相互作用，以及疾病特异性细胞间的相互作用7,8。最后，本方案还介绍了如何在微电极阵列（MEA）板上培养这些细胞，从而能够长期监测共培养体系组成对细胞功能活性的影响，并具备调控细胞组成和培养条件的能力。

这些实验方案的目的是提供一种功能性检测方法，用于研究星形胶质细胞与神经元之间的相互作用，观察与疾病相关的特异性变化，并测试在肌萎缩侧索硬化（ALS）领域具有治疗潜力的药物。对于本方案中最具挑战性的步骤，提供了视频操作说明。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 细胞培养基的制备

  1. 根据表1中列出的成分配制各自的细胞培养基。
  2. 将培养基混合后经无菌过滤，分装至500 mL滤瓶中，避光保存于4 °C，可保存最多2周。

2. 非汇合人诱导多能干细胞（hiPSC）的维持与传代

  1. 将基底膜基质（以分装形式储存于 -80 °C）在 2–8 °C 冰箱中过夜解冻。
  2. 用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）或杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）按 1:100（v/v）稀释基底膜基质。
  3. 加入足量的稀释后基底膜基质以覆盖组织培养板底部（10 cm 培养皿使用 5 mL，6 孔板每孔使用 2 mL），于 37 °C 孵育至少 30 分钟，可过夜；或在室温下孵育至少 1 小时。
  4. 吸除稀释的基底膜基质，并在加入培养基和接种细胞前用 PBS 洗涤一次。
  5. 每日观察培养板，判断并预估何时适合传代。当大多数 hiPSC 克隆变得足够致密，克隆中心出现散在的白色区域时，即可进行传代。切勿让克隆过度生长，否则会导致过度分化，表现为克隆中心出现黄色区域（因细胞多层堆积）、边缘出现大量拉长的细胞、克隆内部结构松散或细胞死亡增加。
  6. 传代当天，用记号笔在培养板外底面绘制网格线，以便准确覆盖整个板面。
  7. 在生物安全柜中使用倒置相差显微镜（10 倍物镜），手动用 200 µL 移液枪头刮除已分化的克隆。
  8. 用 PBS 洗涤培养板两次（10 cm 培养皿每次 5 mL）。
  9. 加入 5 mL 预热的组织解离蛋白酶（材料表），于 37 °C 孵育，直至克隆边缘开始变圆（4–7 分钟），但尚未从板底脱离。
  10. 小心吸除解离蛋白酶。用 PBS 轻柔冲洗两次，注意避免克隆脱落。
  11. 向培养板中加入 5 mL 预热的 hiPSC 培养基（表 1）。
  12. 用 5 mL 移液枪头在板底自上而下反复刮擦，使克隆脱离并破碎成较小的细胞团块。
  13. 将培养板旋转 90°，重复上述步骤。
  14. 用 5 mL 移液枪头轻柔吹打细胞团块，期间定期在显微镜下检查团块大小，直至大多数细胞团块包含约 50–100 个细胞。
  15. 将细胞团块接种至预先包被基底膜基质的培养板中，使用额外的 hiPSC 培养基冲洗原培养板。用 5 mL 移液枪头收集并转移大部分细胞团块至新板。
    注意：若操作一致，原培养板在传代前应有约 50% 表面被 iPSC 克隆覆盖。在此情况下，传代比例应为 1 个板传至 5 个新板。但具体比例可能需根据培养条件和细胞系特异的生长速率进行调整。
  16. 轻轻前后摇动新接种的培养板，使细胞团块均匀分布。
  17. 将培养板转移至培养箱（37 °C，5% CO2）中，静置过夜，以确保细胞充分贴壁。
  18. 每天更换一次完全培养基（10 mL hiPSC 培养基）。若传代后次日存在过多细胞碎片，可在换液前用 5 mL 培养基洗涤一次。
  19. 下次传代时机为大多数 iPSC 克隆中心出现白色区域时（参见步骤 2.5），通常在每次传代后 4–6 天发生。

3. 冻存 hiPSC

  1. 进行 hiPSC 传代的初始步骤，同步骤 2.5–2.14。
  2. 将细胞团块收集至 15 mL 离心管中，在 200 × g 条件下离心 2 分钟。
  3. 吸除上清液，将沉淀重悬于冻存液中，并用 5 mL 移液器转移至冻存管。
    注意：与传代步骤类似，通常的分装比例为一个 iPSC 培养皿对应五个冻存管，具体取决于克隆密度。每个冻存管使用 1 mL 冻存液。
  4. 将冻存管放入预冷的冻存盒中，并于 -80 °C 过夜。
  5. 24 小时后将细胞转移至液氮中保存。

4. 解冻 hiPSC

  1. 用基底膜基质包被一个10 cm培养皿（参见2.1-2.3）。
  2. 从液氮中取出一个iPSC冻存管，立即放入37 °C水浴中解冻，最多不超过2分钟。在水浴中轻轻摇动冻存管，直至其部分解冻，管内残留一小块冰，周围为液体状态。
  3. 使用1000 µL移液器将细胞团块从冻存管转移至15 mL锥形管中。加入最多15 mL预热的hiPSC培养基，以稀释冻存液中的二甲基亚砜（DMSO）。
  4. 将15 mL锥形管在200 × g 条件下离心2分钟。
  5. 吸除上清液，使用5 mL移液器将细胞沉淀重悬于含有20 µM Rho相关卷曲螺旋形成蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂（ROCK-I，化合物Y-27632）的hiPSC培养基中，以避免进一步吹打导致细胞团块破碎。
  6. 使用5 mL移液器将细胞团块转移至已包被基底膜基质的10 cm培养皿中。
    注意：若操作流程保持一致，一支冻存管中的细胞可接种至一个10 cm培养皿中。
  7. 轻轻晃动培养皿，使细胞团块均匀分布。
  8. 将培养皿放入培养箱中，静置过夜，以确保细胞充分贴壁。
  9. 解冻后第二天更换全部培养基，加入10 mL不含ROCK-I的hiPSC培养基。

5. 将人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为脊髓神经前体细胞（NPC）

  1. 确保在开始分化前，已准备好经基底膜基质包被的6孔板。
  2. 使用复苏后至少传代一次、最好两次，并且至少有四个10 cm培养皿的iPSC开始实验（参见步骤5.11中的说明）。
  3. 按照步骤2.5-2.14中的操作，进行hiPSC传代的初始步骤。
  4. 使用5 mL移液器将至少两个10 cm培养皿中的细胞聚集体转移至15 mL离心管中。
  5. 以 200 x 离心 g 2 分钟。
  6. 吸弃上清液，用10 mL移液管加入10 mL hiPSC培养基重悬细胞沉淀，随后再次以200 x g离心 g 2分钟，以松解每个聚集体中的细胞间黏附。
  7. 吸弃上清液，用1000 µL移液器将细胞沉淀重悬于1 mL含20 µM ROCK-I的hiPSC培养基中。
  8. 使用1000 µL移液器反复吹打以分散细胞团块。定期在显微镜下观察团块大小，直至大部分细胞悬液呈单细胞或小团块状 <10 个细胞。
  9. 使用血细胞计数板（推荐）或自动细胞计数仪对细胞进行计数，并计算细胞悬液中的细胞密度。
  10. 接种 3.0 × 106 将细胞悬液加入已预先包被基底膜基质的6孔板的每个孔中。使用1000 µL移液器转移细胞悬液。
    注意：如果始终一致地应用该方案，则相当于将两个10 cm培养皿的细胞接种至6孔板的一个孔中。
  11. 用第二批两个10 cm培养皿重复步骤5.3–5.10，并将最终产物接种至第二块6孔板中预先包被基底膜基质的孔内。使用1000 µL移液器转移细胞悬液。
    注意：理想的脊髓NPC方案完成需要两孔，相当于四个10 cm培养皿。为便于操作流程，建议将两批各两个培养皿分别进行步骤5.3–5.10，最终得到两个独立的6孔板，每孔含有3.0 × 106 细胞
  12. 将所得的人iPSC单层细胞培养于含有20 µM ROCK-I的hiPSC培养基中，直至细胞融合度达到 >90%，通常在接种后的第二天进行，但最迟不超过初始接种后的3天，以避免自发（不受控）分化。
  13. 如果无法在细胞铺板后的次日开始诱导分化，则用 PBS 清洗细胞一次，并每天更换含有 20 µM ROCK-I 的新鲜 hiPSC 培养基。若未达到汇合 >90% 的细胞在铺板后 3 天内未达到要求时，弃去细胞并重新开始实验方案。
  14. 一旦 >当达到90%融合度时，开始诱导分化。此为第0天 体外 分化方案的第1天（DIV1）。
  15. 在第1天体外培养时，弃去含有20 µM ROCK-I的hiPSC培养基，并用PBS冲洗两次，以去除干细胞培养基中存在的成纤维细胞生长因子（FGF）和转化生长因子-β（TGFβ）。
  16. 更换为 WiCell 培养基（表1添加 0.2 µM LDN193189（LDN）和 10 µM SB431542（SB）处理 48 小时。
  17. 在DIV 3时，用PBS洗涤一次，更换为添加LDN（0.5 µM）+ SB（10 µM）+ 视黄酸（RA；1 µM）的WiCell培养基，处理48小时。
  18. 在DIV 5时，用PBS洗涤一次，并将培养基更换为WiCell：神经诱导培养基（NIM）基础培养基（表1)（50%:50%，v/v）并添加LDN（0.5 µM）+ SB（10 µM）+ RA（1 µM），处理48小时。
  19. 在 DIV 7 时，使用与步骤 5.18 相同的培养基进行换液。
  20. 在 DIV 8 时，用 PBS 洗涤一次，更换为 WiCell:NIM 基础培养基（50%:50%），并添加视黄酸（RA）（1 µM）、嘌呤霉素胺（PMN）（1 µM）、重组人脑源性神经营养因子（BDNF）（10 ng/mL）和抗坏血酸（ASAC）（0.4 µg/mL），处理 48 小时。
  21. 在DIV 10，用PBS洗涤一次，更换为NIM基础培养基（100%），并按步骤5.20所述添加补充成分，培养48 h。
  22. 在第11或12天，用25 cm²培养瓶进行包被2 用于传代的含基底膜基质的无菌培养瓶
  23. 吸弃6孔板中每孔的培养基，用PBS洗涤细胞一次。
  24. 向每个孔中加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C 培养 5–15 分钟；间歇性振荡培养板可能有助于细胞脱落。
  25. 如果细胞仍未悬浮，可通过将NIM培养基从1000 µL移液器枪头以环形运动方式吹打至细胞表面（确保覆盖整个表面）进行机械性分离，或使用细胞刮刀刮取（不推荐）。
  26. 将两孔中的细胞转移至15 mL离心管中，用5 mL移液器根据所用胰蛋白酶的量按适当比例加入胰蛋白酶抑制剂。
  27. 以 200 x 离心 g 孵育2分钟，吸除上清液，然后用10 mL移液管加入10 mL NIM基础培养基重悬。
  28. 再次以 200 x 离心 g 2分钟，以松解细胞间黏附。
  29. 第二次离心后，弃去上清液，用1 mL添加了RA（1 µM）+ PMN（1 µM）+ BDNF（10 ng/mL）+ ASAC（0.4 µg/mL）和ROCK-I（20 µM）的NIM培养基（100%）重悬沉淀。使用1000 µL移液枪头，上下吹打细胞约五次，直至形成浑浊的悬浮液。
  30. 将聚集体重新接种至已包被基底膜基质的25 cm培养瓶中，并加入该培养基2 无菌培养瓶，最终将6孔板中两个孔的细胞合并至一个包被有基底膜基质的25 cm²培养瓶中2 无菌培养瓶（按1:2传代）。使用1000 µL移液器转移细胞悬液。
    注意：细胞应 >第13天时细胞应达到90%融合度，此后无需进一步操作，直至第14天。若细胞未达到融合，继续在培养基中添加ROCK-I，延长1至2天。
  31. 在DIV 14，将培养基更换为新鲜的NIM培养基 + RA（1 µM）+ PMN（1 µM）+ BDNF（10 ng/mL）+ ASAC（0.4 µg/mL）。
  32. 在DIV 15时，将培养基更换为NIM：神经分化培养基（NDM）基础培养基（表1)（50%:50%）与视黄酸（RA，1 µM）+ PMN（1 µM）+ ASAC（0.4 µg/mL）+ Supplement B（50倍）+ 脑源性神经营养因子（BDNF，10 ng/mL）+ 胶质细胞系来源的神经营养因子（GDNF，10 ng/mL）+ 胰岛素样生长因子1（IGF-1，10 ng/mL）+ 纤毛神经营养因子（CNTF，10 ng/mL）共同作用。每隔一天更换一次新鲜培养基。
  33. 在 DIV 21 时，将培养基更换为 NDM 基础培养基（100%），并按步骤 5.32 所述添加补充成分，每隔一天更换一次新鲜培养基。
  34. 在第25-30天，收集神经前体细胞（NPC），并将其冷冻保存或传代至10 cm培养皿中进行终末分化。
  35. 用 PBS 清洗 T-25 培养瓶，加入 0.05% 胰蛋白酶。
  36. 37 °C 下孵育 5 分钟。
  37. 用 NDM 基础培养基冲洗胰蛋白酶和细胞，转移至 15 mL 圆锥形离心管中。按适当比例加入胰蛋白酶抑制剂，300 x g 离心 g 5 分钟。
  38. 用运动神经元或星形胶质细胞分化培养基重悬细胞沉淀（表1）并使用1000 µL移液器上下吹打，以获得单细胞悬液（通常最多5次）。
  39. 计数细胞，并使用分化培养基加Rock抑制剂（Rock-I），将细胞接种至按第6节所述方法包被的10 cm培养皿中，以诱导hiPSC-MN和hiPSC-A分化。
  40. 或者，将细胞重悬于冷冻保存液中进行冻存，冷冻液由90%含生长因子的NDM培养基（同步骤5.32–5.33）和10% DMSO组成，同样进行吹打混匀，然后转移至冻存管中。分装为每管6 × 106 每支冻存管中的NPC数量

6. 解冻NPC细胞培养物

  1. 在解冻细胞的前一天，用多聚鸟氨酸（PLO）和层粘连蛋白包被10 cm培养皿。
    1. 向培养皿中加入5 mL用PBS或去离子水（dH2O）稀释至100 µg/mL的PLO溶液。37 °C孵育至少1小时，可长达过夜。
    2. 吸除PLO溶液，并用PBS清洗培养皿三次。（若未充分清洗，PLO具有毒性。）
    3. 向已包被PLO的培养皿中加入用PBS稀释的层粘连蛋白，使其终浓度为10 µg/mL。37 °C孵育至少1小时，建议过夜。孵育后，不进行清洗，直接吸除层粘连蛋白溶液，以增强细胞贴附。
      注意：PLO包被的培养皿可提前制备，用去离子水清洗三次，在无菌操作台中干燥后，于4 °C保存。
  2. 每个10 cm细胞培养皿解冻一管神经前体细胞（NPC）冻存管（即DIV 25或30），每管含6 × 106个细胞。
  3. 从液氮中取出NPC冻存管，立即放入37 °C水浴中，最多放置2分钟。轻轻振荡冻存管，快速解冻至仅剩一小块冰晶悬浮于液体中即可。
  4. 使用1000 µL移液器将细胞团块转移至15 mL锥形离心管中，并加入最多15 mL预热的NDM或DMEM/F12培养基（含Dulbecco's Modified Eagles Medium / Ham's F12补充剂），以稀释DMSO。
  5. 以300 × g离心5分钟。
  6. 吸除上清液，用星形胶质细胞或运动神经元分化培养基（表1）加ROCK抑制剂（ROCK-I，20 µM）重悬细胞沉淀，使用1000 µL移液器反复吹打5次左右，直至获得单细胞悬液。
  7. 将单细胞悬液转移至已包被PLO-层粘连蛋白的10 cm培养皿中。
  8. 将培养皿放入培养箱中，静置过夜，避免扰动，以确保细胞充分贴附。

7. 将脊髓神经前体细胞分化为运动神经元

  1. 按照步骤 6.1–6.8 中所述进行初始操作，最终使用含 ROCK 抑制剂（20 µM）的运动神经元（MN）分化培养基。
  2. 铺板后的第二天，将培养基完全更换为不含 ROCK 抑制剂的运动神经元分化培养基，之后每隔一天换液一次。周末期间，于周五和周一分别换液。必要时用 PBS 冲洗细胞，以去除细胞碎片。
  3. 当胶质定向前体细胞在细胞簇中聚集的有丝分裂后运动神经元前体下方以单个增殖性扁平细胞形态出现时，更换为含阿糖胞苷（ARA-C）（0.02 µM）的运动神经元分化培养基，继续培养 48 小时。
    注意：通常在初次铺板后的前 7 天内发生此现象，但具体时间可能因细胞系不同而有所差异。
  4. 48 小时后，吸除含 ARA-C 的培养基，用 PBS 轻柔冲洗培养物三次，然后更换为不含 ARA-C 的新鲜运动神经元培养基。
  5. ARA-C 处理后，每隔一天（或在周一、周三、周五）进行换液操作，使用手动移液器而非真空抽吸装置移除旧培养基，以防止神经元簇过早脱落。此外，每周添加一次 1 µg/mL 的层粘连蛋白（Laminin），以进一步增强神经元在培养板上的贴附。

8. 将神经前体细胞分化为脊髓星形胶质细胞

  1. 按照第6节的方法解冻NPC细胞，使用星形胶质细胞分化培养基（表1），并添加终体积浓度为1%的胎牛血清（FBS）（NS + 1% FBS）以及ROCK抑制剂（ROCK-I，20 µM）用于接种。
    注意：可使用商品化的血清替代物（表1）替代FBS，稀释比例相同。
  2. 接种后次日，更换为不含ROCK抑制剂的NS + 1% FBS培养基，之后每隔一天换液一次。周末期间，于周五和下周一各换液一次。必要时用PBS冲洗细胞以去除细胞碎片。若细胞持续死亡，可在培养基中补充ROCK-I（10 µM）以促进细胞存活。需谨慎避免频繁或长期使用ROCK-I，以防筛选出永生化细胞。
  3. 在传代前让星形胶质细胞生长至融合状态。
    注意：细胞体积会随时间增大，因此没有固定的传代密度标准。通常传代比例为1:2或1:3。若细胞存活率较低或传代至过多培养皿中，可将两个（或根据需要更多）10 cm培养皿的细胞合并至一个10 cm培养皿中，以维持融合度。
  4. 对星形胶质细胞前体细胞进行传代时，先用PBS洗涤培养皿一次（以去除FBS），再加入0.05%胰蛋白酶孵育5分钟，随后用含1% FBS的NS培养基收集细胞（FBS可抑制胰酶活性），然后以300 × g 离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于含1% FBS的NS培养基中，并吹打至单细胞悬液状态。将细胞按NS + 1% FBS培养基分配至新的10 cm培养皿中。
    注意：重复传代不仅用于扩增星形胶质细胞培养物，还可清除仍保留神经元分化潜能的残余前体细胞。因此，即使细胞增殖率不高，若存在神经元污染迹象，也可按1:1比例进行传代。
  5. 在分化过程中逐步更换包被方式，以提高细胞产量，具体如下：
    1. 将初始解冻的NPC细胞及初次接种后的早期传代细胞接种于PLO/层粘连蛋白（PLO/Laminin）包被的培养皿中。
    2. 将未成熟的星形胶质细胞接种于基底膜基质包被的培养皿中。
    3. 将更成熟的星形胶质细胞（即分化第90天后）接种于基底膜基质、PLO/层粘连蛋白包被的培养皿（通常用于与神经元共培养），或非包被培养皿中。
  6. 可在60天成熟过程中的任意时间点冻存星形胶质细胞前体，以便同步培养或后续实验使用。当解冻处于NPC阶段之后的细胞时，应将星形胶质细胞前体接种于基底膜基质包被的培养皿，而非PLO/层粘连蛋白包被的培养皿。
  7. 自体外培养第90天（DIV 90）起及之后，将培养基由NS + 1% FBS更换为NS + 5% FBS，以促进星形胶质细胞存活并抑制其增殖。

9. 在多电极阵列板中共同培养运动神经元和脊髓星形胶质细胞

  1. 当运动神经元和星形胶质细胞准备好使用时，在同一天进行分化和铺板，运动神经元培养至第60天（DIV 60），星形胶质细胞培养至第90天（DIV 90）。
  2. 如果使用24孔塑料多电极阵列（MEA）板（材料表），请在铺板前一天或当天进行包被处理，步骤如下。
  3. 将PLO用去离子水或PBS稀释至100 µg/mL。
    1. 每孔加入15–20 µL（根据移液操作习惯调整），在孔中央形成液滴，覆盖电极区域及其周围区域，但不必覆盖整个孔底。
    2. 注意避免移液枪头接触或损伤电极。各孔之间应保持加入体积一致，以确保每孔包被面积相同。
    3. 在37 °C条件下孵育PLO至少1小时（建议2小时）。
      注意：若板内湿度过低，小体积液滴容易干燥。请在孔周围的加湿槽中加入去离子水，以保证包被过程及后续记录期间的足够湿度。
  4. 使用塑料移液枪头尽可能吸除PLO溶液，注意不要触碰电极。用250 µL去离子水洗涤三次。若使用真空抽吸装置进行洗涤，切勿将吸头靠近电极阵列区域。第三次洗涤后，尽可能吸除残留水分，必要时使用移液枪头完成。取下盖子，在细胞培养超净台中让孔板表面自然干燥。
  5. 待孔板表面完全干燥后，加入用PBS稀释至10 µg/mL的层粘连蛋白（Laminin）。每孔使用15–20 µL，覆盖电极阵列区域。在加湿槽中加水，盖上盖子，将板放回37 °C培养箱中孵育至少2小时，可过夜。
  6. 铺板当天，用PBS冲洗运动神经元（MN）和星形胶质细胞培养物一次，然后加入0.05%胰蛋白酶，在37 °C条件下消化5分钟以使细胞脱落。将细胞收集至15 mL锥形管中（内含胰蛋白酶抑制剂），并用培养基或基础液冲洗培养板，确保所有细胞均被回收。在300 × g 条件下离心5分钟，用1000 µL移液枪重悬细胞，制备成1 mL单细胞悬液。重悬运动神经元和星形胶质细胞时，更换为共培养培养基（表1），并额外添加20 µM ROCK-I。
  7. 使用血细胞计数板平行计数运动神经元和星形胶质细胞。在计数和计算过程中，将细胞悬液盖紧，并置于4 °C的泡沫架中保存。
  8. 计算所需体积，使细胞重悬后浓度达到：运动神经元为每5 µL含5 × 104 个细胞，星形胶质细胞为每5 µL含2.5 × 104 个细胞。将1 mL细胞悬液在300 × g 条件下离心5分钟，弃上清，按计算体积重悬细胞。
  9. 根据拟接种的孔数，乘以每种细胞悬液5 µL，计算所需总体积。将神经元和星形胶质细胞悬液按1:1比例混合，通过移液吹打2次使其充分混匀，但避免剧烈操作。
  10. 用移液枪头吸除MEA板各孔中的层粘连蛋白溶液。每孔加入10 µL最终混合的细胞悬液，形成覆盖电极阵列的小液滴，使每孔细胞密度为5 × 104 个运动神经元和2.5 × 104 个星形胶质细胞。
    注意：若混合细胞悬液浓度过高，需在接种过程中频繁重悬，以确保各孔细胞数量准确且一致。
  11. 将板放回培养箱孵育20–30分钟。注意避免扰动细胞液滴，使细胞在板上形成初始贴附。
  12. 20–30分钟后，用移液枪沿每孔壁缓慢加入250 µL预热的共培养培养基（含ROCK-I），再于对侧孔壁加入另外250 µL。将板放回培养箱继续培养。
  13. 铺板次日（共培养第1天）观察细胞状态。若存在大量细胞碎片或死亡细胞，应更换为含ROCK-I的新鲜共培养培养基；否则，在铺板后第二天（共培养第2天）更换为不含ROCK-I的共培养培养基。此后每周进行两次半量换液（吸除50%培养基，补充至最终体积的60%，以补偿蒸发损失）。
  14. 若使用配备单孔30 mm玻璃板的MEA系统（材料表），板的预处理可能需要2天或更长时间。请按以下步骤操作。
  15. 用0.05%胰蛋白酶处理前一轮MEA培养的细胞及碎片，消化5–15分钟，使细胞脱落。
  16. 吸除胰蛋白酶，用去离子水冲洗三次。
  17. 加入70%乙醇进行灭菌，在超净台中孵育10分钟。吸除乙醇后，再用去离子水冲洗三次。
  18. 加入含蛋白酶的1%阴离子洗涤剂水溶液。盖上盖子，用热塑性薄膜和铝箔包裹，室温下置于摇床上过夜。
  19. 吸除洗涤剂，再用去离子水冲洗三次。
  20. 若计划储存板，请加入足量去离子水，盖上盖子并用热塑性薄膜和铝箔包裹，置于冰箱中保存至下次使用。
  21. 若计划立即包被，请在细胞培养超净台中让板表面自然干燥。
  22. 如需额外灭菌（例如曾发生污染或长期未使用），仅在此时将MEA板置于超净台内接受紫外（UV）照射30–60分钟。
    注意：应避免频繁使用UV照射，以防损伤电极。若板表面残留血清成分时进行UV照射，会导致电极功能失效，因此UV处理仅适用于已彻底清洁的板。
  23. 待板完全干燥后，进行1分钟的等离子清洗，以激活MEA板玻璃表面电荷，增强包被效果。建议每完成4–5次MEA板清洗-铺板循环后，至少进行一次等离子清洗。
    1. 若无法或无需进行等离子清洗，可替代性地加入足量含胎牛血清（FBS）的培养基覆盖MEA板表面，放回培养箱过夜。
  24. 按照上述第6节所述方法使用PLO/层粘连蛋白进行包被。在完成等离子清洗后，或吸除并冲洗含FBS培养基后，立即加入PLO溶液（100 µg溶于PBS）。
  25. 按以下密度进行细胞铺板：每板接种1 × 105 个hiPSC来源的星形胶质细胞（hiPSC-A）和5 × 105 个hiPSC来源的运动神经元（hiPSC-MN）。

10. 多电极阵列记录

  1. 使用 Butterworth 滤波器（200 Hz 高通和 3 kHz 低通滤波）以 12.5 kHz 的采样频率提取原始电压数据。将尖峰识别设定为电压瞬时时间点，其值大于或等于基线标准差的 6 倍。将 100 毫秒内出现 >5 次尖峰的活动定义为簇状放电。当在 100 毫秒内超过总活跃电极数的 35% 发生放电，且每次网络簇状放电至少产生 50 次尖峰时，定义为网络活动。
  2. 从共培养（CC）第 1 天起尽快开始记录。
    注意：在共培养第 3 天之前通常很少观察到电活动。
  3. 在进行生化检测、免疫细胞化学（ICC）或 qPCR 实验时，将平行培养物以相似密度接种于相应的培养板或盖玻片上，并设置重复样本。
  4. 设置记录温度为 37 °C，CO2 浓度为 5%。将培养板转移至记录设备，并在开始记录前至少平衡 5 分钟。
  5. 根据实验设计，每隔一天或每周记录一次基线活动，每次记录持续 1–15 分钟。在换液后至少 1 小时内不得进行记录，理想情况下每次换液后应等待 24 小时再记录。
  6. 为防止污染，若无菌培养板的盖子需在无菌操作台外打开（例如施加药物化合物），则在任何记录后更换培养基（即进行步骤 9.14 中的半量换液）。如果培养板在药物处理后还需继续使用，则应进行完全换液和清洗，以彻底清除药物。
  7. 为分析目的，每种实验条件至少使用三个技术重复和生物学重复。电生理数据以 n ≥ 3 个重复的均值表示。

11. 多电极阵列上的药理学检测

  1. 根据实验问题使用不同的共培养组合：肌萎缩侧索硬化症（ALS）神经元与对照星形胶质细胞、对照神经元与ALS星形胶质细胞、ALS神经元与星形胶质细胞、对照神经元与星形胶质细胞。
  2. 在研究靶向神经元或星形胶质细胞的化合物的瞬时电生理效应时，移除培养板盖但保持仪器盖关闭，记录至少1分钟的基础电活动。
  3. 在不停止电生理记录的情况下，手动打开仪器盖，使用多通道移液器（若处理多个孔）将25 µL培养基更换为相应的药物溶剂（通常为新鲜培养基）。手动关闭仪器盖。
  4. 继续记录额外1分钟（或更长时间，若溶剂引起显著变化且培养物需要时间恢复）。
  5. 再次手动打开仪器盖，将25 µL培养基更换为含有目标药物的相同溶剂。关闭仪器盖并继续记录。
    注意：记录时长及给药/溶剂体积可能因实验问题而异，或需优化。
  6. 为分析目的，需确保溶剂添加不会引发电生理参数的显著变化。计算给药后相对于溶剂添加后的电活动变化百分比，并在不同条件下进行比较。
  7. 为研究长期电生理效应（例如候选疾病修饰药物），记录第11.2步所述的基础电活动。此时可使用含有目标药物（以适当溶剂配制）的共培养基，或仅含溶剂的培养基。
  8. 为分析目的，将长期接受药物处理的ALS或对照共培养物在不同时间点的记录结果相互比较，并与对照条件进行比较。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

生成hiPSC-MN和脊髓hiPSC-A的脊髓模式化方案如图1所示。在本方案中，hiPSC以非融合集落形式进行维持和传代（图2A）。通过添加LDN193189和SB431542实现双SMAD抑制，启动神经发生（神经诱导），分别抑制骨形态发生蛋白（BMP）和转化生长因子-β（TGF-β）信号通路。该步骤采用基于单层培养的方法，将hiPSC接种于黏附基质（如基底膜基质）上，以生成类似神经上皮的二维培养体系。形态学上，神经诱导的特征是细胞从具有大细胞核和圆形形态的iPSC转变为紧密排列、细胞质丰富且呈柱状的神经上皮（干细胞）样细胞。这些细胞将进行水平和垂直方向的分裂，形成多层上皮结构（图2B，i）。

相较于3D策略（即基于类胚体的方法），优先选择2D策略的依据来自文献证据11,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

迄今为止，基于 hiPSC 和多电极阵列（MEA）的星形胶质细胞-神经元共培养电生理记录方法在肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究领域中的应用仍较为有限6 并且尚未应用于完全人类化的平台，相比之下，其在更广泛用途中的应用 体外 癫痫建模9然而，该平台有望解决肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究中具有病理生理学意义的问题，例如神经元过度兴奋的机制、星形胶质细胞对神经毒性的贡献，或神经网络活动在疾病进展中的作用。此外，该平台可实现长达9个月以上的前瞻性电生理数据采集。 体外 因此，提供了一种用于测试具有治疗潜力化合物的方法2.

文献中报道的 hiPSC-N 和 hiPSC-A 生成方案在培养基条件、培养时间、产量以及成熟特征等方面存在广泛差异。本平台的一个主要优势在于，星形胶质细胞和神经元是分别诱导分化，随后在较晚的时间点通过两种细胞类型的共同接种实现共培养。在对细胞密度和时间进行优化后，该方法也可推广应用于其他方案获得...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本手稿得到了以下资助：2019年MSCRFF 5119（AT）；NIH/NINDS K08NS102526（CWH）；2020年多丽丝·杜克慈善基金会临床科学家职业发展奖（CWH）；NIH/NINDS 1R01NS117604-01（NJM）；美国国防部ALS研究计划W81XWH2010161（NJM）；2019年MSCRFD 5122（NJM）。我们感谢Raha Dastgheyb博士和Norman Haughey博士提供了我们用于验证所述电生理平台的MEA平台及数据分析软件。 我们还要感谢Khalil Rust在实验方案演示和拍摄过程中提供的协助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 cm 无菌培养皿Falcon353003
25 cm2 无菌培养瓶Falcon353136
2-巯基乙醇（β-METhermofisher21985023工作浓度 110 µM
500 mL 0.2 µm CA 过滤系统康宁430769
5 mL 移液管Falcon357543
6 孔无菌培养板Falcon3046
两性霉素BGibco15290018工作浓度 2.0 μg/mL
含蛋白酶的阴离子洗涤剂 - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287工作浓度 1% m/v
抗坏血酸（ASAC）SigmaA4403将100 mg溶解于250 mL的dH₂O中2O以获得0.4 mg/ml的储存液。经0.22 μm滤膜无菌过滤 µm 滤器分装并置于 -80 冻存 ºC. 按1:1000稀释后使用。（工作浓度为0.4 µg/mL
Axion CytoView MEA 24 孔板（M384-tMEA-24W）AxionOPT-24
Axion Edge MEA 平台AxionMaestro Edge
基底膜基质 - Matrigel康宁354277实验方案中的细节
台式显微镜（在细胞培养罩内保持无菌）Zeiss415510-1100-000Primo Vert
荷包牡丹碱Sigma Aldrich14340工作浓度10 μM
睫状神经营养因子（CNTF）Peprotech450-13溶解 100 µg 溶于 1 mL 无菌 PBS 中，然后向其中加入 9 mL 无菌 0.1% BSA-PBS 至 10 µg/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 ºC. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。
CO2 Axion Edge 的储液罐和调节器AirGas/Harris9296NC
化合物 EAbcamab142164溶解 250 µg 溶于 2.0387 mL DMSO 中，得到 250 µM 储存液。分装后于 -80 ℃ 冻存 ºC. 按1:2000稀释后使用（工作浓度为125 nM）。
Cyanquixaline  (CNQX)Sigma AldrichC239工作浓度 50 μM
二氢海人酸（Dihydrokainic acid, DHK）Tocris111工作浓度 50 μM 和 300 μM
DMEM/F12赛默飞世尔科技113300工作浓度 1x
Essential 8 培养基 + Essential 8 添加剂赛默飞世尔科技A1517001将10 mL Essential 8 (10x) 培养基混合  加入500 mL Essential 8生长培养基（1×）
胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技16140071工作浓度 1x
胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）Peprotech450-10溶解 100 µg 溶于 1 mL PBS 至 100 µg/mL，然后向其中加入9 mL无菌的0.1% BSA-PBS至10 µg/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 ºC. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。
血细胞计数板电子显微科学63510-20
肝素Millipore-sigmaH3149-100KU将200 mg溶解于100 mL PBS中，配制成2 mg/mL的储存液。将储存液分装为每份15 mL和500 mL。 µL 型试管。使用时按 1:1000 稀释。（工作浓度为 2 µg/mL
湿度可控细胞培养箱赛默飞世尔科技370设定为37 ºC，5% CO2
胰岛素样生长因子1（IGF-1）R&D 系统291-G1-200溶解 200 µg 溶于 2 mL PBS 至 100 µg/mL，然后加入18 mL 0.1% BSA-PBS，定容至10 µg/mL 储液，于 -80 保存 ºC. 分装并置于 -80 冰冻 ºC. 稀释10倍 µg/mL 原液按 1:1000 稀释使用（工作浓度为 10 ng/mL）。
红藻氨酸Abcamab144490工作浓度 5 μM
无血清替代物（Knockout Serum Replacement, KSR）赛默飞世尔科技10828工作浓度 1x
层粘连蛋白赛默飞世尔科技23017-015储存液浓度 1 mg/mL，工作浓度 10 µg/mL（包被），1 µg/mL（细胞培养基）
LDN193189Stemgent04-0074将2 mg的LDN溶解于500 µ加入氯仿至终浓度为10 mM的储存液。分装后于-80℃保存 ºC. 使用时，先将储存液按1:10的比例用DMSO稀释至1 mM，再将1 mM的溶液按1:5000的比例稀释到所需培养基中，以获得0.2 μM的终浓度。 µM 工作液
L-谷氨酰胺赛默飞世尔科技25030工作浓度 100 倍
MEA 玻璃板MultiChannel Systems60MEA200/30iR-Ti-gr
多通道移液器 P200GilsonPJ22224
Neurobasal赛默飞世尔科技21103049工作浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA）赛默飞世尔科技11140050工作浓度 100x
青霉素/链霉素赛默飞世尔科技15140122工作浓度 100 倍
多聚鸟氨酸（PLO）Sigma-AldrichP3655将100 mg溶解于1 mL去离子水中，配制成100 mg/mL的储存液。将储存液分装为每份100 μL µL 管。（工作浓度 100 µg/mL
氯化钾（KCl）NANA工作浓度100 mM
Purmorphamine (PMN)Millipore-Sigma540223将5 mg溶于9.6 mL DMSO中，配制成1 mM溶液。分装后于-80 ℃保存 ºC. 按1:1000稀释后使用。（工作浓度为1 µM)
重组人脑源性神经营养因子（BDNF）Peprotech450-02离心片刻后再进行重悬。溶解100 µg 溶于 1 mL PBS 至 100 µg/mL，然后向其中加入 9 mL 无菌的 0.1% BSA-PBS µg/mL。分装后于 -80 ℃ 冻存 ºC. 按1:1000稀释后使用（工作浓度为10 ng/mL）。
视黄酸（RA）SigmaR2625将100 mg溶解于3.3 mL DMSO中，配制成100 mM的储存液。分装储存液100 µL型管，-80℃冻存 ºC. 取 200 µ100 mM 原液取 L，稀释 10 倍（加入 1.8 mL DMSO）制备 10 mM 原液。分装 50 µL型管 并储存于 -80 ºC. 按1:10000稀释后使用。（工作浓度为2 µM)
ROCK-I 抑制剂Peprotech1293823将5 mg溶解于1480 µL 的 dH2O 配制成 10 mM 储存液，分装后于 -80 ℃ 冻存 ºC. 按1:500稀释后使用。（工作浓度为20 µM)
SB431542SigmaS4317将5 mg溶解于1.3 mL DMSO中，配制成10 mM储备液。分装后于-80 ℃保存 ºC. 使用时按1:1000稀释。（工作浓度10 µM)
无菌细胞培养罩贝克公司SG-600
补充剂 B - B27 补充剂赛默飞世尔科技21985023工作浓度 50x
补充剂 N - N2 补充剂赛默飞世尔科技17502048工作浓度 100 倍
台式细胞培养离心机ThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
热塑性塑料 薄膜 - ParafilmPARAFILMP7793
组织解离蛋白酶 - DispaseStemCell Technologies7923工作浓度 1x
胰蛋白酶抑制剂SigmaT6522-1G将1g溶于100mL ddH₂O中2O以配制10 mg/mL的储存液。分装后于4℃保存 ºC. 将胰蛋白酶按1:10体积稀释后使用（工作浓度为1 mg/mL）。
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）赛默飞世尔科技2530054工作浓度 1x
水浴锅赛默飞世尔科技2332Isotemp

参考文献

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

SMAD JAK STAT

相关文章