方法文章

使用无细胞系统对用于蛋白质原型的最小线性模板进行扩增的快速酶促方法

DOI：

10.3791/62728

⸱

2021年6月14日

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

本文内容

摘要

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该研究描述了一种方案，用于在不克隆或使用活细胞的情况下从合成基因片段中创建大量（μg-mg）DNA以进行蛋白质筛选活动。将最小模板酶消化并循环化，然后使用等温滚动循环扩增进行扩增。无细胞表达反应可以用未纯化的产物进行。

摘要

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该协议描述了最小DNA模板的设计以及酶扩增的步骤，从而可以使用无细胞表达在不到24小时的时间内快速对可测定的蛋白质进行原型设计。从供应商处接收DNA后，对基因片段进行PCR扩增、切割、循环和冷冻储存。然后使用等温滚动圆扩增（RCA）稀释和显着扩增少量储存的DNA（高达106x）。RCA可以从起始物质的皮克水平（如果使用所有起始合成片段，则为mg水平）产生微克量的最小表达模板。在这项工作中，起始量为20 pg导致4μg的最终产物。所得的RCA产物（最小模板的串联体）可以直接添加到无细胞反应中，无需纯化步骤。由于这种方法完全基于PCR，因此当与自动化液体处理系统结合使用时，它可能会实现未来的高通量筛选工作。

引言

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无细胞基因表达（CFE）已成为一种具有许多应用的强大工具。这些应用包括疾病检测1，2，3，4，5，6， 微量营养素和小分子检测7，8，9，10，11，12， 生物制造13，14，15，16，17 ，

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方案

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1. 设计基因片段

注意:基因片段应具有转录/翻译所需的所有遗传元件，包括启动子，核糖体结合位点（RBS），起始密码子，目的基因和终止子。虽然终止子对于线性表达模板（LET）不是必需的，但如果用户决定将序列插入质粒中，则这一点很重要。这些序列是从pJL1-sfGFP质粒55（ 来自Michael Jewett实验室的礼物）中取出的，该质粒使用T7启动子。除了这些必要的遗传元件外，在启动子（5'切位点）之前添加六个碱基对的限制性内切位点，在终止子（3'切位点）之后再添加六个碱基对，在这种情况下使用HindIII（可以使用其他限制性内切酶，但使用一种高保真限制性内切酶标准化序列以减少保存在文库中所需的数量是有帮助的）。在5'切割位点的上游添加10个碱基对，在3'切割位点的下游添加10个碱基对，在这种情况下使用标准化的M13引物序列（引物是廉价的库存项目）。所使用的限制性内切酶位点和引物由使用者自行决定。但是，用户必须确保序列不存在于模板中的其他任何位置（不想创建不需要的切割或扩增起始位点）。本工作中使用的模板的顺序在补充材料中进行了详细介绍。这些步骤用于从此基本模板进行修改。

  1. 确定要表达的所需基因，并获得氨基酸序列或基因序列（如果已在 大肠杆菌中表达）。
  2. 如果是氨基酸序列，请使用许多标准供应商工具之一对 大肠杆菌 进行密码子优化

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结果

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当在15μL反应中仅使用0.30μL未纯化的RCA DNA时，RCA模板中sfGFP的表达与pJL1质粒的表达相当（图2A）。事实上，在BL21 DE3 Star提取物中，将模板的量增加一倍和三倍似乎没有益处，这表明模板的饱和水平已经达到每次反应0.30μL。相反，当添加到来自SHuffle菌株的细胞提取物中时，增加RCA模板的量似乎有好处（图2B）28。对于某些蛋白质，可以非常快速地观察到结果，这会将整个工作流程（扩增和测定）压缩到24小时以下。然而，一些蛋白质需要较低的温度或具有较慢的折叠时间，这将增加获得结果的时间，但会影响此处介绍的工作流程。当表达枯草杆菌蛋白酶（SBT（n））时，可以观察到这一点，其中表达4小时后的测定时间不足以使SBT（n）成熟（图3A，失败结果的示例）。允许反应持续16小时可导致可检测的SBT（n）水平（图3.......

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讨论

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目的基因可以是任何所需的蛋白质，但最好从荧光蛋白开始，作为方便的报告者，以便在孔板读数仪上进行实时或终点读数，以便新采用该方法。对于新的蛋白质序列，复制所需蛋白质的氨基酸序列并将其粘贴到所需的密码子优化工具61，62中。密码子优化工具中通常有许多可用的大肠杆菌生物和菌株，但选择一般大肠杆菌选项将是合适的。优化后，仔细检查基因以确保先前选择的切点和引物序列不存在。如果是这样，则可以优化序列，直到序列不再存在。在某些情况下，如果重复优化始终导致内部 HindIII 切割位点，则可能需要将 HindIII 切割位点替换为不同的限制位点。最好尽可能多地使用相同的切割部位，以保持过程标准化，并降低手头保留多种限制性内切酶的成本。

在开始扩增之前，选择最适合LET的PCR试剂盒。具有<1，000个碱基对的LET可以使用简单的Taq聚合酶扩增，而具有≥1，000个碱基对的LET可能需要更高保真度的聚合酶63。.......

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披露

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Nigel Reuel是BigHat Biosciences Inc.的科学顾问委员会成员，该公司使用无细胞系统来设计抗体。

致谢

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作者承认NIH 1R35GM138265-01和NSF 2029532对该项目的部分支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙氨酸FormediumDOC0102
铵谷氨酸MP BiomedicalsMP21805951
精氨酸FormediumDOC0106
天冬FormediumDOC0114
天冬氨酸DOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen 密封膜康宁PCR-SP
CMPigmaC1006
辅酶 ASigmaC3144
CutSmart 缓冲液NEBB7204S提供 HindIII
半胱氨酸用于培养基DOC0122
DNA 清洁和浓缩试剂盒Zymo ResearchD4004用于纯化 DNA
dNTPsNEBN0447
大肠杆菌， tRNASigma （Roche）10109541001
亚叶酸， Sigma47612
片段IDT
谷氨酸培养基DOC0134
谷氨酰胺培养基DOC0130
甘氨酸， 培养基
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
组氨酸DOC0142
异亮氨酸中DOC0150
亮氨酸中DOC0154
赖氨酸对于中DOC0158
谷氨酸镁Sigma49605
蛋氨酸For中DOC0166
微量滴定板（384 孔）Greiner781906
微量滴定板（96 孔）Greiner655809
多功能微孔板检测仪BioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
纳米光度计ImplenNP80
OneTaq DNA 聚合酶NEBM0480
PCR 管VWR20170-012
苯丙氨酸FormediumDOC0170
磷酸烯醇式丙酮酸Sigma （Roche）10108294
氨酸钾SigmaG1501
草酸钾Fisher ScientificP273
脯氨酸FormediumDOC0174
PutreswineSigmaP5780
丝氨酸Formedium DOC0178
亚精胺SigmaS0266
T4 DNA 连接酶NEBM0202S
T4DNA 连接酶反应缓冲液NEBB0202S随 T4 DNA 连接酶
TempliPhi 扩增试剂盒Cytiva25640010用于 RCA
热循环仪BioradC1000 Touch
ThermoblockEppendorfThermoMixer FP
苏氨酸FormediumDOC0182
氨酸Formedium
酪氨酸中DOC0190
UMPSigmaU6375
缬氨酸DOC0194
酰胺 ， ， 基因， DOC0138 中 谷提供 色DOC0186 中

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978(2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Det....

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重印与许可

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标签

DNA PCR DNA DNA

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