快速、基于酶促反应的方法：利用无细胞系统对微量线性模板进行扩增以实现蛋白质原型构建

摘要

本研究描述了一种无需克隆或使用活细胞，即可从合成基因片段制备大量（µg至mg级）DNA用于蛋白质筛选实验的方案。该方法首先对最小模板进行酶切消化并环化，随后通过等温滚环扩增进行扩增。扩增产物无需纯化即可直接用于无细胞表达反应。

摘要

本方案描述了一种最小DNA模板的设计及其酶促扩增步骤，可在24小时内利用无细胞表达系统快速构建可检测的蛋白质。从供应商获得DNA后，基因片段通过PCR扩增、切割、环化并进行冷冻保存。取少量保存的DNA稀释后，利用等温滚环扩增（RCA）技术进行显著扩增（最高可达10⁶倍）。RCA技术可从皮克级起始材料中获得微克级的最小表达模板（若使用全部合成片段作为起始材料，则可达到毫克级）。在本研究中，20 pg的起始量最终获得了4 µg的产物。所得RCA产物（即最小模板的串联体）可直接加入无细胞反应体系，无需纯化步骤。由于该方法完全基于PCR技术，未来若与自动化液体处理系统结合，可能适用于高通量筛选研究。

引言

无细胞基因表达（CFE）作为一种功能强大的工具，已广泛应用于多个领域，包括疾病检测^1,2,3,4,5,6、微量营养素和小分子检测^{7,8,9,10,11,12}、生物制造^{13,14,15,16,17,}

方案

1. 设计基因片段

注意：基因片段应包含转录/翻译所需的所有必要遗传元件，包括启动子、核糖体结合位点（RBS）、起始密码子、目的基因和终止子。虽然在线性表达模板（LET）中终止子并非必需，但如果用户决定将序列插入质粒，则终止子将非常重要。这些序列来源于pJL1-sfGFP质粒⁵⁵（由Michael Jewett实验室惠赠），该质粒使用T7启动子。除上述必要遗传元件外，在启动子上游6个碱基处（5'切割位点）和终止子下游6个碱基处（3'切割位点）分别添加一个限制性内切酶识别位点，本例中使用HindIII（也可使用其他限制性内切酶，但建议使用一种高保真限制性内切酶对序列进行标准化，以减少文库中需保存的酶种类）。引物结合位点则分别添加在5'切割位点上游10个碱基和3'切割位点下游10个碱基处，本例中采用标准化的M13引物序列（引物为价格低廉的常规库存试剂）。所用限制性内切酶识别位点和引物序列由用户自行决定，但必须确保这些序列在模板其他位置不存在（避免产生非预期的切割位点或扩增起始位点）。本研究所用模板的具体序列详见补充材料。以下步骤均基于此基础模板进行修改。

1. 确定目标表达基因，并获取其氨基酸序列或已在E. coli中表达的遗传序列。
2. 若为氨基酸序列，使用多种常用供应商工具之一对E. coli进行密码子优化⁵⁶。....

结果

使用0.30 µL未纯化的RCA DNA在15 µL反应体系中，RCA模板表达sfGFP的水平与pJL1质粒相当（图2A）。事实上，在BL21 DE3 Star提取物中，将模板用量增加至两倍或三倍并未带来进一步提升，表明每反应0.30 µL模板量已达到饱和。相反，当使用来自SHuffle菌株的细胞提取物时，增加RCA模板用量则显示出一定优势（图2B）²⁸。对于某些蛋白质，可在极短时间内观察到结果，从而使整个工作流程（扩增与检测）缩短至24小时以内。然而，部分蛋白质需要较低温度或具有较慢的折叠速率，这将延长获得结果所需的时间，但不会影响本文所述的工作流程。这一点在表达枯草杆菌蛋白酶（SBT(n)）时可以观察到：表达4小时后进行检测，尚不足以完成SBT(n)的成熟过程（图3A，失败结果示例）。将反应时间延长至16小时，则可检测到SBT(n)的表达水平（图3<.......

讨论

目的基因可以是任何目标蛋白，但对于初次使用该方法的研究者而言，最好选择荧光蛋白作为报告基因，以便在酶标仪上进行实时或终点检测。对于新的蛋白序列，复制目标蛋白的氨基酸序列，并将其粘贴至合适的密码子优化工具^61,62中。密码子优化工具中通常提供多种大肠杆菌（E. coli）的菌株和种类选项，但选择通用的埃希氏菌属大肠杆菌（Escherichia coli）选项即可满足需求。优化完成后，需仔细检查基因序列，确保先前选定的酶切位点和引物序列不再存在于其中。若仍存在，可重新进行优化直至这些序列消失。在某些情况下，若多次优化后仍出现内部的HindIII酶切位点，则可能需要更换为其他限制性酶切位点。为保持实验流程的标准化并降低同时储备多种限制性内切酶的成本，应尽可能使用相同的酶切位点。

在开始扩增之前，选择最适合长片段末端转座子（LET）的PCR试剂盒。长度小于<1,000个碱基对的LET可使用普通的Taq DNA聚合酶进行扩增，而长度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙氨酸	Formedium	DOC0102
谷氨酸铵	MP Biomedicals	MP21805951
精氨酸	Formedium	DOC0106
天冬酰胺	Formedium	DOC0114
天冬氨酸	Formedium	DOC0118
ATP	Sigma	A2383
Axygen 封口膜	Corning	PCR-SP
CMP	Sigma	C1006
辅酶 A	Sigma	C3144
CutSmart 缓冲液	NEB	B7204S	随 HindIII 提供
半胱氨酸	Formedium	DOC0122
DNA 纯化浓缩试剂盒	Zymo Research	D4004	用于纯化 DNA
dNTPs	NEB	N0447
大肠杆菌 tRNA	Sigma (Roche)	10109541001
亚叶酸	Sigma	47612
基因片段	IDT
谷氨酸	Formedium	DOC0134
谷氨酰胺	Formedium	DOC0130
甘氨酸	Formedium	DOC0138
GMP	Sigma	G8377
HEPES	Sigma	H3375
HindIII-HF	NEB	R3104L
组氨酸	Formedium	DOC0142
异亮氨酸	Formedium	DOC0150
亮氨酸	Formedium	DOC0154
赖氨酸	Formedium	DOC0158
谷氨酸镁	Sigma	49605
甲硫氨酸	Formedium	DOC0166
微量滴定板（384 孔）	Greiner	781906
微量滴定板（96 孔）	Greiner	655809
多功能酶标仪	BioTek	Synergy Neo2
NAD	Sigma	N8535
NanoPhotometer	Implen	NP80
OneTaq DNA 聚合酶	NEB	M0480
PCR 管	VWR	20170-012
苯丙氨酸	Formedium	DOC0170
磷酸烯醇式丙酮酸	Sigma (Roche)	10108294
谷氨酸钾	Sigma	G1501
草酸钾	Fisher Scientific	P273
脯氨酸	Formedium	DOC0174
腐胺	Sigma	P5780
丝氨酸	Formedium	DOC0178
亚精胺	Sigma	S0266
T4 DNA 连接酶	NEB	M0202S
T4 DNA 连接酶反应缓冲液	NEB	B0202S	随 T4 DNA 连接酶提供
TempliPhi 扩增试剂盒	Cytiva	25640010	用于 RCA
PCR 仪	Biorad	C1000 Touch
恒温混匀仪	Eppendorf	ThermoMixer FP
苏氨酸	Formedium	DOC0182
色氨酸	Formedium	DOC0186
酪氨酸	Formedium	DOC0190
UMP	Sigma	U6375
缬氨酸	Formedium	DOC0194