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方法文章

快速、基于酶促反应的方法：利用无细胞系统对微量线性模板进行扩增以实现蛋白质原型构建

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DOI：

10.3791/62728

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2021年6月14日

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

本文内容

摘要

本研究描述了一种无需克隆或使用活细胞，即可从合成基因片段制备大量（µg至mg级）DNA用于蛋白质筛选实验的方案。该方法首先对最小模板进行酶切消化并环化，随后通过等温滚环扩增进行扩增。扩增产物无需纯化即可直接用于无细胞表达反应。

摘要

本方案描述了一种最小DNA模板的设计及其酶促扩增步骤，可在24小时内利用无细胞表达系统快速构建可检测的蛋白质。从供应商获得DNA后，基因片段通过PCR扩增、切割、环化并进行冷冻保存。取少量保存的DNA稀释后，利用等温滚环扩增（RCA）技术进行显著扩增（最高可达106倍）。RCA技术可从皮克级起始材料中获得微克级的最小表达模板（若使用全部合成片段作为起始材料，则可达到毫克级）。在本研究中，20 pg的起始量最终获得了4 µg的产物。所得RCA产物（即最小模板的串联体）可直接加入无细胞反应体系，无需纯化步骤。由于该方法完全基于PCR技术，未来若与自动化液体处理系统结合，可能适用于高通量筛选研究。

引言

无细胞基因表达（CFE）作为一种功能强大的工具，已广泛应用于多个领域，包括疾病检测1,2,3,4,5,6、微量营养素和小分子检测7,8,9,10,11,12、生物制造13,14,15,16,17,18、教育19,20,21、难表达蛋白的生产17,22,23,24,25,26,27以及变异体筛选23,28,29,30,31,32,33。这得益于无细胞系统的开放性及其所提供的灵活性。许多优秀的综述文章对该技术的历史发展和未来前景进行了深入阐述34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44。

一个典型的无细胞反应包含三个主要组分：细胞提取物、能量混合物和遗传模板。活性细胞提取物含有转录与翻译（TXTL）所需的所有必要分子机器，可通过多种方式制备36。能量混合物中的糖酵解中间产物、电解质、氨基酸和辅因子可支持TXTL过程。它是无细胞实验中变异性的主要来源45，并且可通过多种方法配制34,46。自传统克隆方法已能产生表达特性优良的质粒以来，遗传模板的制备技术进展较少。这些传统方法的缺点在于构建和扩增所需的时间周期较长，且需要较多的生物学专业知识。近年来的优化工作已实现了可在24小时内完成的细胞提取物制备流程47,48，该流程可与能量混合物的制备并行进行49,50。然而，传统克隆仍会使无细胞表达（CFE）原型构建的时间延长数天（表1）23。来自商业基因片段的PCR扩增产物可直接使用51，但这种方法限制了原型实验的次数，因为仅能产生1 µg DNA，相当于约五次反应（传统15 µL体系）。通过增加环化和等温扩增步骤，可获得毫克级以上的DNA产量（1 mg DNA约可支持5,000次反应）。这显著增加了可用于高通量蛋白筛选或组合酶网络研究（无细胞代谢工程）的实验数量；同时也使得线性模板文库能够以高浓度DNA形式有效保存。此外，对于材料科学应用中所需大量蛋白的原型构建（如基于蛋白的纤维和水凝胶），也需要更高量的模板。某些线性模板的局限性可通过使用BL21 DE3 Star菌株提取物或采用近期发现的保护线性模板免于降解的方法加以克服52,53,54。然而，这些方法并未解决商业来源的DNA用于PCR扩增时库存有限的问题，也未解决克隆过程中所需的生物学专业知识和设备问题。

本研究介绍了一种专门设计的实验方案，旨在从商业公司提供的少量基因片段（通常为500–1000 ng的冻干粉末）中获得更多的表达模板。该方法无需进行传统质粒克隆或在活细胞中转化与扩增所需的技能。用户在收到邮寄的基因片段后，可通过等温滚环扩增（RCA）技术（图1）23，制备出足够用于多次无细胞反应的模板。尽管从供应商处获得的DNA量可能足以进行有限的筛选实验，但其消耗迅速，重新购买基因片段既耗时又昂贵。此外，该方法特别适用于在E. coli中具有毒性且难以克隆的基因。

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方案

1. 设计基因片段

注意：基因片段应包含转录/翻译所需的所有必要遗传元件，包括启动子、核糖体结合位点（RBS）、起始密码子、目的基因和终止子。虽然在线性表达模板（LET）中终止子并非必需，但如果用户决定将序列插入质粒，则终止子将非常重要。这些序列来源于pJL1-sfGFP质粒55（由Michael Jewett实验室惠赠），该质粒使用T7启动子。除上述必要遗传元件外，在启动子上游6个碱基处（5'切割位点）和终止子下游6个碱基处（3'切割位点）分别添加一个限制性内切酶识别位点，本例中使用HindIII（也可使用其他限制性内切酶，但建议使用一种高保真限制性内切酶对序列进行标准化，以减少文库中需保存的酶种类）。引物结合位点则分别添加在5'切割位点上游10个碱基和3'切割位点下游10个碱基处，本例中采用标准化的M13引物序列（引物为价格低廉的常规库存试剂）。所用限制性内切酶识别位点和引物序列由用户自行决定，但必须确保这些序列在模板其他位置不存在（避免产生非预期的切割位点或扩增起始位点）。本研究所用模板的具体序列详见补充材料。以下步骤均基于此基础模板进行修改。

  1. 确定目标表达基因，并获取其氨基酸序列或已在E. coli中表达的遗传序列。
  2. 若为氨基酸序列，使用多种常用供应商工具之一对E. coli进行密码子优化56。若使用补充材料中提供的模板，请确保优化后的序列不含HindIII限制性酶切位点（AAGCTT）。如果存在该位点，需继续优化序列，直至消除HindIII位点。
  3. 将序列复制并粘贴至补充序列 #1模板中指定的目标基因位置。若表达sfGFP，请直接使用补充序列 #1；若表达枯草杆菌蛋白酶（subtilisin），请直接使用补充序列 #2。
  4. 向首选的DNA合成服务公司订购最小模板及所需引物。

2. 基因片段和引物的重悬

注意：收到基因片段后，请遵循制造商提供的复溶说明，或使用本简易指南制备DNA储备液。

  1. 离心试管（300 × g，5 秒），使 DNA 沉淀聚集于管底。
  2. 加入重蒸水（ddH2O），将 DNA 模板的终浓度调节至 10 ng/µL。
  3. 在中等强度下涡旋振荡溶液 5–10 秒。
  4. 通过在 50 °C 下孵育 20 分钟，使整个沉淀完全溶解。
  5. 再次短暂涡旋振荡
  6. 以 300 × g 离心 5 秒，使溶液聚集于管底。
  7. 将样品置于 -20 °C 保存或直接用于 PCR。
  8. 通过将引物溶解于无核酸酶的水中，配制 100 µM 的引物储备液。确定所需加水量的方法：将冻干引物的纳米摩尔数乘以 10。例如，若管中含有 45 nmol 冻干引物，则加入 450 µL 的 ddH2O，并涡旋振荡溶液。
  9. 将引物储备液于 -20 °C 保存，或继续进行扩增反应。

3. 通过 PCR 扩增基因片段

注意：根据目标基因选择合适的 PCR 试剂盒。较小的基因（<1,000 kb）可能更适合使用成本较低的 Taq 聚合酶，而较大的基因（≥1,000 kb）则可能受益于高保真聚合酶以减少扩增错误。需要注意的是，如果用户不关心保留初始基因片段，则最初的 PCR 扩增步骤并非必需（该步骤可提供多次环化尝试的机会，并允许对 LET 与 RCA 产物进行比较研究）。还需注意，此 PCR 扩增得到的 LET 可直接用于后续反应；然而，如引言中所述，若省略进一步的扩增步骤，则仅能支持有限次数的反应。可在重悬的基因片段上直接进行酶切与连接反应57（前提是确定无需更多 LET 来制备额外的环化储备样本）。若采用此方案，请跳过第 3 节，直接进入第 4 节。如需进行 PCR，请遵循以下步骤。

  1. 使用步骤 2.8 中的 100 µM 储存液配制 10 µM 的工作液。许多 PCR 试剂盒要求引物浓度为 10 µM。
  2. 按照试剂盒生产商的说明书设置热循环仪的反应程序。不同试剂盒所需的循环参数略有差异。对于 材料表 中列出的试剂盒，反应条件如下：94 °C 预变性 30 秒；进行 30 个循环，每个循环包括 94 °C 变性 30 秒、45 °C 引物退火 30 秒和 68 °C 延伸 60 秒；最后在 68 °C 下终延伸 5 分钟；最终在 10 °C 下无限期保存。
    1. 确保选择正确的延伸时间（根据待扩增基因长度而变化）。每 1,000 bp 设置 1 分钟的延伸时间。
    2. 确保输入引物的正确退火温度。使用可同时输入两条引物的在线 Tm 计算器来确定最佳退火温度58。使用 M13 引物时，45 °C 的退火温度已足够。
    3. 确定循环次数时，请参考生产商说明书，但通常 30 个循环即可获得足够的扩增产物。
  3. 若进行 PCR，需将 dNTPs 解冻并涡旋混匀。使用试剂盒中提供的 PCR 缓冲液。
  4. 在一个 PCR 管中，按照生产商说明书指示加入所有试剂组分。为确保扩增成功，加入 1 µL 重悬的 DNA 储存液（步骤 2.6）。
  5. 在中等速度下涡旋 5–10 秒以轻柔混匀反应体系。或者，通过移液器将反应液体积的一半上下吹打 10–20 次以实现混匀。
  6. 进行 PCR 反应。
  7. 如果 PCR 程序未包含最终冷却步骤，在取出反应管前于 10 °C 冷却 5 分钟，以使冷凝液聚集至管底。
  8. 按照供应商说明书，使用 PCR 产物纯化试剂盒对反应产物进行纯化。
    1. 在 1.5 mL 离心管中，按 5:1 的比例分别加入 DNA 结合缓冲液和 PCR 样品。
    2. 将该混合液转移至离心柱中，在 16,000 x g 下离心 1 分钟，弃去穿流液。
    3. 向柱中加入 200 µL DNA 洗涤缓冲液，在室温下孵育 1 分钟。
    4. 在 16,000 x g 下离心 1 分钟，弃去穿流液。
    5. 重复步骤 2.8.3 和 2.8.4，但省略 1 分钟孵育步骤。
    6. 在 16,000 x g 下额外离心 1–2 分钟，以去除残留缓冲液。
    7. 用 46 µL ddH2O 洗脱 DNA。
  9. 使用分光光度计对纯化后的 DNA 进行定量。
  10. 将纯化后的 DNA 储存于 -20 °C，或直接进行下一步操作。

4. 消化与环化

注意：可通过将 DNA 环化后进行滚环扩增（RCA）来实现进一步扩增。消化 DNA 以制备用于环化的模板，这将去除引物序列，并在模板的 5' 和 3' 末端产生黏性末端。通过连接反应重新连接这些末端。

  1. 在PCR管中，加入5 µL所需的缓冲液、20 U的HindIII以及45 µL步骤3.8中纯化的DNA。
  2. 用移液器轻轻混匀该混合物。
  3. 将混合物置于热循环仪中，在37 °C下孵育15分钟。
  4. 在80 °C下孵育20分钟，使HindIII热失活。
  5. 将反应体系冷却至10 °C后再取出，以促使冷凝液聚集于管底。
  6. 向新消化的DNA中加入5 µL T4连接酶缓冲液和800 U T4连接酶。
    1. 如需要，可使用T7连接酶。
  7. 用移液器轻轻混匀该混合物。
  8. 在25 °C下孵育1小时，以完成环化反应。
  9. 使用PCR纯化试剂盒按照供应商说明书纯化反应产物。采用与步骤3.8中相同的方案。
  10. 使用分光光度计对DNA进行定量，预期浓度约为20 ng/µL。
  11. 在-20 °C下保存或直接进行下一步操作。

5. 等温滚环扩增

注意：滚环扩增（RCA）可使用商业试剂盒或单独购买的组分进行。遵循制造商的说明书可确保扩增成功。试剂盒通常包含样本缓冲液、反应缓冲液以及具有链置换活性的聚合酶（如φ29聚合酶）。可将多个反应管合并，以从少量起始材料（20 pg）获得大量DNA用于无细胞表达（4 µg）。以下方案操作高效。

  1. 在单个离心管中，加入 20 µL 样品缓冲液、20 µL 反应缓冲液、0.8 µL 酶和来自步骤 4.9 的 1 µL 环状表达模板（CET）。
    注意：总 DNA 质量约为 20 ng，但滚环扩增（RCA）可在皮克量级下进行，因此在高通量筛选需要大量材料时，可对 CET 进行稀释并实现极强的酶促扩增。
  2. 用移液器混匀混合物，并将 10 µL 混合液分装至四个独立的离心管中。
  3. 在 30 °C 下孵育 4–18 小时。
  4. 在 65 °C 下孵育 10 分钟以热失活酶，随后将温度降至 12 °C 并维持 5 分钟，以促进液体在管底冷凝。
    注意：将所有温度步骤整合到一台热循环仪的自动化程序中操作最为简便。
  5. 向每管中加入 15 µL ddH2O，稀释所得溶液。
  6. 合并所有管中的溶液，并直接加入无细胞反应体系中。
  7. 如需要，可使用 PCR 产物纯化试剂盒对产物进行纯化，并用 36 µL ddH2O 洗脱以定量。确保模板浓度约为 100 ng/µL。

6. 无细胞反应

注意：通过将能量缓冲液、提取物和RCA模板混合来进行无细胞表达。使用PANOx-SP能量缓冲液的典型无细胞反应体系包含1.2 mM ATP、每种GMP、UMP和CMP各0.85 mM、30 mM磷酸烯醇式丙酮酸、130 mM谷氨酸钾、10 mM谷氨酸铵、12 mM谷氨酸镁、1.5 mM亚精胺、1 mM腐胺、34 µg/mL亚叶酸、171 µg/mL E. coli tRNA混合物、20种未标记氨基酸各2 mM、0.33 mM NAD、0.27 mM辅酶A（CoA）、4 mM草酸钾、57 mM HEPES-KOH缓冲液（pH 7.5）、0.24%体积的E. coli提取物，以及不同量的DNA23,49。反应体积可调整，但采用15 µL反应体系可节省试剂用量，并且体积足够小，适用于384孔黑色壁微孔板49,50。

  1. 若表达荧光蛋白（如 sfGFP），请设置酶标仪以读取所需的激发/发射波长、温度和振荡条件。
  2. 若使用 384 孔板，在空样品孔周围的孔中加入 60 µL H2O，以维持湿度并减少边缘效应。
  3. 将各样品所需的各种组分加入试管中。加入量应足以进行三份重复。板内重复有助于识别变异来源。
    1. 依次加入提取物、能量缓冲液，然后加入 DNA。
    2. 用 ddH2O 稀释至最终所需体积。
  4. 通过移液枪将溶液总体积的一半上下吹打 10–20 次，充分混匀该溶液。
  5. 将反应混合物以每份 15 µL 分装至微孔板中所需的孔位。
  6. 用无色密封膜密封板，以保持湿度并防止蒸发。
  7. 将密封后的板放入酶标仪中，使反应完成。
    1. 若表达的蛋白无法实时监测，则使用其他温控设备（如金属浴）孵育该板。

7. 枯草杆菌蛋白酶检测

注意：如果在补充序列 #2中表达枯草蛋白酶 BPN'（SBT(n)）基因，请按照本方案检测其活性。

  1. 用二甲基甲酰胺（DMF）配制10 µM的N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺底物储备液。
  2. 将酶标仪设置为在25 °C条件下，每20秒测量一次410 nm处的吸光度，持续10分钟。
  3. 在平底无色96孔板中，加入94 µL的ddH2O和1 µL来自步骤7.1的N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺底物溶液。
  4. 加入5 µL来自步骤6.7的终末无细胞反应液，并使用按照步骤7.2所述程序设定的酶标仪进行读数。

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结果

使用0.30 µL未纯化的RCA DNA在15 µL反应体系中，RCA模板表达sfGFP的水平与pJL1质粒相当（图2A）。事实上，在BL21 DE3 Star提取物中，将模板用量增加至两倍或三倍并未带来进一步提升，表明每反应0.30 µL模板量已达到饱和。相反，当使用来自SHuffle菌株的细胞提取物时，增加RCA模板用量则显示出一定优势（图2B）28。对于某些蛋白质，可在极短时间内观察到结果，从而使整个工作流程（扩增与检测）缩短至24小时以内。然而，部分蛋白质需要较低温度或具有较慢的折叠速率，这将延长获得结果所需的时间，但不会影响本文所述的工作流程。这一点在表达枯草杆菌蛋白酶（SBT(n)）时可以观察到：表达4小时后进行检测，尚不足以完成SBT(n)的成熟过程（图3A，失败结果示例）。将反应时间延长至16小时，则可检测到SBT(n)的表达水平（图3<...

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讨论

目的基因可以是任何目标蛋白，但对于初次使用该方法的研究者而言，最好选择荧光蛋白作为报告基因，以便在酶标仪上进行实时或终点检测。对于新的蛋白序列，复制目标蛋白的氨基酸序列，并将其粘贴至合适的密码子优化工具61,62中。密码子优化工具中通常提供多种大肠杆菌（E. coli）的菌株和种类选项，但选择通用的埃希氏菌属大肠杆菌（Escherichia coli）选项即可满足需求。优化完成后，需仔细检查基因序列，确保先前选定的酶切位点和引物序列不再存在于其中。若仍存在，可重新进行优化直至这些序列消失。在某些情况下，若多次优化后仍出现内部的HindIII酶切位点，则可能需要更换为其他限制性酶切位点。为保持实验流程的标准化并降低同时储备多种限制性内切酶的成本，应尽可能使用相同的酶切位点。

在开始扩增之前，选择最适合长片段末端转座子（LET）的PCR试剂盒。长度小于<1,000个碱基对的LET可使用普通的Taq DNA聚合酶进行扩增，而长度...

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披露

Nigel Reuel 任职于 BigHat Biosciences Inc. 的科学顾问委员会，该公司利用无细胞系统进行抗体设计。

致谢

作者感谢 NIH 1R35GM138265-01 和 NSF 2029532 对本项目的部分资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙氨酸FormediumDOC0102
谷氨酸铵MP BiomedicalsMP21805951
精氨酸FormediumDOC0106
天冬酰胺FormediumDOC0114
天冬氨酸FormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen 封口膜CorningPCR-SP
CMPSigmaC1006
辅酶 ASigmaC3144
CutSmart 缓冲液NEBB7204S随 HindIII 提供
半胱氨酸FormediumDOC0122
DNA 纯化浓缩试剂盒Zymo ResearchD4004用于纯化 DNA
dNTPsNEBN0447
大肠杆菌 tRNASigma (Roche)10109541001
亚叶酸Sigma47612
基因片段IDT
谷氨酸FormediumDOC0134
谷氨酰胺FormediumDOC0130
甘氨酸FormediumDOC0138
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
组氨酸FormediumDOC0142
异亮氨酸FormediumDOC0150
亮氨酸FormediumDOC0154
赖氨酸FormediumDOC0158
谷氨酸镁Sigma49605
甲硫氨酸FormediumDOC0166
微量滴定板（384 孔）Greiner781906
微量滴定板（96 孔）Greiner655809
多功能酶标仪BioTekSynergy Neo2
NADSigmaN8535
NanoPhotometerImplenNP80
OneTaq DNA 聚合酶NEBM0480
PCR 管VWR20170-012
苯丙氨酸FormediumDOC0170
磷酸烯醇式丙酮酸Sigma (Roche)10108294
谷氨酸钾SigmaG1501
草酸钾Fisher ScientificP273
脯氨酸FormediumDOC0174
腐胺SigmaP5780
丝氨酸FormediumDOC0178
亚精胺SigmaS0266
T4 DNA 连接酶NEBM0202S
T4 DNA 连接酶反应缓冲液NEBB0202S随 T4 DNA 连接酶提供
TempliPhi 扩增试剂盒Cytiva25640010用于 RCA
PCR 仪BioradC1000 Touch
恒温混匀仪EppendorfThermoMixer FP
苏氨酸FormediumDOC0182
色氨酸FormediumDOC0186
酪氨酸FormediumDOC0190
UMPSigmaU6375
缬氨酸FormediumDOC0194

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