本文介绍了一种定量分析并生成间充质干细胞（MSC）介导的巨噬细胞（MΦ）对非调理酵母（酵母聚糖）颗粒吞噬作用动态图像的实验方案，其中酵母聚糖颗粒与一种pH敏感型荧光分子偶联。
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摘要
摘要
间充质干细胞（MSC）传统上因其再生特性而被研究，但近年来，其免疫调节特性成为研究焦点。MSC可与免疫细胞相互作用并调节其活性。本研究的重点是MSC对巨噬细胞吞噬活性的调控作用。巨噬细胞（MΦ）的吞噬作用是先天免疫系统应对感染的重要组成部分，目前MSC调控该反应的机制正处于积极研究之中。本文介绍一种在MSC共培养条件下研究MΦ对未调理酵母聚糖颗粒吞噬作用的方法，其中酵母聚糖颗粒与一种pH敏感的荧光分子偶联。随着吞噬活性增强，标记的酵母聚糖颗粒被包裹进入酸性吞噬溶酶体环境中，pH敏感荧光分子的荧光强度随之增强。通过选择适当的激发和发射波长，利用荧光分光光度计测定吞噬活性，并在70分钟内以相对荧光单位的变化呈现动力学数据。为支持该定量结果，采用动态成像技术对吞噬活性的变化进行可视化观察。使用该方法获得的结果表明，在与MSC共培养时，无论未经处理的幼稚MΦ还是经IFN-γ处理的MΦ，其对未调理酵母聚糖的吞噬活性均增强。这些数据进一步丰富了当前关于MSC调控先天免疫系统的认知。该方法可用于后续研究，以全面阐明其潜在的细胞与分子机制。 关键词：间充质干细胞，巨噬细胞，吞噬作用，酵母聚糖，pH敏感荧光，共培养，先天免疫，IFN-γ
引言
间充质干细胞（MSC）是一类可分化为结缔组织细胞的祖细胞。MSC存在于成年哺乳动物组织中，可从骨髓中分离获得1由于其免疫调节特性，这些细胞被广泛研究2早期研究主要关注间充质干细胞对T细胞的调控作用3,4,5,6 但近年来，它们对巨噬细胞（MΦ），作为先天免疫系统的主要细胞组分，受到越来越多的关注7,8,9,10,11,12,13,14. 间充质干细胞与巨噬细胞相互作用的重要性Φ 单核细胞/巨噬细胞在炎症性疾病治疗中的相互作用的重要性体现在：在动物模型中，耗竭单核细胞/巨噬细胞可消除间充质干细胞的治疗效果8此处，研究重点是间充质干细胞（MSC）与巨噬细胞（MΦ）之间的细胞接触相互作用。Φ. MSC 具有……的能力 调节MΦ的表型Φ 通过促进炎症反应向抗炎反应的转变，从而引发组织修复活动8,9,10,11，并且已开展大量工作以阐明这些调节机制。在其他情况下，MSC 可能支持或加剧一种 MΦ介导的炎症反应12,13 并增强MΦ 吞噬活性14,15然而，目前严重缺乏能够明确揭示间充质干细胞（MSC）调控巨噬细胞（MΦ）作用机制及作用条件的数据Φ 吞噬活性
MΦ 具有识别调理化（抗体或补体包被）或非调理化病原体的受体家族，从而介导吞噬作用16后者（巨噬细胞）的活化与活性研究尚不充分17. 在非炎症性 体外 环境，MSC 增强 MΦ 非调理病原体的吞噬作用13。然而，巨噬细胞对非调理病原体的识别由模式识别受体介导Φ 在适应性免疫反应期间，淋巴细胞产生的炎症环境可能导致其活性降低。IFN-γ，由自然杀伤细胞和效应淋巴细胞释放，对M具有抑制作用Φ 非调理颗粒的吞噬作用18建立了一种共培养模型，用于研究间充质干细胞（MSC）通过直接接触调控巨噬细胞（MΦ）吞噬活性的机制。Φ 吞噬作用。本实验的目的是确定间充质干细胞（MSC）是否能够调节巨噬细胞对非调理酵母聚糖颗粒的吞噬活性。 调节 MΦ 非调理病原体的吞噬作用在M之后Φ 已暴露于 IFN-γ (图1).
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方案
注意：所有培养基制备和细胞培养操作均须在生物安全柜内的层流环境下，以无菌条件进行。所述所有培养孵育步骤均须使用专门的孵育箱，维持 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的气体环境。
1. 细胞培养
- 生长培养基的制备
- 对于 MSC 和 LADMAC，向 500 mL 高糖 DMEM 中加入 50 mL FBS 和 5 mL 100x 抗生素/抗真菌素混合液。
- 对于巨噬细胞Φ加入50 mL胎牛血清、100 mL LADMAC条件培养基（按1.2节步骤制备）和5 mL 100倍抗生素混合液至500 mL高糖DMEM培养基中。
注意：LADMAC 细胞产生支持 MΦ 生长所必需的集落刺激因子（CSF-1）Φ 细胞
- LADMAC 条件培养基的制备
- 从冻存的LADMAC细胞中接种时，向五个T75 cm²培养瓶中各加入1.1节中的19 mL生长培养基。2 经细胞培养处理的培养瓶，放入细胞培养箱中孵育15分钟，以平衡至37 °C.
- 同时，快速解冻一份数量为10的 aliquot6 通过在37℃孵育解冻细胞 °C 水浴中孵育 2–3 分钟，或直至完全解冻。将细胞加入含有 9 mL 新鲜 MSC 生长培养基的 15 mL 或 50 mL 无菌锥形管中，于 125 × g 离心 g 在摆桶式转子中离心5分钟。
- 吸弃或倾倒上清液，加入5 mL新鲜培养基，轻轻吹打重悬细胞沉淀。
- 向五个 T75 cm² 培养瓶中每个加入 1 mL 细胞悬液2 使用无菌血清移液管将烧瓶中的内容物转移并放置 在细胞培养孵育箱中。
- 每2-3天添加10 mL培养基，持续7-10天。随后，使用无菌移液管将细胞和上清液收集至无菌50 mL锥形管中，在125 × g条件下离心 g 5 分钟。
- 将上清液与细胞沉淀分离，并使用0.2 μm滤膜对上清液进行无菌过滤。 µm 无菌一次性真空滤器单元。
- 从包装中取出抽吸装置组件，并使用真空管将其连接至抽吸泵。将上清液倒入上层腔室，然后盖上盖子。开启抽吸泵，使液体过滤至下层腔室。
- 使用移液器将样品分装至50 mL无菌锥形管中，于-20℃保存 °C.
- 为冻存细胞沉淀，将细胞重悬于冻存液中，密度为106 细胞/mL，置于冻存管中，随后放入-80 °C 冷冻箱。24 小时后，转移至液氮2 储存。
- 扩增细胞以备共培养
- 接种 MSC 和 MΦΦ 从冻存细胞中取出后，将第1.1节中配制的适量生长培养基各9 mL分别加入四种100 mm细胞培养处理皿中，每种细胞类型各设四皿，并置于细胞培养箱中平衡15分钟。
- 同时，快速解冻10的等分试样6 通过在37℃下孵育来解冻冻存细胞 °C 水浴中孵育 2–3 分钟，或直至完全解冻。随后，将解冻的 MSC 细胞加入 9 mL 新鲜的 MSC 增殖培养基中，并加入解冻的 MΦ 细胞加入9 mL新鲜MΦ 生长培养基置于15或50 mL无菌锥形管中，于125 × g离心 g 在摆动桶转子中离心5分钟。
- 吸弃或倾倒上清液，通过轻轻吹打将每份细胞沉淀重悬于4 mL相应的新鲜培养基中。将1 mL细胞悬液分别加入已在此前步骤1.3.1中完成平衡的四种细胞类型的四个100 mm培养皿中。
- 将培养皿连同细胞放回培养箱中，每2-3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%–80%。
2. 第1天在实验培养皿中接种MSC
注意：在接种间充质干细胞（MSC）之前，需设计好用于荧光分光光度法检测的96孔板布局以及用于动态成像的腔室载玻片布局。对于96孔板，实验孔周围应设置含有细胞但不用于检测的边缘孔。至少标记四个孔作为试剂空白对照（RBL）。96孔板布局示例见表1，4孔腔室载玻片布局示例见表2。建议使用底部透明的黑色或白色96孔板。1.5 mm硼硅酸盐玻璃材质的腔室载玻片为最佳选择，但腔室数量可根据实验设计进行调整。后续方法的流程图总结见图2。
- 当细胞融合度达到70%–80%时，吸除100 mm培养皿中的生长培养基，并加入5 mL PBS以悬浮间充质干细胞（MSC）。
- 吸弃 PBS，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA，置于培养箱中孵育 3–5 分钟。
- 3分钟后，使用倒置显微镜检查细胞脱落情况。若细胞已脱落，则继续下一步操作；若未脱落，继续孵育1-2分钟。孵育时间不得超过5-6分钟。
- 向含有脱离细胞的培养皿中加入5 mL新鲜培养基。用胰蛋白酶/培养基混合液冲洗培养皿，并使用无菌移液管将细胞收集至一个洁净、无菌的50 mL锥形管中。
- 离心5分钟，125 × g g吸弃上清液，然后用移液器轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于10 mL新鲜培养基中。
- 计数细胞时，加入10 µ细胞悬液的 L 加至 30 µ0.4% 台盼蓝溶液 1.5 mL 于微量离心管中，随后用移液器吸取 10 µ在血细胞计数板盖玻片下加入混合液 L。
- 使用倒置或明场显微镜，以10倍物镜对四个1 mm2 方格。使用公式计算细胞数量：细胞数/mL = 细胞计数 / # 1 mm2 平方 × 稀释倍数 × 104.
注意：本示例中，1 mm2 计数的方格数为四个，稀释倍数为4。 - 使用公式 C1V1 = C2V2 用于计算并配制 1 × 105 每毫升细胞悬液。根据板的设计，每填充一块96孔板的一个纵列需准备1毫升细胞悬液，每填充一个4孔板的一个孔需准备0.75毫升细胞悬液。
注意：C1 = 细胞计数，V1 = 正在计算的内容，C2 = 1 × 105，V2 = 5.50 mL - 测定 V1，从所需的总体积5.50 mL中减去该体积，以确定制备悬浮液所需的新鲜培养基体积。加入细胞体积（V1) 从原始悬液转移至新鲜培养基中，总体积为 5.50 mL，含 1 x 105 细胞/mL
- 加入100 µL of 1 × 105 将细胞/mL悬液按照96孔板的设计，使用多通道微量移液器加入至每孔中，并加入530 µ使用微量移液器根据板的设计向腔室载玻片的每个孔中加入 L。孵育过夜。
注意：本实验中，MSC 接种于96孔板的第1、2、3和6列中（表1）以及4孔板玻片的第1和第2孔（表2). 因此，至少需要 5.50 mL 的 1 × 105 细胞/mL 悬液制备。MΦ 在达到80%汇合度时，同日用炎症介质处理MSC 接种于实验用培养板中。
3. 用 IFN-γ 激活 MΦ，第 1 天
- 准备活化培养基和 IFN-γ 储存液。
- 配制 200 mL 活化培养基：将 40 mg BSA 加入 200 mL 无血清高糖 DMEM 中，并使用 0.2 µm 无菌一次性真空滤器进行无菌过滤。
- 配制 0.1% BSA/PBS：将 20 mg BSA 加入 20 mL PBS 中，涡旋振荡至溶解。使用 0.2 µm 无菌注射器滤器过滤至洁净无菌的 50 mL 锥形管中。
- 将 1 mL 无菌的 0.1% BSA/PBS 溶液加入 100 µg 冻干 IFN-γ 中，配制成浓度为 100 µg/mL 的储存液。分装为 50 µL 每份，于 -20 °C 保存。
- 用 IFN-γ 活化 MΦ
- 每需要 1 mL 培养基，加入 2.5 µL 浓度为 100 µg/mL 的 IFN-γ 储存液。每活化一个 100 mm 培养皿，需准备 10 mL 含 IFN-γ（终浓度为 250 ng/mL）的活化培养基。
- 吸除 MΦ 培养物中的生长培养基，更换为 5 mL 不含 IFN-γ 的活化培养基进行冲洗。
- 吸除冲洗用培养基，实验组培养皿中加入 10 mL 含 IFN-γ 的活化培养基，对照组中加入 10 mL 不含 IFN-γ 的活化培养基。将细胞培养物在 37°C 孵育 16–24 小时。
4. 分离MΦΦ 并准备共培养体系，第2天
- 移除MΦ细胞中的激活培养基，并加入5 mL新鲜生长培养基。用细胞刮轻轻刮取细胞，收集至50 mL锥形管中。
- 采用与MSC计数相同的方法（步骤2.6–2.7所述），通过台盼蓝排斥法和血细胞计数板进行细胞计数。
- 根据步骤2.8–2.9中的公式，分别制备两种浓度为2 × 105 个细胞/mL的细胞悬液，一种来自对照组MΦ培养物，另一种来自处理组MΦ培养物。
注意：根据实验板设计，每填充一列96孔板需准备1 mL细胞悬液，每填充一个4孔板腔室需准备0.75 mL细胞悬液。 - 轻轻吸除含MSC的96孔板实验孔中的培养基，使用多通道移液器根据板设计向相应的实验孔中加入100 µL处理组和对照组MΦ细胞悬液（有或无MSC）。于培养箱中孵育过夜。
- 轻轻吸除含MSC的4孔腔室载玻片中的培养基，使用移液器根据实验设计向相应孔中加入530 µL MΦ细胞悬液。于培养箱中孵育过夜。
5. 吞噬作用检测，动力学荧光96孔板读数，第3天
- 设置实验参数
- 在实验当天，打开荧光酶标仪，并通过计算机将系统温度设定为 37 °C。
- 启动系统 Pro 软件，检查左上角的仪器图标，确认仪器是否已与计算机连接。如果显示带斜线的红色圆圈，请点击仪器图标，并在弹出窗口中选择相应仪器以建立连接。
- 选择新建实验，进入板设置助手弹出窗口。在板设置助手菜单中，选择配置采集设置。
- 在设置菜单中选择单色器作为光学配置，读取模式选择FL（荧光），读取类型选择动力学。
- 在同一配置窗口中，点击类别下的波长，将激发和发射带宽分别设置为 9 nm 和 15 nm。
- 将波长对数量设置为 1，将LM1的激发波长设为 510 nm，发射波长设为 540 nm。
- 继续浏览其他类别，接下来选择板类型，并选择与所用板类型匹配的选项。
注：所选板类型必须与实际使用的一致，系统将根据该选择自动设定读数高度。 - 接着选择读取区域，并高亮标记实验设计中使用的 96 孔板区域。
- 选择PMT 和光学元件，将 PMT 增益设为高，每次读数闪光次数设为6。若使用透明底板，请勾选从底部读取选项。
- 选择定时，设置为在 70 分钟内每 10 分钟读取一次。
- 选择振荡，勾选首次读取前，设定时间为 5 秒；勾选读取间隔，设定时间为 3 秒；将两次振荡的强度均设为低，模式设为线性。
- 关闭窗口。当板设置助手窗口再次弹出时，选择配置板布局。高亮标记板设计中的BL孔，然后点击板空白。
- 依次高亮每个实验组的行，点击添加，命名组别，并选择一种颜色。
- 在板设计下方的分配选项中，选择系列，然后在弹出窗口中定义系列并点击确定。对每组重复此操作。
- 制备酵母聚糖悬浮液
- 在等待系统温度升至 37 °C 的同时，将 1 mg 酵母聚糖颗粒重悬于 5 mL 活细胞成像培养基中。
- 向含有颗粒的小瓶中加入 1 mL 活细胞成像培养基，将颗粒收集至玻璃培养管中。再用额外 1 mL 成像溶液冲洗小瓶，并将冲洗液转移至同一玻璃管中，以确保所有颗粒均被转移。再加入 3 mL 成像溶液，最终获得浓度为 0.2 mg/mL 的颗粒悬浮液。
- 用涡旋振荡器快速脉冲振荡 30–60 秒，随后使用探头式超声仪进行 60 次快速超声处理。
注：必须制备均匀的颗粒悬浮液，且在加入实验孔前不宜长时间静置，因为颗粒会迅速重新聚集。根据所用巨噬细胞（MΦ）的来源、处理方式和密度，可能需要优化颗粒与细胞的比例。本研究中使用的是偶联标记的酵母聚糖颗粒，但也可使用偶联标记的E. coli和S. aureus颗粒。
- 在等待系统温度升至 37 °C 的同时，将 1 mg 酵母聚糖颗粒重悬于 5 mL 活细胞成像培养基中。
- 加入酵母聚糖并读取酶标板
- 吸除实验孔中的培养基，用 100 µL 活细胞成像溶液冲洗一次。同时用活细胞成像溶液冲洗 RBL 孔。
- 吸除实验孔和 RBL 孔中的活细胞成像溶液，每孔加入 100 µL 第 5.2 节中制备的酵母聚糖颗粒悬浮液。
- 通过触摸屏界面打开荧光酶标仪的板托盘，将酶标板（不加盖）放入托盘中，确保 A1 孔位于左上角。关闭托盘后，点击顶部菜单中的绿色读取按钮开始读数。
- 读数完成后，将文件保存至指定文件夹，并通过点击文件、选择导出，将数据以电子表格格式导出。
- 在电子表格（补充文件 1）中计算每个重复组在各时间点（10 分钟、20 分钟、30 分钟等）的平均相对荧光值及其标准误（± SEM），并将数据导入绘图软件。
- 采用折线图形式展示数据，并进行双因素方差分析（以时间和处理/间充质干细胞为因素），随后进行 Tukey 多重比较检验，以确定各组之间的差异。
注：在 96 孔板读数进行的同时，准备用于延时成像的动态成像板，并确保动态成像按顺序逐个分析实验孔。
6. 吞噬作用检测，动态成像，第3天
- 打开成像系统和计算机。双击以启动软件，选择Pro程序模式。
- 检查载物台区域，确保无样品存在且无任何物体阻碍载物台移动，然后点击Calibrate Now。
- 在右侧边栏的Incubation菜单下，勾选H Unit XL并将其设置为37 °C。
注意：在准备成像样品前，请等待孵育载物台温度接近设定值。 - 用750 µL成像培养基冲洗第一个实验孔，随后加入400 µL在5.2节中制备的非调理酵母聚糖颗粒悬液。其余各孔保持在生长培养基中。
注意：若颗粒悬液静置超过15分钟，可能需要再次短暂涡旋和超声处理。 - 将载玻片放置于成像系统的孵育载物台上，设置10分钟计时器。
- 使用成像软件，在Locate选项卡下选择Brightfield，然后点击下方系统配置窗口中的目镜图标。使用10倍物镜，通过目镜和调焦旋钮对细胞进行聚焦。
- 选择Acquisition选项卡，使用Experiment下拉菜单，选择包含EGFP滤光片的一组波长，以匹配pH敏感染料509 nm激发波长和533 nm发射波长。
- 当计时器剩余约2分钟时，通过点击物镜菜单中的20倍图标，在软件中将物镜切换至20倍。
- 点击Channels菜单，选择EGFP滤光片，并使用Exposure菜单将曝光时间设置为400 ms，以便检测pH敏感绿色荧光染料被包裹进吞噬溶酶体后的荧光信号。
- 点击Live，并使用调焦旋钮调整焦点。
- 点击Stop 关闭光源，并在顶部勾选Time-lapse实验设置。
- 在Focusing Strategy菜单中选择Software Autofocus。在Autofocus下拉菜单中选择Smart和Coarse设置，以减少自动对焦运行期间的光照暴露时间。
- 在Time-Lapse菜单中，将采集次数设置为30–60次，时间间隔设置为1分钟。
- 在设定好延时成像参数，并在向第一个实验孔中加入颗粒后满10分钟时，点击Start Experiment按钮开始采集。
- 完成第一个实验孔的采集后，对剩余的每个实验孔重复步骤6.4–6.12。
- 将所有实验文件以日期和参数命名后保存至指定文件夹。
- 关闭软件，重新以Processing模式打开软件，并通过Export菜单将文件导出为MP4格式。
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结果
计算各组在所有时间点的均值 ± 标准误（SEM）后，数据以折线图形式呈现，其中 Y 轴表示相对荧光强度，X 轴表示时间。补充文件 1 提供了以电子表格格式呈现的 96 孔板动力学读数原始数据示例。
本研究中，图3A 和 表3 所示的最佳结果表明：1）与间充质干细胞（MSC）共培养可增强巨噬细胞的吞噬活性；2）干扰素-γ（IFN-γ）处理会降低巨噬细胞的活性；3）与MSC共培养可部分恢复巨噬细胞（MΦ）的吞噬活性。在这些实验中，细胞最佳密度至关重要；当巨噬细胞接种密度过低时，无法检测到荧光强度的变化（图3B）。图3C 显示的是巨噬细胞接种密度过高时的实验数据，所有组别的荧光强度均迅速升高，导致组间差异无法分辨。动态成像视频证实，荧光强度的变化源于吞噬作用，而非培养基的酸化。此外，这些视频还提供了吞噬活性速率和程度的定性数据及可视化呈现（
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讨论
利用与pH敏感性染料偶联的生物颗粒分析吞噬作用是一种相对较新的技术，相较于传统的荧光标记颗粒具有明显优势12,19,20。使用传统荧光标记颗粒时，仅能进行终点分析。检测需在通过洗涤或淬灭未被吞噬细胞摄取的颗粒后，借助荧光显微镜和/或荧光分光光度法完成。由荧光分光光度法获得的定量数据可能受到未内化颗粒的干扰，而利用传统荧光显微系统通过图像分析仅定量细胞内颗粒的过程则繁琐且耗时14。与pH敏感性染料偶联的生物颗粒仅在酸性环境（如吞噬溶酶体）中产生荧光，因此无需进行繁琐的洗涤和淬灭步骤14。此外，pH敏感性标记的生物颗粒能够提供动力学数据，而使用FITC或其他荧光素偶联的生物颗粒难以获得此类信息。
利用这一新工具开展的研究已采用流式细胞术和/或成像平台，对吞噬细胞活性进行定量和动力学测量
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会重大研究仪器项目资助，资助编号为1626093和1919583。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板 | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL 和 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | ThermoFisher | 339653 | |
| 4 孔带盖玻片培养板，带不可拆卸孔 | ThermoFisher | 155382PK | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 成像系统 | Zeiss | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| 细胞刮铲 | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| 培养瓶，组织培养处理，表面积 75 cm2，斜颈，带盖，带滤器 | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | 小鼠间充质干细胞系 |
| DMEM，高糖 | ThermoFisher | 11965092 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | ThermoFisher | 16140071 | |
| 血细胞计数板 | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | 小鼠巨噬细胞系 MΦ |
| LADMAC 细胞系 | ATCC | CRL-2420 | LADMAC 细胞分泌集落刺激因子 1（CSF-1）。 |
| 活细胞成像溶液 | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS，pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan 生物颗粒偶联物 | ThermoFisher | P35365 | |
| 重组小鼠 IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| 无菌一次性真空过滤装置，250 mL，0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| 无菌注射器滤器，0.2 微米 | ThermoFisher | 723-2520 | |
| 组织培养处理培养皿，100 mm × 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | ThermoFisher | 25300054 |
参考文献
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