本文介绍了一种定量分析并生成间充质干细胞（MSC）介导的巨噬细胞（MΦ）对非调理酵母（酵母聚糖）颗粒吞噬作用动态图像的实验方案，其中酵母聚糖颗粒与一种pH敏感型荧光分子偶联。
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本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSC）传统上因其再生特性而被研究，但近年来，其免疫调节特性成为研究焦点。MSC可与免疫细胞相互作用并调节其活性。本研究的重点是MSC对巨噬细胞吞噬活性的调控作用。巨噬细胞（MΦ）的吞噬作用是先天免疫系统应对感染的重要组成部分，目前MSC调控该反应的机制正处于积极研究之中。本文介绍一种在MSC共培养条件下研究MΦ对未调理酵母聚糖颗粒吞噬作用的方法，其中酵母聚糖颗粒与一种pH敏感的荧光分子偶联。随着吞噬活性增强，标记的酵母聚糖颗粒被包裹进入酸性吞噬溶酶体环境中，pH敏感荧光分子的荧光强度随之增强。通过选择适当的激发和发射波长，利用荧光分光光度计测定吞噬活性，并在70分钟内以相对荧光单位的变化呈现动力学数据。为支持该定量结果，采用动态成像技术对吞噬活性的变化进行可视化观察。使用该方法获得的结果表明，在与MSC共培养时，无论未经处理的幼稚MΦ还是经IFN-γ处理的MΦ，其对未调理酵母聚糖的吞噬活性均增强。这些数据进一步丰富了当前关于MSC调控先天免疫系统的认知。该方法可用于后续研究，以全面阐明其潜在的细胞与分子机制。 关键词：间充质干细胞，巨噬细胞，吞噬作用，酵母聚糖，pH敏感荧光，共培养，先天免疫，IFN-γ
引言
间充质干细胞（MSC）是一类可分化为结缔组织细胞的祖细胞。MSC存在于成年哺乳动物组织中，可从骨髓中分离获得1由于其免疫调节特性，这些细胞被广泛研究2早期研究主要关注间充质干细胞对T细胞的调控作用3,4,5,6 但近年来，它们对巨噬细胞（MΦ），作为先天免疫系统的主要细胞组分，受到越来越多的关注7,8,9,10,11,12,13,14. 间充质干细胞与巨噬细胞相互作用的重要性Φ 单核细胞/巨噬细胞在炎症性疾病治疗中的相互作用的重要性体现....
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方案
注意：所有培养基制备和细胞培养操作均须在生物安全柜内的层流环境下，以无菌条件进行。所述所有培养孵育步骤均须使用专门的孵育箱，维持 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度的气体环境。
1. 细胞培养
- 生长培养基的制备
- 对于 MSC 和 LADMAC，向 500 mL 高糖 DMEM 中加入 50 mL FBS 和 5 mL 100x 抗生素/抗真菌素混合液。
- 对于巨噬细胞Φ加入50 mL胎牛血清、100 mL LADMAC条件培养基（按1.2节步骤制备）和5 mL 100倍抗生素混合液至500 mL高糖DMEM培养基中。
注意：LADMAC 细胞产生支持 MΦ 生长所必需的集落刺激因子（CSF-1）Φ 细胞
- LADMAC 条件培养基的制备
- 从冻存的LADMAC细胞中接种时，向五个T75 cm²培养瓶中各加入1.1节中的19 mL生长培养基。2 经细胞培养处理的培养瓶，放入细胞培养箱中孵育15分钟，以平衡至37 °C.
- 同时，快速解冻一份数量为10的 aliquot6 通过在37℃孵育解冻细胞 °C 水浴中孵育 2–3 分钟，或直至完全解冻。将细胞加入含有 9 mL 新鲜 MSC ....
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结果
计算各组在所有时间点的均值 ± 标准误（SEM）后，数据以折线图形式呈现，其中 Y 轴表示相对荧光强度，X 轴表示时间。补充文件 1 提供了以电子表格格式呈现的 96 孔板动力学读数原始数据示例。
本研究中，图3A 和 表3 所示的最佳结果表明：1）与间充质干细胞（MSC）共培养可增强巨噬细胞的吞噬活性；2）干扰素-γ（IFN-γ）处理会降低巨噬细胞的活性；3）与MSC共培养可部分恢复巨噬细胞（MΦ）的吞噬活性。在这些实验中，细胞最佳密度至关重要；当巨噬细胞接种密度过低时，无法检测到荧光强度的变化（图3B）。图3C 显示的是巨噬细胞接种密度过高时的实验数据，所有组别的荧光强度均迅速升高，导致组间差异无法分辨。动态成像视频证实，荧光强度的变化源于吞噬作用，而非培养基的酸化。此外，这些视频还提供了吞噬活性速率和程度的定性数据及可视化呈现（
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讨论
利用与pH敏感性染料偶联的生物颗粒分析吞噬作用是一种相对较新的技术，相较于传统的荧光标记颗粒具有明显优势12,19,20。使用传统荧光标记颗粒时，仅能进行终点分析。检测需在通过洗涤或淬灭未被吞噬细胞摄取的颗粒后，借助荧光显微镜和/或荧光分光光度法完成。由荧光分光光度法获得的定量数据可能受到未内化颗粒的干扰，而利用传统荧光显微系统通过图像分析仅定量细胞内颗粒的过程则繁琐且耗时14。与pH敏感性染料偶联的生物颗粒仅在酸性环境（如吞噬溶酶体）中产生荧光，因此无需进行繁琐的洗涤和淬灭步骤14。此外，pH敏感性标记的生物颗粒能够提供动力学数据，而使用FITC或其他荧光素偶联的生物颗粒难以获得此类信息。
利用这一新工具开展的研究已采用流式细胞术和/或成像平台，对吞噬细胞活性进行定量和动力学测量
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国家科学基金会重大研究仪器项目资助，资助编号为1626093和1919583。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板 | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL 和 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | ThermoFisher | 339653 | |
| 4 孔带盖玻片培养板，带不可拆卸孔 | ThermoFisher | 155382PK | |
| 抗生素-抗真菌剂（100X） Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 成像系统 | Zeiss | ||
| 牛血清白蛋白（BSA） | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| 细胞刮铲 | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| 培养瓶，组织培养处理，表面积 75 cm2，斜颈，带盖，带滤器 | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | 小鼠间充质干细胞系 |
| DMEM，高糖 | ThermoFisher | 11965092 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活 | ThermoFisher | 16140071 | |
| 血细胞计数板 | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | 小鼠巨噬细胞系 MΦ |
| LADMAC 细胞系 | ATCC | CRL-2420 | LADMAC 细胞分泌集落刺激因子 1（CSF-1）。 |
| 活细胞成像溶液 | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS，pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan 生物颗粒偶联物 | ThermoFisher | P35365 | |
| 重组小鼠 IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| 无菌一次性真空过滤装置，250 mL，0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| 无菌注射器滤器，0.2 微米 | ThermoFisher | 723-2520 | |
| 组织培养处理培养皿，100 mm × 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | ThermoFisher | 25300054 |
参考文献
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E.
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重印与许可
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