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利用双荧光探针比率显微镜测量巨胞饮体的pH值、氧化还原化学状态及降解能力

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DOI：

10.3791/62733

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2021年8月19日

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1Department of Biochemistry & Microbiology, Faculty of Science, University of Victoria, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, Faculty of Veterinary Science, University of Calgary, 3Calvin, Joan and Phoebe Snyder Institute for Chronic Diseases, University of Calgary

本文内容

摘要

我们描述了在活细胞中对单个巨胞饮体内的pH值、氧化事件以及蛋白质消化进行测量的实验方案。重点介绍了双荧光探针比率显微成像技术，及其相较于基于群体细胞分析技术所具有的优势。

摘要

近年来，巨胞饮作用（macropinocytosis）领域的研究迅速发展。巨胞饮作用已成为先天免疫细胞维持机体稳态和免疫功能的核心机制之一。与此同时，与它的稳态功能相反，该过程也可能驱动多种病理过程，包括癌症和病毒感染。与其他内吞作用模式不同，用于研究巨胞饮体成熟过程的工具仍处于相对滞后状态。本文所述方案介绍了一套新开发的用于研究早期及成熟中巨胞饮体腔内氧化还原环境的工具。文中描述了利用比率荧光显微镜技术，在活细胞中对单个巨胞饮体腔内的pH值、活性氧（ROS）生成以及降解能力进行检测的方法。单个细胞器的测量方法具有揭示时空异质性的优势，而基于细胞群体的分析方法往往无法呈现这种异质性。本文重点阐述双荧光探针比率荧光显微镜的基本原理，包括探针选择、仪器设置、校准方法，以及单细胞与基于群体方法的比较。

引言

巨胞饮作用（macropinocytosis）是指细胞通过膜包被的胞质细胞器——巨胞饮体（macropinosomes）大量摄取细胞外液体的过程1,2。这是一种高度保守的生物学过程，存在于多种自由生活的单细胞生物中，例如变形虫Dictyostelium spp.3，也见于珊瑚虫类（anthozoans）4和多细胞动物（metazoans）2。在大多数细胞中，巨胞饮作用是一种诱导性事件。细胞表面受体的结合会诱导由肌动蛋白驱动的质膜突起，形成称为膜皱褶（ruffles）的结构。其中一部分膜皱褶通过某种尚未完全阐明的机制，其远端末端闭合，从而形成巨胞饮体（尽管本方法学论文不涉及巨胞饮作用机制的详细讨论，但可参阅文献1,2,5,6,7获取更详尽的综述）。诱导巨胞饮作用的细胞外刺激物通常为可溶性生长因子5,8。因此，巨胞饮事件使细胞能够摄取一批细胞外物质，并从中获取有益的代谢物以促进生长。然而，这种营养物质递送途径也可能导致病理状态。某些癌细胞携带突变，导致巨胞饮作用持续或组成性地发生。营养物质的持续供应促进了癌细胞的不受控增殖，并与特别侵袭性的肿瘤相关联9,10,11,12,13。类似地，病毒也可诱导巨胞饮作用以进入宿主细胞，从而引发病毒感染相关的病理过程14。

巨胞饮作用在维持对病原体的免疫防御中也发挥着功能。某些天然免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，会通过巨胞饮作用持续且积极地摄取细胞外液6,15,16。这种巨胞饮作用极为活跃，单个树突状细胞每小时可摄入相当于自身重量的细胞外液体积17。尽管存在这种持续的取样行为，巨噬细胞和树突状细胞并不会像肿瘤细胞那样不受控制地增殖；相反，它们似乎以某种方式处理所摄取的细胞外物质，从而提取信息，用以判断潜在威胁的存在或缺失。所提取的信息包括：i) 可被细胞内病原体识别受体识别的病原体相关分子模式；以及 ii) 可装载至主要组织相容性分子上、供适应性免疫系统细胞进行筛选的短肽段16,18,19。目前尚不清楚病原体是否会劫持这一免疫细胞信息处理通路。

尽管巨胞饮作用在维持免疫和稳态方面具有明确且关键的功能，并且与更常被研究的其他内吞方式相比存在差异，但目前对巨胞饮体内部（腔内）运作机制的了解仍然十分有限。开发用于研究巨胞饮体腔内生物化学特性的标准化方案和工具，不仅有助于我们更深入地理解其独特的生物学特性，还将为包括药物递送在内的新型治疗策略提供重要启示20。本文将重点介绍近期开发的可在单个细胞器水平上解析巨胞饮体腔内生物化学多个方面的研究工具。

如果荧光探针满足以下条件之一或两者：i) 优先分配至目标区室，和/或 ii) 对目标参数产生光谱变化，则可用于测量细胞器的特定生化性质。例如，在 pH 检测中，荧光弱碱类物质（如吖啶橙、甲苯胺蓝和 LysoTracker 染料）会优先富集于酸性细胞器中，因此其相对荧光强度可粗略指示被标记细胞器呈酸性。其他对 pH 响应的荧光探针，如荧光素、pHrodo 和 cypHer5e，在结合质子后会发生光谱变化（图 1A-C）。因此，pH 敏感型荧光探针的荧光发射变化可提供对 pH 值的有用估算。然而，使用单一荧光探针存在若干缺点。例如，焦平面变化、光漂白以及单个细胞器体积的改变（在巨胞饮泡中常见）21 均可引起单一荧光探针荧光强度的变化，且此类变化难以校正22。因此，单波长检测虽然有助于可视化酸性区室，但仅能提供定性结果。

一种更定量的方法是将对参数敏感的荧光探针与一个参考荧光探针共同靶向至目标细胞器。理想的参考荧光探针对细胞器内的生化变化不敏感（图1D-F），因此可用于校正焦平面变化、细胞器体积变化，以及在一定程度上校正光漂白23。采用这种方法，即所谓的双荧光探针比率荧光法，可通过计算参数敏感型荧光探针与参考荧光探针荧光发射强度的比值来实现校正。

本实验方案将利用双荧光团比率成像的原理，检测巨胞饮体内的 pH 值、氧化事件以及蛋白质降解情况。在每种情况下，将选择一种对目标参数敏感的荧光团和一种参考荧光团。为了将荧光团特异性靶向巨胞饮体，它们将被共价偶联至 70 kDa 右旋糖酐，后者可优先被巨胞饮体摄取24。所有检测均在 Raw264.7 细胞中进行，但也可适配于其他细胞类型。在可能的情况下，荧光比率将通过参考曲线进行校准，以获得绝对数值。重要的是，所有测量均在活细胞中进行，以实现对巨胞饮体腔内环境的动态和定量评估。

在选择pH敏感型荧光探针时，需权衡多个因素。首先是荧光探针的pKa值，它指示了探针在何种pH范围内最为敏感。假设巨胞饮体形成后其内部pH值接近细胞外环境（约pH 7.2），随后通过与晚期内体和溶酶体相互作用而逐步酸化（约pH 5.0），则应选择pKa值在此范围内具有敏感性的探针（图2C）。荧光素（fluorescein）的pKa为6.4，在该pH范围内具有最佳敏感性。该探针已被广泛用于测量其他类似的细胞器（如吞噬体），也是本研究中选用的荧光探针22,25。作为参照荧光探针，将使用对pH不敏感的四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine）（图1E）。当荧光素的光谱特性与其他实验变量不匹配时，可选用pHrodo或cypHer5e等其他荧光探针替代荧光素。适用于pHrodo和cypHer5e的一些推荐参照荧光探针如图1所示。

第二个考虑因素是两种荧光染料如何特异性地靶向巨胞饮体。分子量为70 kDa、流体动力学半径约为7 nm的葡聚糖不会非特异性地黏附细胞，可被巨胞饮作用摄取，但不会进入网格蛋白包被小窝或小窝蛋白介导的内吞途径，因此可用于标记巨胞饮体（图2A 和 图3A、B）16，24，26。在本实验方案中，将分别使用荧光素标记的70 kDa葡聚糖和四甲基罗丹明（TMR）标记的70 kDa葡聚糖作为pH敏感探针和参考探针。

在天然免疫细胞中，巨胞饮作用和吞噬作用是外源性物质内化并进行加工、随后向适应性免疫细胞呈递的两条主要途径27。对吞噬体和巨胞饮体腔内氧化还原化学反应进行精细而协调的调控，对于外源性物质的特定环境加工至关重要。在吞噬体中，氧化事件最广为人知的调控因子是NADPH氧化酶，这是一种大型多亚基复合物，可在吞噬体腔内产生大量活性氧（ROS）28。事实上，其活性是吞噬体内抗原适当加工的核心29,30。然而，NADPH氧化酶在巨胞饮体膜上的活性尚未被研究。

在本实验方案中，使用 H2DCFDA 琥珀酰亚胺酯来检测巨胞饮泡内的氧化事件。H2DCFDA 是荧光素的一种修饰形式（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯），其还原态时荧光极弱，经氧化后荧光信号显著增强。然而需要注意 H2DCFDA 的一个重要局限性：由于其基于荧光素这一荧光团，其荧光在酸性区室中也会被淬灭，因此在实验设计时必须对此变量进行严格对照28。与测定 pH 的方法类似，H2DCFDA 琥珀酰亚胺酯将共价连接至 70 kDa 葡聚糖，同时使用 TMR 标记的 70 kDa 葡聚糖作为参考荧光团（图 3A）。

将使用荧光卵清蛋白来测量巨胞饮体内的蛋白质降解。此处使用的卵清蛋白被高密度标记了4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并[1,2,3-cd]荧光素（BODIPY）FL染料，该染料处于自淬灭状态。在消化过程中，会释放出强荧光的染料标记肽段。由于卵清蛋白难以与70 kDa的葡聚糖直接偶联，因此将同时孵育含有TMR标记的70 kDa葡聚糖和处于液相的卵清蛋白的细胞。在成像后的分析中，将利用TMR信号生成巨胞饮体的掩膜，并在该掩膜范围内测量由降解卵清蛋白释放的荧光信号（图3B）。

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方案

1. 细胞的制备

  1. 在37 °C、5% CO2条件下，将Raw264.7细胞培养至70%融合度，培养基为添加10%热灭活血清的RPMI。
  2. 实验前一天，以每孔5 × 104个细胞的密度将Raw264.7细胞接种于96孔板中，确保每孔含有100 μL培养基。确保96孔板具有黑色侧壁和玻璃底，适用于成像。
    注：此处使用96孔板进行成像。与较大的成像腔室相比，96孔板可减少细胞和试剂的使用量。但也可使用任何适用于活细胞成像的腔室，并相应调整试剂用量。
  3. 实验当天，检查各孔细胞融合度是否至少达到70%。

2. 测量巨胞饮体的pH值

  1. 按照第1节中的步骤准备细胞。
  2. 用100 μL 37 °C的HBSS洗涤所有孔。
  3. 每孔加入100 μL含有0.025 mg/mL TMR标记的70 kDa葡聚糖和0.025 mg/mL荧光素标记的70 kDa葡聚糖的HBSS。
  4. 将细胞置于37 °C培养箱中孵育15分钟。
  5. 从培养箱中取出细胞，用100 μL HBSS洗涤6次。
  6. 每孔加入100 μL 37 °C的HBSS。
  7. 将培养板放置在带有加热载物台和培养腔的显微镜上。
  8. 根据需要调整每种荧光染料的激发/发射参数。
    注意：图像采集的理想条件会因所用荧光染料及显微镜设置的不同而有所差异。本实验使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜进行成像。TMR使用543 nm激光激发，收集610 nm至650 nm的发射光；荧光素使用488 nm激光激发，收集500 nm至550 nm的发射光。采用63倍油镜，以0.5 μm为间隔采集10 μm的Z轴层厚图像。
  9. 对每个孔采集图像，孔间交替采集不同荧光染料的信号。
  10. 首次采集后，检查整个培养板的所有孔是否仍保持在焦平面内。
  11. 根据所需时间，以1-15分钟为间隔对每个孔进行连续成像。

3. 原位 巨胞饮体pH的校准

  1. 在图像采集过程中，准备1 L富含钾离子（K+-rich）的溶液，其中包含140 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2和5 mM葡萄糖。取400 mL该K+-rich溶液，加入25 mM HEPES（来自1 M、pH 7.2的储备液），另取400 mL该溶液，加入25 mM MES（来自0.5 M、pH 6.0的储备液）。
  2. 使用10 M HCl或10 M KOH，将一份50 mL含25 mM HEPES缓冲的K+-rich溶液调节至pH 7.5。
  3. 分别使用10 M HCl或10 M KOH，将三份独立的50 mL含25 mM MES缓冲的K+-rich溶液调节至pH 6.5、pH 5.5和pH 5.0。
    注意：对于较低pH的溶液，乙酸-乙酸盐缓冲液可能更为合适。
  4. 图像采集完成后，移除含有细胞的96孔板中的HBSS，并替换为pH 7.5的K+-rich溶液。
  5. 加入尼日里菌素（nigericin），使其终浓度为10 μg/mL。
    注意：尼日里菌素是一种离子载体，可介导K+与H+的交换。通过将K+-rich溶液中的K+浓度设定为接近细胞质K+浓度的值，可确保尼日里菌素将巨胞饮体内的pH钳制在与细胞质相同的水平，而该水平又反映了校准缓冲液的pH。
  6. 将培养板重新放回显微镜上，并使用与上述相同的采集参数对每个孔进行成像。
  7. 对每种校准缓冲液重复步骤3.5和3.6。

4. 大胞饮体 pH 值的数据分析

  1. 使用 FIJI 软件，对 TMR 通道和荧光素通道均进行背景扣除。
  2. 在TMR通道上生成掩膜。要生成掩膜，需通过选择将图像转换为二值图像 调节 > 阈值 > 应用接下来，选中二值图像并选择 编辑 > 选择 > 创建掩膜.
  3. 将其应用于TMR和荧光素图像。为此，请先选中掩膜，然后选择 编辑 > 选择 > 创建选区. 单击 TMR 图像并按压 Shift + E 将掩膜应用于TMR通道。类似地，单击荧光素图像并按下 Shift + E 将掩膜应用于OB通道。
  4. 记录每个掩膜内巨胞饮小泡的TMR和荧光素强度。
  5. 对时间进程中的每个时间点重复步骤 4.1–4.3。
  6. 重复步骤 4.1–4.3，对所采集的图像进行处理 原位 校准
  7. 将荧光素强度除以TMR强度，以生成荧光素:TMR比值。
  8. 将校准图像的荧光素：TMR 比值对 pH 作图。
  9. 对校准数据进行曲线拟合。
  10. 根据时间进程数据插值每个时间点，以获得绝对pH值。

5. 巨胞饮体中氧化事件的检测

  1. 按照第1节的方法准备细胞。
  2. 在检测前一天，通过将10 mg的70 kDa氨基葡聚糖溶解于1 mL的0.1 M碳酸氢钠溶液（pH 8.3）中，制备H2DCFDA琥珀酰亚胺酯标记的70 kDa葡聚糖。向该氨基葡聚糖溶液中加入1 mg H2DCFDA琥珀酰亚胺酯，孵育1小时。用PBS对H2DCFDA标记的70 kDa葡聚糖进行透析。标记产物不可储存超过1天，因为H2DCFDA标记的70 kDa葡聚糖在储存过程中会发生氧化。
  3. 在检测当天，用100 μL 37 °C的HBSS洗涤所有孔。
  4. 向每孔中加入100 μL含有0.025 mg/mL TMR标记70 kDa葡聚糖和0.025 mg/mL H2DCFDA标记70 kDa葡聚糖的HBSS。
  5. 将细胞置于37 °C培养箱中孵育15分钟。
  6. 从培养箱中取出细胞，用100 μL HBSS洗涤6次。
  7. 向每孔中加入100 μL 37 °C的HBSS。
  8. 将培养板置于配备加热载物台和培养室的显微镜上，根据需要调整每种荧光染料的激发/发射参数。
    注意：图像采集的理想条件因所用荧光染料及显微镜配置的不同而有所差异。本实验使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜进行成像。TMR使用543 nm激光激发，收集610 nm至650 nm的发射光；H2DCFDA使用488 nm激光激发，收集500 nm至550 nm的发射光。采用63倍油浸物镜，以0.5 μm为间隔采集10 μm的Z轴层厚图像。
  9. 对每个孔采集图像，不同孔之间交替采集不同荧光信号。
  10. 首次采集后，检查整个培养板的所有孔是否仍保持在焦平面内。
  11. 根据所需时间，以1至15分钟为间隔，对每个孔进行连续图像采集。

6. 巨胞饮泡内氧化事件的数据分析

  1. 使用 FIJI 软件，对 TMR 和 H2DCFDA 两个通道进行背景扣除。
  2. 在 TMR 通道上生成掩膜。生成掩膜的方法是：选择 Adjust > Threshold > Apply，将图像转换为二值图像。接着，选中该二值图像，然后选择 Edit > Selection > Create Mask。
  3. 将该掩膜应用于 TMR 和 H2DCFDA 两幅图像。具体操作为：选中掩膜后，点击 Edit > Selection > Create Selection。然后点击 TMR 图像并按下 Shift + E，将掩膜应用到 TMR 通道；同样地，点击 H2DCFDA 图像并按下 Shift + E，将掩膜应用到 H2DCFDA 通道。
  4. 记录每个掩膜内巨胞饮小体的 TMR 和 H2DCFDA 荧光强度。
  5. 对时间序列中的每个时间点重复步骤 4.1–4.3。
  6. 将 H2DCFDA 荧光强度除以 TMR 荧光强度，计算得到 H2DCFDA:TMR 比值。
  7. 以时间为横坐标，绘制 H2DCFDA:TMR 比值的变化曲线。

7. 大型胞饮体中蛋白质消化的测定

  1. 按照第1节中的步骤准备细胞。
  2. 在检测当天，用100 μL 37 °C的HBSS洗涤所有孔。
  3. 将BODIPY标记的卵白蛋白溶解于HBSS中，使其浓度为4 mg/mL。
  4. 向每孔中加入100 μL HBSS，其中含有0.025 mg/mL的TMR标记70 kDa葡聚糖和0.2 mg/mL的BODIPY标记卵白蛋白。
  5. 将细胞置于37 °C培养箱中孵育15分钟。
  6. 从培养箱中取出细胞，用100 μL HBSS洗涤细胞6次。
  7. 向每孔中加入100 μL 37 °C的HBSS。
  8. 将培养板置于配备加热载物台和培养室的显微镜上，并根据需要调整每种荧光染料的激发/发射参数。
    注意：图像采集的最佳条件因所用荧光染料及显微镜设置的不同而有所差异。本实验使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜进行成像。TMR采用543 nm激光激发，收集610 nm至650 nm的发射光；BODIPY采用488 nm激光激发，收集500 nm至550 nm的发射光。使用63倍油浸物镜，以0.5 μm为间隔采集10 μm的Z轴层厚图像。
  9. 对每个孔采集图像，孔间交替采集不同荧光染料的信号。
  10. 首次采集后，检查整个培养板的所有孔是否仍保持在焦平面内。
  11. 在所需的时间范围内，以1-15分钟为间隔对每个孔进行连续图像采集。

8. 巨胞饮泡内蛋白质消化的数据分析

  1. 使用 FIJI 软件，从 TMR 和 BODIPY 通道中减去背景。
  2. 在 TMR 通道上生成掩膜，并将其应用于 TMR 和 BODIPY 图像，如上述步骤 6.2 和 6.3 所示（图 3B）。
  3. 记录掩膜内每个巨胞饮小体的 TMR 和 BODIPY 荧光强度。
  4. 对时间过程中的每个时间点重复步骤 4.1–4.3。
  5. 将 BODIPY 荧光强度除以 TMR 荧光强度，计算 BODIPY:TMR 比值。
  6. 绘制 BODIPY:TMR 比值随时间变化的曲线。

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结果

在测量大胞饮体pH值时，存在一段无法检测酸化动力学的时间。该时间段对应于葡聚糖加载阶段（图中灰色区域） 图 2C 和 图3C,D）并取决于所用细胞类型。加载阶段的时长将随以下两个因素变化：（i）细胞的巨胞饮活性，以及（ii）所用仪器的灵敏度。建议在每次实验开始时调整该时间段，使荧光素和TMR通道的信号：噪声比均达到4:1以上。在未经处理的细胞中，随着巨胞饮体酸化，荧光素的发射信号应逐渐减弱，而TMR信号应保持稳定或增强。若巨胞饮体体积缩小，TMR信号可能增强16,21这不会影响比值，因为荧光素信号会受到细胞器大小相同变化的影响。22荧光素：TMR 的比值将逐渐减小，并在采集开始后的前 15 分钟内达到平台期图 2C）。该平台对应的pH值约为5，与溶酶体的pH值大致...

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讨论

尽管已有多种用于巨噬细胞、成纤维细胞甚至Dictyostelium spp.3,7,31,32,33中大胞饮作用摄取的低通量和高通量检测方案，但针对这些动态区室腔内生化过程的测量尝试却极为有限。这可能是由于缺乏能够高效靶向大胞饮体区室、同时避免进入其他内吞区室的探针所致。本文所述技术可用于将荧光探针靶向大胞饮体，从而动态检测其中的pH值、氧化事件以及蛋白质降解过程。

数十年来，比率荧光显微镜一直是测量内体pH的主要技术。荧光素被广泛用于内体pH的测定，至今仍是首选荧光探针，因其pKa值适合在典型的内体pH范围内（约pH 7.2–4.5）进行准确测量。本研究采用与70 kDa葡聚糖偶联的荧光素，以实现大胞...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢卡尔加里大学提供的支持。我们还要感谢 Robin Yates 博士提供试剂、设备以及有益的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
黑色壁96孔板PerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS酯CytivaPA15401
葡聚糖-氨基 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-卵白蛋白InvitrogenD12053
FITC-葡聚糖 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
尼日尔菌素Sigma AldrichN7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7细胞ATCCTIB-71
RPMI培养基Gibco11875093
SP5共聚焦显微镜Leica-
TRITC-葡聚糖 70 kDaInvitrogenD1819
u-培养皿Ibidi81156

参考文献

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180(2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153(2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284(2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112(2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156(2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146(2019).

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