我们描述了在活细胞中对单个巨胞饮体内的pH值、氧化事件以及蛋白质消化进行测量的实验方案。重点介绍了双荧光探针比率显微成像技术，及其相较于基于群体细胞分析技术所具有的优势。
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本文内容
摘要
摘要
近年来，巨胞饮作用（macropinocytosis）领域的研究迅速发展。巨胞饮作用已成为先天免疫细胞维持机体稳态和免疫功能的核心机制之一。与此同时，与它的稳态功能相反，该过程也可能驱动多种病理过程，包括癌症和病毒感染。与其他内吞作用模式不同，用于研究巨胞饮体成熟过程的工具仍处于相对滞后状态。本文所述方案介绍了一套新开发的用于研究早期及成熟中巨胞饮体腔内氧化还原环境的工具。文中描述了利用比率荧光显微镜技术，在活细胞中对单个巨胞饮体腔内的pH值、活性氧（ROS）生成以及降解能力进行检测的方法。单个细胞器的测量方法具有揭示时空异质性的优势，而基于细胞群体的分析方法往往无法呈现这种异质性。本文重点阐述双荧光探针比率荧光显微镜的基本原理，包括探针选择、仪器设置、校准方法，以及单细胞与基于群体方法的比较。
引言
巨胞饮作用（macropinocytosis）是指细胞通过膜包被的胞质细胞器——巨胞饮体（macropinosomes）大量摄取细胞外液体的过程1,2。这是一种高度保守的生物学过程，存在于多种自由生活的单细胞生物中，例如变形虫Dictyostelium spp.3，也见于珊瑚虫类（anthozoans）4和多细胞动物（metazoans）2。在大多数细胞中，巨胞饮作用是一种诱导性事件。细胞表面受体的结合会诱导由肌动蛋白驱动的质膜突起，形成称为膜皱褶（ruffles）的结构。其中一部分膜皱褶通过某种尚未完全阐明的机制，其远端末端闭合，从而形成巨胞饮体（尽管本方法学论文不涉及巨胞饮作用机制的详细讨论，但可参阅文献1,2,5,6,7获取更详尽的综述）。诱导巨胞饮作用的细胞外刺激物通常为可溶性生长因子5
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方案
1. 细胞的制备
- 在37 °C、5% CO2条件下，将Raw264.7细胞培养至70%融合度，培养基为添加10%热灭活血清的RPMI。
- 实验前一天，以每孔5 × 104个细胞的密度将Raw264.7细胞接种于96孔板中，确保每孔含有100 μL培养基。确保96孔板具有黑色侧壁和玻璃底，适用于成像。
注：此处使用96孔板进行成像。与较大的成像腔室相比，96孔板可减少细胞和试剂的使用量。但也可使用任何适用于活细胞成像的腔室，并相应调整试剂用量。 - 实验当天，检查各孔细胞融合度是否至少达到70%。
2. 测量巨胞饮体的pH值
- 按照第1节中的步骤准备细胞。
- 用100 μL 37 °C的HBSS洗涤所有孔。
- 每孔加入100 μL含有0.025 mg/mL TMR标记的70 kDa葡聚糖和0.025 mg/mL荧光素标记的70 kDa葡聚糖的HBSS。
- 将细胞置于37 °C培养箱中孵育15分钟。
- 从培养箱中取出细胞，用100 μL HBSS洗涤6次。
- 每孔加入100 μL 37 °C的HBSS。
- 将培养板放置在带有加热载物台和培养腔的显微镜上。
- 根据需要调整每种荧光染料的激发/发射参数。
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结果
在测量大胞饮体 pH 时，存在一个无法检测酸化动力学的时间段。该时间段对应于葡聚糖加载阶段（图中的灰色框）。 图2C 和 图3C,D）并取决于所用细胞类型。加载阶段的时长将随以下两个因素而变化：（i）细胞的巨胞饮活性；（ii）所用仪器的灵敏度。建议在每次实验开始时调整该时间段，使荧光素和TMR通道的信号：噪声比均达到4:1以上。在未经处理的细胞中，随着巨胞饮体酸化，荧光素发射信号应逐渐减弱，而TMR信号应保持稳定或增强。若巨胞饮体体积缩小，TMR信号可能增强16,21这不会影响比值，因为荧光素信号会受到细胞器大小相同变化的影响。22荧光素:TMR 比值将逐渐减小，并在采集开始后的前 15 分钟内达到平台期。图 2C）。该平台区对应的 pH 值约为 5，与溶酶体的 .......
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讨论
尽管已有多种用于巨噬细胞、成纤维细胞甚至Dictyostelium spp.3,7,31,32,33中大胞饮作用摄取的低通量和高通量检测方案，但针对这些动态区室腔内生化过程的测量尝试却极为有限。这可能是由于缺乏能够高效靶向大胞饮体区室、同时避免进入其他内吞区室的探针所致。本文所述技术可用于将荧光探针靶向大胞饮体，从而动态检测其中的pH值、氧化事件以及蛋白质降解过程。
数十年来，比率荧光显微镜一直是测量内体pH的主要技术。荧光素被广泛用于内体pH的测定，至今仍是首选荧光探针，因其pKa值适合在典型的内体pH范围内（约pH 7.2–4.5）进行准确测量。本研究采用与70 kDa葡聚糖偶联的荧光素，以实现大胞.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢卡尔加里大学提供的支持。我们还要感谢 Robin Yates 博士提供试剂、设备以及有益的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 黑色壁96孔板 | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS酯 | Cytiva | PA15401 | |
| 葡聚糖-氨基 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-卵白蛋白 | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-葡聚糖 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| 尼日尔菌素 | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7细胞 | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI培养基 | Gibco | 11875093 | |
| SP5共聚焦显微镜 | Leica | - | |
| TRITC-葡聚糖 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-培养皿 | Ibidi | 81156 |
参考文献
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
- Williams....
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