兔模型中的离体肺灌注系统

摘要

离体兔肺制备是肺部研究中的金标准工具。本文旨在描述该技术，该技术已开发用于研究气道反应性、肺保存以及肺移植和肺水肿的临床前研究中涉及的生理和病理机制。

摘要

离体肺灌注系统已广泛应用于肺部研究，有助于从微观和宏观层面阐明肺脏的内在工作机制。该技术通过测量代谢活性和呼吸功能，可用于表征肺生理学与病理学特征，包括循环物质之间的相互作用以及吸入或灌注物质的影响，例如在药物测试中的应用。尽管体外（in vitro）方法涉及组织切片与培养，离体器官外（ex vivo）肺灌注系统则允许使用一个完整且具有功能的器官，从而能够在模拟通气与灌注条件下研究持续的生理功能。然而，需要注意的是，中枢神经支配缺失和淋巴引流缺失所造成的影响仍需进一步全面评估。本实验方案旨在描述离体肺装置的组装过程，随后介绍实验动物肺脏与心脏的手术取出及插管操作，并展示灌注技术与数据信号处理方法。离体肺的平均存活时间为5至8小时；在此期间，肺毛细血管通透性逐渐增加，导致肺水肿和肺损伤。保存肺组织的功能状态通过毛细血管滤过系数（Kfc）进行评估，该参数用于随时间测定肺水肿的发展程度。

引言

布罗迪和迪克森首次描述了 离体 1903年的肺灌注系统 ¹此后，它已成为研究肺部生理学、药理学、毒理学和生物化学的金标准工具^2,3该技术为评估肺移植的存活率提供了一种稳定且可重复的方法，并可用于确定组胺、花生四烯酸代谢物、P 物质等炎症介质及其在支气管收缩、肺不张和肺水肿等肺部现象中的相互作用。离体肺系统一直是揭示肺脏在清除体循环中生物源性胺类物质方面重要角色的关键技术。^4,5此外，该系统已被用于评估肺表面活性物质的生物化学特性⁶. 在过去几十年中， 离体 肺灌注系统已成为肺移植研究的理想平台⁷2001年，Stig Steen 领导的团队描述了该技术的首次临床应用 离体 利用该肺灌注系统对一名19岁供体的肺脏进行再条件化处理，该供体肺脏因存在损伤最初被多个移植中心拒绝。获取左肺后进行灌注，持续65分钟；随后成功移植至一名70岁慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者体内⁸. 进一步研究利用肺脏再调节的 离体 灌注促进了多伦多扩展肺灌注技术的发展，用于评估和治疗受损的供体肺^9,10. 临床上， 离体 肺灌注系统已被证明是一种安全的策略，可通过治疗和修复不符合标准的供体肺来扩大供体库，其在风险和临床结局方面与符合标准的供体相比无显著差异¹⁰.

离体肺灌注系统的主要优势在于，可在人工实验室条件下维持器官完整生理功能的基础上，对实验参数进行评估。此外，该系统允许测量和调控肺机械通气，以分析肺生理学的各项指标，如气道阻力、总血管阻力、气体交换以及水肿形成，而这些参数迄今为止尚无法被精确测定 体内 在实验动物上²值得注意的是，可以完全控制用于肺灌注的溶液成分，从而实现实时添加物质以评估其效应，并可从灌注液中采集样本用于进一步研究¹¹使用离体肺系统的科研人员应注意，机械通气会导致肺组织功能衰退，缩短其有效使用时间。在实验过程中定期对肺进行过度膨胀处理，可显著延缓机械参数的进行性下降。⁴不过，该制备过程通常不能持续超过八小时。另一个需要考虑的因素是 离体 肺灌注系统的局限在于缺乏中枢神经调节和淋巴引流。这种缺失的影响尚未完全明确，可能在某些实验中成为潜在的偏倚来源。

离体肺灌注系统技术可在兔模型中以高度一致性和可重复性进行。本文描述了实施该技术的技术与外科操作步骤 离体 在墨西哥城国家呼吸系统疾病研究所开发的用于兔模型的离体肺灌注技术，旨在分享相关经验，并为该实验模型应用中的关键步骤提供清晰的指导。

方案

兔模型的离体灌流系统已在中国台湾呼吸系统疾病研究所气道高反应性实验室广泛应用。该方案包括体重约为2.5–3 kg的新西兰兔。所有动物均饲养于标准的动物实验环境条件下。 随意摄取 遵循墨西哥实验室动物护理与使用官方指南（NOM 062-ZOO-1999）以及《实验动物护理与使用指南》（第8版）进行饲养^th 版本，2011）。本方案中涉及的所有动物实验操作和动物护理方法均已通过国家呼吸系统疾病研究所伦理委员会的预先批准。

注意：离体肺灌注系统的制备涉及在麻醉状态下通过安乐死使动物死亡。

1. 仪器设备与装置准备。

1. 设备布置：
   1. 根据兔子的体重选择合适尺寸的手术台。
   2. 将人工胸腔的盖子安装在钢柱上，玻璃腔体置于下方，呼吸机和滚压泵放置于两侧。
   3. 确保该盖子可轻松倾斜，使气管插管与气管对齐，以便快速连接。
2. 人工胸腔：
   注意：这是系统的关键组成部分。它由一个夹层玻璃腔体构成，腔体通过特殊盖子密封。该盖子作为器官固定装置，内置用于插管气管和血管的连接口。
   1. 设置一个由压缩空气驱动的文丘里喷射装置，以在人工胸腔内产生负压。
      注意：通气控制模块（VCM）可独立调节吸气压、呼气末压、呼吸频率以及吸气时间与总呼吸周期时间的比值。
3. 装置：
   1. 确保正常工作的装置包括安装在底板上的主钢柱，底板用于支撑人工胸腔，其上方和预热线圈后方装有流量计和重量换能器，预热线圈处还配有气泡捕获装置。
   2. 将一个差压换能器连接至流量计，另一个连接至腔内压力；在胸腔后方设置另一对压力换能器，用于测量灌注压和静脉压。
   3. 将氧合器下方的转换储液管与液位电极连接，并将通气系统置于装置旁侧。

2. 心肺组织块的手术取出。

1. 麻醉：
   1. 使用镇静剂（赛拉嗪）和巴比妥类药物（戊巴比妥）的组合。
      注意：可使用不同的麻醉混合物，对实验结果无影响。
   2. 首先，对健康的新西兰兔单次肌肉注射盐酸赛拉嗪（3–5 mg/kg）。确保注射数分钟后兔子保持安静和放松，以便进行后续操作。
   3. 在镇静后，通过耳缘（外侧）静脉进行静脉注射戊巴比妥钠（28 mg/kg），以实施全身麻醉。
2. 监测：
   1. 为避免麻醉不足或心肺功能过度抑制，需监测以下参数。通过脚趾夹捏试验评估麻醉深度。
   2. 确保黏膜呈粉红色。蓝色或灰色提示缺氧。
   3. 确保心率维持在120–135次/分钟之间，体温不低于36.5 °C。
3. 动物体位：
   1. 剃除兔躯干毛发，将动物仰卧位置于手术台上。将通气系统放置在手术台旁、兔头部后方，以便在气管切开术后迅速连接插管，避免组织损伤。
4. 切口与气管切开术：
   1. 从膈肌向上至颈部，沿腹侧正中线做3–5 cm长的皮肤切口。
   2. 使用手术剪在两个软骨环之间剪开气管前2/3部分，以便通过气管纤维膜插入气管插管。
   3. 将外径（OD）为5 mm的气管插管经气管纤维膜插入，并用4-0丝线小心固定。
   4. 在气管下方放置止血钳或镊子，确保插管未紧贴气管导致弯曲。
5. 正压通气：
   1. 只要肺仍处于人工胸腔外，即应使用小型动物呼吸泵进行正压通气，以防止术中肺塌陷。
   2. 在气管切开术后、打开胸腔前，迅速通过连接至呼吸泵的气管插管开始通气。
   3. 设定潮气量为10 mL/kg。
      注意：根据实验设置和人工胸腔模型的不同，可使用同一台用于负压通气的泵或另一台泵提供正压通气，以实现快速重新插管。
6. 开胸与放血：
   1. 为进入胸腔，使用手术刀或剪刀切开胸壁，并行正中胸骨切开术至胸腔上1/3处。
   2. 用两个牵开器将胸骨两侧撑开。心脏周围通常有多个肺叶包绕。
   3. 定位上腔静脉和下腔静脉，并用缝线标记。
   4. 在动物放血前，识别右心室并注射肝素1000 IU/kg。
   5. 注射后立即用预先穿好的缝线结扎上腔静脉和下腔静脉，并进行放血。
7. 心肺器官获取：
   1. 轻柔且迅速地获取心肺组织块。采用手指直接分离或弹簧剪剪除结缔组织，将肺从胸腔中取出。
   2. 解剖该区域的血管以及食管。
   3. 剪断胸骨柄，将正中胸骨切开术延伸至气管插管处，松解气管两侧与周围组织的连接。
   4. 随后，在气管插管上方切断气管。沿头尾方向轻柔上提插管，同时切除气管和肺的背侧固定组织。
8. 插管：
   1. 将离体肺从胸腔中取出，小心放置于培养皿中的无菌纱布上。
   2. 为防止肺不张，使用设定呼气末正压（PEEP）为2 cmH₂O的正压通气对肺进行通气。
   3. 在房室沟水平剪除心室。
   4. 打开两个心室后，将带篮状结构、外径（OD）为4.6 mm的兔肺动脉插管经肺动脉插入，同时将外径（OD）为5.9 mm的兔左心房插管经二尖瓣插入左心房。
   5. 使用4-0丝线在肺动脉和左心房处固定插管。结扎时应包含肺动脉和左心房周围的组织，以防止这些结构扩张。
   6. 经动脉插管注入250 mL生理盐水，冲洗血管床中残留的血液。

3. 灌注技术。

1. 实验设置：
   1. 将分离的肺小心放入肺腔室中。
   2. 将气管连接至腔室盖上的换能器。
   3. 将插管的血管连接至灌注系统。
   4. 关闭腔室，并用旋转锁固定。
      注意：循环灌注回路由一个开放的静脉储液器、一台蠕动泵、一个热交换器和一个气泡捕获装置组成。
   5. 此时，安装腔室盖，并切换三通阀，从正压通气转为负压通气。为检查肺的负压通气效果及腔室的密封性，请观察肺的呼吸运动幅度以及压力计上的腔室压力。
   6. 用 200 mL 无血人工灌注液（含 2.5% 牛血清白蛋白的 Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液）灌注肺组织。
   7. 初始灌注流速设为 3 mL/min/kg，随后在 5 分钟内逐步增加至 5 mL/min/kg；再在接下来的 5 分钟内增至 8 mL/min/kg；最后在再一个 5 分钟阶段内达到最大流速 10 mL/min/kg。注意避免空气进入灌注回路。
      注意：维持灌注液的 pH 和温度在生理范围内（pH 7.4–7.5；温度 37 °C–38 °C）。调节 pH 时可加入 NaHCO₃ (1N) 或增加二氧化碳气流；也可使用 HCl (0.1N) 进行酸化。
2. 参数设定：
   1. 检查预设的灌注和通气参数是否已正确设置。
   2. 使用加湿空气对肺进行通气，通气频率为 30 次/分钟，潮气量为 10 mL/kg，呼气末正压（Pe）为 2 cmH₂O。
      注意：肺动脉压（0–20 mmHg）对应于氧合器或储液器中液面高于肺动脉主干的厘米数，而肺静脉压则对应于压力平衡室高于左心房的高度。这两个值均可调节。请注意，左心房压力范围也为 0–20 mmHg。
3. 实现第 3 区（Zone 3）条件：
   1. 利用固定在肺动脉、左心房插管侧端口并与压力传感器相连的两根导管，测量动脉压（Pa）和静脉压（Pv）。
   2. 将基准压力设定在肺门水平（零参考点）。
   3. 在第 3 区通气条件下进行实验。为此，等待 10–15 分钟，直至达到一种等重状态的平衡。
   4. 确保静脉压高于肺泡压（Palv），且动脉压始终高于两者（Pa > Pv > Palv），以实现第 3 区条件。
   5. 确保肺重量保持恒定，动脉压和左心房压力稳定，以达到第 3 区条件，从而最大限度地开放肺血管，并在实验期间维持微血管床的内容量。
      注意：以 Kfc 作为肺水肿指标的测量结果，在手动与自动灌注系统之间无差异。
4. 电子控制与信号处理：确保呼吸流量、重量变化、微血管压力、潮气量、血管阻力等信号被记录在一个多通道中央电子单元上，该单元整合来自换能器的信号，并在评估系统中实时显示。

结果

离体肺灌注系统可对器官进行操作，以进行活检、从灌注液中采集样本，并实时收集生理参数数据。该离体系统可用于验证多种假设，涉及肺部的不同功能和生理现象，从代谢和酶活性到肺水肿形成以及肺移植器官的保存时间等研究均可应用。

图1 展示了完全组装的离体肺灌注系统示意图，包括通气系统和计算数据采集系统。该系统的灌注部分可确保灌注液持续流经离体肺组织。通过肺动脉插管实现灌注液的流入，而灌注液的流出则通过左心房插管完成。灌注液由滚压泵推动，依次流经热交换器、除泡阱，进入肺动脉，最终到达肺血管床。系统的通气部分则使通气介质持续流经气流传感器远端，经由气管插管直接进入肺部。

图2 显示MAO的浓度（图2A）和 5-HT（图2B在4 °C下保存24小时的离体肺中，通过ELISA分析不同时间点获取的血管内液体样本中...

讨论

本研究展示了离体肺灌注系统的总体概况，这是肺生理学研究中的一项关键技术。离体肺灌注系统在应用上具有高度的灵活性，可用于评估多种参数，适用于检验广泛科学假设的需求¹⁵。作为一种在全球范围内广泛应用的研究工具，离体肺系统在近十年中进一步确立了其在器官特异性评估中的重要性，并且其应用范围已扩展至前沿技术与新型疗法的延伸领域，包括间充质干细胞¹⁶和CRISPR/Cas9基因组编辑技术¹⁷等。当前体外肺灌注（ex vivo lung perfusion）的研究领域广泛涵盖抗炎策略、通气相关损伤的管理与预防、抗排斥治疗以及抗肺水肿效能等方面¹⁵。

正确组装仪器是确保数据准确采集的必要条件。如图1所示，整个系统由一个连接至通风系统的负压湿化腔室，以及一个分别模拟肺部呼吸和循环功能的灌注系统组成。两个系统均连接至数据采集系统，该系统...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-Stop Tygon E-Lab 软管，内径 3.17 mm，每包 12 根，黑白双色	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1864
IPL-4 正压通气适配器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4 正压通气适配器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4312
IPL-4 负压通气期间向气管供应不同于室内外空气的气体混合物的替代无压供气装置	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4309
兔至胎猪离体灌注肺基础装置	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4138
牛血清 A2:D41 白蛋白冻干粉	sigma	3912	500 g
氯化钙，CaCl2·2H2O	JT Baker	10035-04-8
冻存管	Corning	430659	2 mL
D-葡萄糖，C6H12O6	sigma	G5767
差分低压换能器 DLP2.5，量程 ±2.5 cmH2O，HSE 接口	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-3882
差分压力换能器 MPX，量程 ±100 cmH2O，HSE 接口	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0064
Eppendorf 管
色谱纯无水乙醇	Caledon
Falcon 管			14 mL
哈佛蠕动泵 P-230（含控制箱和 P-230 电机驱动器）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	70-7001
加热式线性气流传感器，流量范围 0 至 10 L/min	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9349
单气流传感器加热控制器，230 VAC，50 Hz	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	59-9703
肝素	PISA		5000 UI
高效液相色谱柱（C18 100A 5U）	Alltech	98121213	150 mm × 4.6 mm
亲水性注射器滤器	Millex	SLLGR04NL	4 mm
IPL-4 离体兔至胎猪肺核心系统，230	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
IPL-4 离体兔至胎猪肺核心系统，230 V	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4296
带烧结头和软管的夹套玻璃缓冲液储液瓶，6.0 L	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0322
劳达恒温循环器，型号 E-103，230 V/50 Hz，浴槽体积 3 L，温度范围 20 至 150°C	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0125
带篮式结构的兔左心房插管，外径 5.9 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4162
用于 PLUGSYS 模块的低量程血压换能器 P75	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0020
七水合硫酸镁，MgSO4·7H2O	JT Baker	10034-99-8
微量离心管	Corning	430909
IPL-4 负压通气控制选件，含压力调节器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4298
新西兰兔
PISABENTAL（戊巴比妥钠）	PISA	Q-7833-215
PLUGSYS 机箱，型号 603*7	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0045
PLUGSYS TCM 时间计数模块	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1750
PLUGSYS 换能器放大模块（TAM-A）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-0065
PLUGSYS 换能器放大模块（TAM-D）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1793
PLUGSYS VCM-4R 通气控制模块，含压力调节器	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-1755
氯化钾，KCl	JT Baker	3040-01
磷酸二氢钾，KH2PO4	JT Baker	7778-77-0
PROCIN（盐酸赛拉嗪）	PISA	Q-7833-099
带篮式结构的兔肺动脉插管，外径 4.6 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4161
手术刀片
5-羟色胺 5-HT
灌注伺服控制器（SCP）	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-2806
snap cap 微量离心管	Costar	3620	1.7 mL
碳酸氢钠，NaHCO3	sigma	S6014
氯化钠，NaCl	sigma	S9888
7.5 号外科手套
8 号外科手套
Taygon 软管	Masterflex
兔气管插管，外径 5.0 mm	Hugo Sachs Elektronik (HSE)	73-4163