方法文章

兔模型中的离体肺灌注系统

DOI：

10.3791/62734

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2021年7月15日

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1Departamento de Investigación en Hiperreactividad Bronquial, Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias, 2Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

本文内容

摘要

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离体兔肺制备是肺部研究中的金标准工具。本文旨在描述该技术，该技术已开发用于研究气道反应性、肺保存以及肺移植和肺水肿的临床前研究中涉及的生理和病理机制。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

离体肺灌注系统已广泛应用于肺部研究，有助于从微观和宏观层面阐明肺脏的内在工作机制。该技术通过测量代谢活性和呼吸功能，可用于表征肺生理学与病理学特征，包括循环物质之间的相互作用以及吸入或灌注物质的影响，例如在药物测试中的应用。尽管体外（in vitro）方法涉及组织切片与培养，离体器官外（ex vivo）肺灌注系统则允许使用一个完整且具有功能的器官，从而能够在模拟通气与灌注条件下研究持续的生理功能。然而，需要注意的是，中枢神经支配缺失和淋巴引流缺失所造成的影响仍需进一步全面评估。本实验方案旨在描述离体肺装置的组装过程，随后介绍实验动物肺脏与心脏的手术取出及插管操作，并展示灌注技术与数据信号处理方法。离体肺的平均存活时间为5至8小时；在此期间，肺毛细血管通透性逐渐增加，导致肺水肿和肺损伤。保存肺组织的功能状态通过毛细血管滤过系数（Kfc）进行评估，该参数用于随时间测定肺水肿的发展程度。

引言

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布罗迪和迪克森首次描述了 离体 1903年的肺灌注系统 1此后，它已成为研究肺部生理学、药理学、毒理学和生物化学的金标准工具2,3该技术为评估肺移植的存活率提供了一种稳定且可重复的方法，并可用于确定组胺、花生四烯酸代谢物、P 物质等炎症介质及其在支气管收缩、肺不张和肺水肿等肺部现象中的相互作用。离体肺系统一直是揭示肺脏在清除体循环中生物源性胺类物质方面重要角色的关键技术。4,5此外，该系统已被用于评估肺表面活性物质的生物化学特性6. 在过去几十年中， 离体 肺灌注系统已成为肺移植研究的理想平台72001年，Stig Steen 领导的团队描述了该技术的首次临床应用 离体 利用该肺灌注系统对一名19岁供体的肺脏进行再条件化处理，该供体肺脏因存在损伤最初被多个移植中心拒绝。获取左肺后进行灌注，持续65分钟；随后成功移植至一名70岁慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者体内8. 进一步研究利用肺脏再调节的 离体 灌注促进了多伦多扩展肺灌注技术的发展，用....

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方案

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兔模型的离体灌流系统已在中国台湾呼吸系统疾病研究所气道高反应性实验室广泛应用。该方案包括体重约为2.5–3 kg的新西兰兔。所有动物均饲养于标准的动物实验环境条件下。 随意摄取 遵循墨西哥实验室动物护理与使用官方指南（NOM 062-ZOO-1999）以及《实验动物护理与使用指南》（第8版）进行饲养th 版本，2011）。本方案中涉及的所有动物实验操作和动物护理方法均已通过国家呼吸系统疾病研究所伦理委员会的预先批准。

注意：离体肺灌注系统的制备涉及在麻醉状态下通过安乐死使动物死亡。

1. 仪器设备与装置准备。

  1. 设备布置：
    1. 根据兔子的体重选择合适尺寸的手术台。
    2. 将人工胸腔的盖子安装在钢柱上，玻璃腔体置于下方，呼吸机和滚压泵放置于两侧。
    3. 确保该盖子可轻松倾斜，使气管插管与气管对齐，以便快速连接。
  2. 人工胸腔：
    注意：这是系统的关键组成部分。它由一个夹层玻璃腔体构成，腔体通过特殊盖子密封。该盖子作为器官固定装置，内置用于插管气管和血管的连接口。
    1. 设置一个由压缩空气驱动的文丘里喷射装置，以在人工胸腔内产生负压。
      注意：通气控制模块（VCM）可独立调节吸气压、呼气末压、呼吸频率以及吸气时间与总呼吸周期时....

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结果

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离体肺灌注系统可对器官进行操作，以进行活检、从灌注液中采集样本，并实时收集生理参数数据。该离体系统可用于验证多种假设，涉及肺部的不同功能和生理现象，从代谢和酶活性到肺水肿形成以及肺移植器官的保存时间等研究均可应用。

图1 展示了完全组装的离体肺灌注系统示意图，包括通气系统和计算数据采集系统。该系统的灌注部分可确保灌注液持续流经离体肺组织。通过肺动脉插管实现灌注液的流入，而灌注液的流出则通过左心房插管完成。灌注液由滚压泵推动，依次流经热交换器、除泡阱，进入肺动脉，最终到达肺血管床。系统的通气部分则使通气介质持续流经气流传感器远端，经由气管插管直接进入肺部。

图2 显示MAO的浓度（图2A）和 5-HT（图2B在4 °C下保存24小时的离体肺中，通过ELISA分析不同时间点获取的血管内液体样本中.......

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讨论

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本研究展示了离体肺灌注系统的总体概况，这是肺生理学研究中的一项关键技术。离体肺灌注系统在应用上具有高度的灵活性，可用于评估多种参数，适用于检验广泛科学假设的需求15。作为一种在全球范围内广泛应用的研究工具，离体肺系统在近十年中进一步确立了其在器官特异性评估中的重要性，并且其应用范围已扩展至前沿技术与新型疗法的延伸领域，包括间充质干细胞16和CRISPR/Cas9基因组编辑技术17等。当前体外肺灌注（ex vivo lung perfusion）的研究领域广泛涵盖抗炎策略、通气相关损伤的管理与预防、抗排斥治疗以及抗肺水肿效能等方面15。

正确组装仪器是确保数据准确采集的必要条件。如图1所示，整个系统由一个连接至通风系统的负压湿化腔室，以及一个分别模拟肺部呼吸和循环功能的灌注系统组成。两个系统均连接至数据采集系统，该系统.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢 Bettina Sommer Cervantes 博士在撰写本文手稿过程中提供的支持，以及 Kitzia Elena Lara Safont 在插图方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-Stop Tygon E-Lab 软管，内径 3.17 mm，每包 12 根，黑白双色Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1864
IPL-4 正压通气适配器Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
IPL-4 正压通气适配器Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4312
IPL-4 负压通气期间向气管供应不同于室内外空气的气体混合物的替代无压供气装置Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4309
兔至胎猪离体灌注肺基础装置Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4138
牛血清 A2:D41 白蛋白冻干粉sigma3912500 g
氯化钙，CaCl2·2H2OJT Baker10035-04-8
冻存管Corning4306592 mL
D-葡萄糖，C6H12O6sigmaG5767
差分低压换能器 DLP2.5，量程 ±2.5 cmH2O，HSE 接口Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-3882
差分压力换能器 MPX，量程 ±100 cmH2O，HSE 接口Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0064
Eppendorf 管
色谱纯无水乙醇Caledon
Falcon 管14 mL
哈佛蠕动泵 P-230（含控制箱和 P-230 电机驱动器）Hugo Sachs Elektronik (HSE)70-7001
加热式线性气流传感器，流量范围 0 至 10 L/minHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9349
单气流传感器加热控制器，230 VAC，50 HzHugo Sachs Elektronik (HSE)59-9703
肝素PISA5000 UI
高效液相色谱柱（C18 100A 5U）Alltech98121213150 mm × 4.6 mm
亲水性注射器滤器MillexSLLGR04NL4 mm
IPL-4 离体兔至胎猪肺核心系统，230Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
IPL-4 离体兔至胎猪肺核心系统，230 VHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4296
带烧结头和软管的夹套玻璃缓冲液储液瓶，6.0 LHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0322
劳达恒温循环器，型号 E-103，230 V/50 Hz，浴槽体积 3 L，温度范围 20 至 150°CHugo Sachs Elektronik (HSE)73-0125
带篮式结构的兔左心房插管，外径 5.9 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4162
用于 PLUGSYS 模块的低量程血压换能器 P75Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0020
七水合硫酸镁，MgSO4·7H2OJT Baker10034-99-8
微量离心管Corning430909
IPL-4 负压通气控制选件，含压力调节器Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-4298
新西兰兔
PISABENTAL（戊巴比妥钠）PISAQ-7833-215
PLUGSYS 机箱，型号 603*7Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0045
PLUGSYS TCM 时间计数模块Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1750
PLUGSYS 换能器放大模块（TAM-A）Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-0065
PLUGSYS 换能器放大模块（TAM-D）Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1793
PLUGSYS VCM-4R 通气控制模块，含压力调节器Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-1755
氯化钾，KClJT Baker3040-01
磷酸二氢钾，KH2PO4JT Baker7778-77-0
PROCIN（盐酸赛拉嗪）PISAQ-7833-099
带篮式结构的兔肺动脉插管，外径 4.6 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4161
手术刀片
5-羟色胺 5-HT
灌注伺服控制器（SCP）Hugo Sachs Elektronik (HSE)73-2806
snap cap 微量离心管Costar36201.7 mL
碳酸氢钠，NaHCO3sigmaS6014
氯化钠，NaClsigmaS9888
7.5 号外科手套
8 号外科手套
Taygon 软管Masterflex
兔气管插管，外径 5.0 mmHugo Sachs Elektronik (HSE)73-4163

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
  2. Nelson, K., et al.

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