从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子 F420 以分析多谷氨酸尾链长度

摘要

针对从纯培养物中提取辅因子 F₄₂₀ 的方法进行了优化，用于在纯培养和环境样品中对 F₄₂₀ 尾链长度进行液相色谱分离与分析。

摘要

辅因子 F₄₂₀ 作为氢负离子载体，在多种细菌和古菌类群的初级与次级代谢中发挥核心作用。该辅因子最著名的功能是在产甲烷过程中促进热力学上难以进行的反应。由于不同生物体中其多谷氨酸侧链的长度存在差异，因此对侧链长度的分析可能成为区分和表征不同类群及代谢途径的有力工具。本文所述方案描述了辅因子 F₄₂₀ 的提取及其检测方法的优化，该方法采用固相萃取联合高效液相色谱分析，无需依赖培养或分子生物学手段。该方法已应用于获取土壤、厌氧污泥及纯培养物中微生物群落辅因子 F₄₂₀ 表达的额外信息，并通过加标实验进行了验证。研究成功获得了在可控的产甲烷纯培养物以及厌氧消化污泥和土壤等环境样品中，氢营养型和乙酸裂解型产甲烷菌不同的 F₄₂₀ 侧链长度分布图谱。

引言

F₄₂₀ 是一种广泛存在但常被忽视的辅因子，在生物体的初级和次级代谢过程中作为必需的双电子氢化物载体发挥作用 古菌 和 细菌^1,2. F₄₂₀ 是一种5-脱氮黄素，结构上与黄素类似，其化学和生物学性质更接近于NAD⁺ 或 NADP⁺由于异咯嗪环5号位的氮被碳取代，它成为一种强还原剂，因此表现出-340 mV的低标准氧化还原电位^1,3. F₄₂₀ 包含一个5-脱氮黄素环和一个2-磷酸-L-乳酸连接基团（F₄₂₀-0)。可在该分子上连接一个含有 n+1 个谷氨酸单体的寡聚谷氨酸链（F₄₂₀-n+1⁴.

长期以来，辅因子 F₄₂₀ 仅被认为存在于古菌（Archaea）和放线菌（Actinobacteria）中。这一观点现已基本被推翻。近期研究表明，F₄₂₀ 广泛分布于多种栖息环境（如土壤、湖泊和人类肠道）中的变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）以及可能的厚壁菌门（Firmicutes）等需氧和厌氧生物中^1,5。2019年，Braga 等人⁶发现，变形菌Paraburkholderia rhizoxinica 能够产生一种独特的 F₄₂₀ 衍生物，其侧链为3-磷酸甘油酸而非2-磷酸乳酸，这种衍生物可能在多种生境中广泛存在。在古菌（Archaea）域内，F₄₂₀ 已在多个进化分支中被发现，包括产甲烷菌⁷、甲烷氧化菌^8,9 和硫酸盐还原菌¹⁰，并推测其也可在奇古菌门（Thaumarchaeota）中合成¹¹。 F₄₂₀ 最为人熟知的是作为氢营养型和甲基营养型产甲烷过程中必需的氧化还原辅酶。其还原形式（F₄₂₀H₂）可作为电子供体，用于还原亚甲基四氢甲烷蝶呤（methylene-H₄MPT，Mer）和亚甲基-H₄MPT^12,13。此外，F₄₂₀H₂ 还可在含有细胞色素的产甲烷菌中作为非依赖氢气的电子传递链中的电子载体^12,14。同时，F₄₂₀ 的氧化形式在420 nm激发光下会发出特征性的蓝绿色荧光，便于在显微镜下检测产甲烷菌（图1）。由于其具有较低的氧化还原电位，F₄₂₀ 能够实现以下功能：（i）介导多种原本难以还原或有毒的有机化合物的外源性还原；（ii）在链霉菌属（Actinobacteria 门）中参与四环素和林可酰胺类抗生素或植物毒素的合成；（iii）在分枝杆菌（Actinobacteria 门）中增强对氧化应激、亚硝化应激或其他不利条件的耐受性^{1,5,15,16,17,18,19,20,21,22}。因此，依赖 F₄₂₀ 的氧化还原酶在工业、制药领域以及污染环境的生物修复中具有广阔的应用前景^1,23。尽管已有上述新发现，F₄₂₀ 辅因子在放线菌（Actinobacteria）或其他细菌门类中的确切功能仍知之甚少。

F₄₂₀ 的生物合成至少存在三条途径^2,6,24。最初，该合成途径分为5-脱氮黄素的生物合成和2-磷酸乳酸代谢两个分支。F₄₂₀ 分子的活性部分由F_O合成酶催化合成，其底物为酪氨酸和5-氨基-6-核糖基氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮，产物为处于黄素单核苷酸水平的发色团F_O。在目前公认的乳酸代谢分支中，L-乳酸由L-乳酸激酶（CofB）催化磷酸化生成2-磷酸-L-乳酸；随后，2-磷酸-L-乳酸在2-磷酸-L-乳酸鸟苷酰转移酶（CofC）的作用下发生鸟苷酰化，生成L-乳酰-2-二磷酸-5'-鸟苷。下一步，2-磷酸-L-乳酸转移酶（CofD）将L-乳酰-2-二磷酸-5'-鸟苷与F_O连接，形成F₄₂₀-0²。最后，F₄₂₀-0:ɣ-谷氨酰配体酶（CofE）将谷氨酸单体连接到F₄₂₀-0上，生成最终的辅因子⁶，其连接的谷氨酸数量可变^23,25。不同生物体中所连接的谷氨酸残基数表现出不同的模式，产甲烷菌中的谷氨酸链较短，而分枝杆菌中的链较长^2,25,26。通常，产甲烷菌的侧链长度为2至3个谷氨酸残基，在乙酸裂解型产甲烷菌Methanosarcina sp.中最多可达5个；而Mycobacterium sp.中的侧链长度则为5至7个谷氨酸残基^2,25,26,27。然而，最近的研究表明，长链F₄₂₀与F₄₂₀依赖性氧化还原酶的结合亲和力高于短链F₄₂₀；此外，结合后的长链F₄₂₀可提高酶对底物的亲和力，但会降低其催化转换速率²³。

辅因子 F₄₂₀ 的检测通常基于其荧光特性。因此，常采用反相（RP）-HPLC^27,28 分离其寡谷氨酸衍生物。最近，Ney 等人成功地使用四丁基氢氧化铵作为离子对试剂，针对带负电荷的谷氨酸侧链，有效增强了在 RP-HLPC 上的分离效果⁵。本文介绍了一种不仅适用于纯培养物，也适用于多种环境样品（如土壤和消化池污泥）中辅因子 F₄₂₀ 的样品制备、后续裂解、提取、纯化、分离及定量方法。

方案

注意：辅因子 F₄₂₀ 的提取与分析包括三个步骤：样品裂解、通过固相萃取（SPE）对辅因子进行预纯化，以及通过荧光检测的离子配对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）检测辅因子。在开始之前，请按照表1中的说明准备材料和试剂。

1. 样品裂解

1. 将最多 5 g 样品加入适当的管中（例如 50 mL 锥形管）。
2. 向样品中加入 5 mL 裂解缓冲液（2× 储存液，表 1）。
3. 用蒸馏水定容至终体积 10 mL，使终浓度达到 0.5 g·mL^-1。
4. 将稀释后的样品涡旋振荡 20 秒。
5. 在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
6. 对于森林土壤等干燥样品，高压灭菌后用蒸馏水定容至终体积 20 mL，并涡旋振荡稀释后的样品。
   ​注意：高压灭菌过程中温度升高可能导致管子破裂。

2. 通过固相萃取（SPE）对辅因子 F₄₂₀ 进行预纯化

注意：固相萃取（SPE）的所有步骤均在室温下进行

1. 将样品冷却至室温。
2. 将灭菌后的样品在11,000 x g条件下离心5分钟 g.
3. 准备填充有100 mg弱阴离子混合模式聚合物吸附剂的5 mL固相萃取柱。
4. 用3 mL甲醇（平衡溶液）平衡阴离子交换剂 表1).
5. 用 3 mL 蒸馏水（平衡溶液）平衡阴离子交换剂， 表1).
6. 将离心后裂解液的上清液最多9.0 mL上样至固相萃取柱（SPE柱）。
7. 用 5 mL 25 mM 醋酸铵（SPE 洗涤液 1）洗去杂质， 表1).
8. 洗去 用5 mL甲醇（SPE洗涤液2）洗去杂质， 表1).
9. 洗脱辅因子 F₄₂₀ 在1.0 mL洗脱缓冲液中（表1).
   注意：请现配洗脱缓冲液。由于施加的真空及洗脱缓冲液较高的蒸气压，不同样品间的洗脱体积可能存在差异。为确保所有样品最终体积一致，建议在洗脱前后称量收集管重量，计算实际洗脱体积，并通过添加洗脱缓冲液补足体积差异。

3. 辅因子 F₄₂₀ 的检测

1. 将烘箱温度设置为 40 °C，荧光检测器设置为激发波长 420 nm、发射波长 470 nm。使用流动相 A 和 B（表 1）以梯度模式实现分离：0–3 分钟：26% B；3–24 分钟：26%–50% B；24–25 分钟：50% B；25–27 分钟：50%–26% B；27–35 分钟：26% B，流速为 0.75 mL·min^-1。
   注意：在进样前，需用至少 3 倍柱体积的 74% 流动相 A 和 26% 流动相 B（表 1）冲洗色谱柱，以确保色谱柱条件充分平衡。
   1. 使用孔径为 0.22 µm 的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜将固相萃取（SPE）洗脱液过滤至高效液相色谱（HPLC）小瓶中。
      注意：推荐使用孔径为 0.22 µm 的聚四氟乙烯（PTFE）滤膜。
   2. 将 50 µL 洗脱样品注入高效液相色谱（HPLC）系统，用于分析辅因子 F₄₂₀ 的组成和浓度。
      注意：由于本实验方案未使用定量标准品，样品及变体需通过峰面积进行比较。

结果

将嗜热产甲烷古菌（Methanosarcina thermophila）和Methanoculleus thermophilus的纯培养物在合适的培养基中进行培养，具体方法如前所述^29,30。Methanosarcina thermophila以甲醇作为能源，而Methanoculleus thermophilus则在H₂/CO₂条件下培养。通过显微镜观察检测其生长情况，并通过气相色谱法测定甲烷（CH₄）产量以评估其活性，检测方法如前所述³¹。纯培养物用于按照本文所述方案提取辅因子F₄₂₀。此外，还于2020年秋季采集了环境样品，包括中温厌氧消化反应器污泥样品（奥地利采尔的污水处理厂；有关污泥参数的详细信息请参见文献³²）、农业利用的草地土壤样品（奥地...

讨论

对于产甲烷纯培养物中辅因子 F₄₂₀ 的评估，可通过显微观察来可视化相关微生物的生长与活性（荧光显微镜）（图1）。对于来自自然环境的样品，由于其他荧光微生物、有机和无机颗粒的干扰，使用显微镜检测或定量 F₄₂₀ 的应用受到限制。在此情况下，提取 F₄₂₀ 并随后采用高效液相色谱法（HPLC）进行荧光分析（如先前所述⁵），不仅可提供辅因子 F₄₂₀ 的总浓度信息，还可获得其多谷氨酸侧链长度的分布情况。

对于辅因子 F₄₂₀ 的提取，压力-温度处理被证明具有很高的效率（图2），且与先前的研究结果一致^5,27,33。通过该方法并结...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌器
配备梯度模块、柱温箱和荧光检测器的生物相容性高效液相色谱系统	Shimadzu		高效液相色谱系统
可离心50 mL “Falcon” 管（11,000 rcf）的离心机及转子，以及相应的离心管
高效液相色谱柱：Gemini NX C18，5 μm，150 × 3 mm	Phenomenex		高效液相色谱柱
用于高效液相色谱分析前去除颗粒物的聚四氟乙烯滤膜（孔径0.22 µm）
固相萃取用填料：Strata-X-AW 33 μm，弱阴离子混合模式聚合物吸附剂	Phenomenex		弱阴离子混合模式聚合物吸附剂
用于固相萃取的真空 manifold 装置及相应的收集管			固相萃取设备
涡旋混合器