从产甲烷纯培养物和环境样品中提取辅因子 F420 以分析多谷氨酸尾链长度

摘要

针对从纯培养物中提取辅因子 F₄₂₀ 的方法进行了优化，用于在纯培养和环境样品中对 F₄₂₀ 尾链长度进行液相色谱分离与分析。

摘要

辅因子 F₄₂₀ 作为氢负离子载体，在多种细菌和古菌类群的初级与次级代谢中发挥核心作用。该辅因子最著名的功能是在产甲烷过程中促进热力学上难以进行的反应。由于不同生物体中其多谷氨酸侧链的长度存在差异，因此对侧链长度的分析可能成为区分和表征不同类群及代谢途径的有力工具。本文所述方案描述了辅因子 F₄₂₀ 的提取及其检测方法的优化，该方法采用固相萃取联合高效液相色谱分析，无需依赖培养或分子生物学手段。该方法已应用于获取土壤、厌氧污泥及纯培养物中微生物群落辅因子 F₄₂₀ 表达的额外信息，并通过加标实验进行了验证。研究成功获得了在可控的产甲烷纯培养物以及厌氧消化污泥和土壤等环境样品中，氢营养型和乙酸裂解型产甲烷菌不同的 F₄₂₀ 侧链长度分布图谱。

引言

F₄₂₀ 是一种广泛存在但常被忽视的辅因子，在生物体的初级和次级代谢过程中作为必需的双电子氢化物载体发挥作用 古菌 和 细菌^1,2. F₄₂₀ 是一种5-脱氮黄素，结构上与黄素类似，其化学和生物学性质更接近于NAD⁺ 或 NADP⁺由于异咯嗪环5号位的氮被碳取代，它成为一种强还原剂，因此表现出-340 mV的低标准氧化还原电位^1,3. F₄₂₀ 包含一个5-脱氮黄素环和一个2-磷酸-L-乳酸连接基团（F₄₂₀-0)。可在该分子上连接一个含有 n+1 个谷氨酸单体的寡聚谷氨酸链（F₄₂₀-n+1⁴.

长期以来，辅因子 F₄₂₀ 仅被认为存在于古菌（Archaea）和放线菌（Actinobacteria）中。这一观点现已基本被推翻。近期研究表明，F₄₂₀ 广泛分布于多种栖息环境（如土壤、湖泊和人类肠道）中的变形菌门（Proteo....

方案

注意：辅因子 F₄₂₀ 的提取与分析包括三个步骤：样品裂解、通过固相萃取（SPE）对辅因子进行预纯化，以及通过荧光检测的离子配对反相高效液相色谱法（IP-RP-HPLC）检测辅因子。在开始之前，请按照表1中的说明准备材料和试剂。

1. 样品裂解

1. 将最多 5 g 样品加入适当的管中（例如 50 mL 锥形管）。
2. 向样品中加入 5 mL 裂解缓冲液（2× 储存液，表 1）。
3. 用蒸馏水定容至终体积 10 mL，使终浓度达到 0.5 g·mL^-1。
4. 将稀释后的样品涡旋振荡 20 秒。
5. 在 121 °C 下高压灭菌 30 分钟。
6. 对于森林土壤等干燥样品，高压灭菌后用蒸馏水定容至终体积 20 mL，并涡旋振荡稀释后的样品。
   ​注意：高压灭菌过程中温度升高可能导致管子破裂。

2. 通过固相萃取（SPE）对辅因子 F₄₂₀ 进行预纯化

注意：固相萃取（SPE）的所有步骤均在室温下进行

1. 将样品冷却至室温。
2. 将灭菌后的样品在11,000 x g条件下....

结果

将嗜热产甲烷古菌（Methanosarcina thermophila）和Methanoculleus thermophilus的纯培养物在合适的培养基中进行培养，具体方法如前所述^29,30。Methanosarcina thermophila以甲醇作为能源，而Methanoculleus thermophilus则在H₂/CO₂条件下培养。通过显微镜观察检测其生长情况，并通过气相色谱法测定甲烷（CH₄）产量以评估其活性，检测方法如前所述³¹。纯培养物用于按照本文所述方案提取辅因子F₄₂₀。此外，还于2020年秋季采集了环境样品，包括中温厌氧消化反应器污泥样品（奥地利采尔的污水处理厂；有关污泥参数的详细信息请参见文献³²）、农业利用的草地土壤样品（奥地.......

讨论

对于产甲烷纯培养物中辅因子 F₄₂₀ 的评估，可通过显微观察来可视化相关微生物的生长与活性（荧光显微镜）（图1）。对于来自自然环境的样品，由于其他荧光微生物、有机和无机颗粒的干扰，使用显微镜检测或定量 F₄₂₀ 的应用受到限制。在此情况下，提取 F₄₂₀ 并随后采用高效液相色谱法（HPLC）进行荧光分析（如先前所述⁵），不仅可提供辅因子 F₄₂₀ 的总浓度信息，还可获得其多谷氨酸侧链长度的分布情况。

对于辅因子 F₄₂₀ 的提取，压力-温度处理被证明具有很高的效率（图2），且与先前的研究结果一致^5,27,33。通过该方法并结.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高压灭菌器
配备梯度模块、柱温箱和荧光检测器的生物相容性高效液相色谱系统	Shimadzu		高效液相色谱系统
可离心50 mL “Falcon” 管（11,000 rcf）的离心机及转子，以及相应的离心管
高效液相色谱柱：Gemini NX C18，5 μm，150 × 3 mm	Phenomenex		高效液相色谱柱
用于高效液相色谱分析前去除颗粒物的聚四氟乙烯滤膜（孔径0.22 µm）
固相萃取用填料：Strata-X-AW 33 μm，弱阴离子混合模式聚合物吸附剂	Phenomenex		弱阴离子混合模式聚合物吸附剂
用于固相萃取的真空 manifold 装置及相应的收集管			固相萃取设备
涡旋混合器