此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.
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本文内容
摘要
摘要
靶向人类癌症中关键蛋白质的新型药物研发正在从根本上改变癌症治疗方式。然而，在这些药物投入使用之前，必须在特定癌症类型中验证其靶向蛋白是否可作为有效的治疗靶点。这种验证通常是通过在基因工程小鼠（GEM）癌症模型中敲除编码候选治疗靶点的基因，并评估其对肿瘤生长的影响来实现的。然而，传统基因敲除中的胚胎致死性以及条件性基因敲除中的嵌合现象等技术问题常常限制了该方法的应用。为了克服这些局限，研究人员建立了一种方法，可在由GEM模型产生的恶性外周神经鞘瘤（MPNST）短期培养物中，对带有loxP位点的、具有胚胎致死效应的目的基因进行消融。
本文描述了如何建立具有适当基因型的小鼠模型，从这些动物中获得短期肿瘤培养物，并利用表达Cre重组酶和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的腺病毒载体切除带有loxP位点的胚胎致死基因。随后详细阐述了通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化腺病毒感染的细胞，以及定量分析基因敲除对细胞增殖、存活率、转录组和原位同种移植瘤生长的影响。这些方法为识别和验证治疗靶点提供了一种高效且可推广的策略 体外 和 体内 这些方法还可提供一种可再生的低传代肿瘤来源细胞，且其数量减少 体外 生长假象。这使得靶基因在多种生物学过程中的生物学功能得以研究，例如迁移、侵袭、转移以及由分泌组介导的细胞间通讯。
引言
在过去二十年之前，人类癌症的治疗主要依赖于放射疗法和化学治疗药物，这些方法通过损伤DNA或抑制DNA合成，广泛地靶向快速增殖的细胞群体。尽管这些方法确实能够抑制癌细胞的生长，但它们也会对正常快速增殖的细胞类型（如肠上皮细胞和毛囊细胞）产生有害的副作用。近年来，癌症治疗开始采用能够精确靶向个体患者肿瘤生长所依赖的关键信号通路中特定蛋白质的化学治疗药物。这种策略通常被称为"精准医学"，已推动了单克隆抗体和小分子抑制剂种类的不断扩展。这些药物能有效抑制肿瘤细胞的增殖与存活，同时避免传统化疗药物和放疗对正常细胞类型造成的有害副作用。用于治疗人类癌症的单克隆抗体最常靶向细胞表面分子，例如生长因子受体1（如跨膜受体酪氨酸激酶这一大家族）以及免疫应答调节因子2（如程序性死亡蛋白1、程序性死亡配体1）。小分子抑制剂则可靶向细胞表面蛋白或细胞内信号蛋白3。然而，为了有效使用这些新型治疗药物，必须首先确认特定癌症的生长依赖于候选治疗药物所靶向的分子。
尽管这些新型治疗药物的作用更为特异，但其中许多仍会抑制多种蛋白质的功能。此外，针对特定蛋白质，往往存在多种在有效性和特异性上各不相同的药物可供选择。因此，在临床前研究中，采用基因敲除等其他方法来验证候选蛋白是否适合作为治疗靶点是十分必要的。其中一种特别有效的验证方法，是在能够自发产生特定类型....
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方案
在对小鼠进行任何操作之前，所有操作程序必须经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本论文中描述的方案已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案由经过适当培训的人员按照南卡罗来纳医科大学的机构动物护理指南执行。
1. 生成在 Erbb4 flox 等位基因上纯合且可发展为恶性周围神经鞘瘤的小鼠
- 产生 P 的 F1 代0-GGFβ3Trp53+/-;Erbb4fl/+ 通过交配P动物0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠7 与 Erbb4fl/fl 小鼠11。使用庞尼特方格（图1) 以指导育种方案，确保产生足够数量的具有目标 P 的雄性和雌性 F1 代仔鼠0-GGFβ3；Trp53+/-;Erbb4fl/+ 基因型
- 通过尾部组织取样提取基因组DNA以鉴定F1代子代基因型 按照……收集 ....
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结果
图4 展示了使用 Ad5CMV-eGFP 腺病毒或 Ad5CMV-Cre/eGFP 腺病毒转导 P0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl/fl MPNST 细胞后获得的典型结果（图4A）。通过荧光显微镜观察可识别表达 eGFP 的细胞，同时通过相差显微镜在相同视野下计数总细胞数量，放大倍数分别为10倍（上方）和40倍（下方）。如有需要，可据此计算表达 eGFP 的细胞百分比。典型的流式细胞术（FACS）输出数据见于补充图S2。经流式分选后，表达 eGFP 的细胞比例将显著提高，每个视野中几乎所有细胞均表达 eGFP。根据转染效率的不同，Cre 介导基因敲除后的典型 PCR 基因分型结果可能为完全基因敲除（100% 效率），或为诱导与未诱导细胞组成的混合群体（<100% 效率），而对照组转导结果则仅表达 GFP，基因型为 fl/fl（图.......
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讨论
本文所述的详细方法是利用 MPNSTs 的 GEM 模型开发的。然而，如果感兴趣的肿瘤组织能够被分散成单个细胞，则这些方法可轻松适用于在 GEM 模型中发生的多种肿瘤类型。重要的是要确保条件性等位基因不会导致：i）生存期缩短，从而难以获得足够数量的小鼠用于肿瘤筛选；或 ii）肿瘤潜伏期延长，从而难以获得足够数量的荷瘤小鼠。如果条件性等位基因不影响生存期，则两个队列的生存期应相当。如果其对肿瘤潜伏期无影响，则两个队列中出现荷瘤小鼠的数量应相近，且时间进程相似。
类似的方法已被用于研究神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤，通过使用条件性基因敲除和他莫昔芬诱导的Cre动物来构建可诱导的条件性基因敲除动物模型。33,34与这些研究的不同之处，除了此前讨论过的使用他莫昔芬诱导 Cre 之外，在于这些研究聚焦于 NF1 组织特异性敲除条件下的肿瘤发生。尽管本研究及上述其他研究均使用 GEMM 构建的肿瘤模型，但差异在于所提出的问题。在本方案中，我们并非研究 NF1 缺失在恶性周围神经鞘.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了来自美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353，R01 NS109655）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804）、美国国防部（X81XWH-09-1-0086，W81XWH-11-1-0498，W81XWH-12-1-0164，W81XWH-14-1-0073 和 W81XWH-15-1-0193）以及儿童肿瘤基金会（2014-04-001 和 2015-05-007）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ad5CMV-eGFP | 基因转移载体中心，爱荷华大学 | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | 基因转移载体中心，爱荷华大学 | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 二抗 | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor 生物信息学开源软件 | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | 用于步骤 4.4 的替代统计分析工具 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo 图像细胞仪 | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | 螯合剂混合物 |
| DAB 染色试剂盒 | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID（注释、可视化与集成发现数据库） | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | 用于步骤 4.5 的功能富集分析软件 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq 及缓冲液（基因型 PCR） | Thermo/Fisher | EP0701 和 K1072 | |
| erbB4 抗体 | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 抗体 | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 抗体 | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS 分选仪 | BD Biosciences | Aria II | |
| 福斯科林（Forskolin） | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace 工具与数据源 | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | 用于步骤 4.5 的多种开源生物信息学工具通用资源 |
| 谷氨酰胺（Glutamine） | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla 基因本体富集分析与可视化工具 | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | 用于步骤 4.5 的功能富集分析软件 |
| GSEA 基因集富集分析 | Broad 研究所 | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | 用于步骤 4.5 的功能富集分析软件 |
| HSD：无胸腺裸鼠 FOxn1nu | Envigo（前身为 Harlan Labs） | 69 | |
| Illumina HiSeq2500（下一代 DNA 测序仪） | Illumina | Hi Seq 2500 | 用于步骤 4.2 的 DNA 测序仪 |
| Lasergene：ArrayStar 基因表达与变异分析 | DNAStar LaserGene 软件 | N/A | 用于步骤 4.4 的软件统计与标准化分析 |
| Lasergene：SeqMan NGen 序列比对组装 | 用于步骤 4.3 的软件比对 | N/A | 用于步骤 4.3 的软件比对 |
| Matrigel，低生长因子基底膜基质 | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | 本实验室制备 | 由 SLC 生成，也可从 R & D Systems（396-HB-050/CF）商业购买。 | |
| 核染料 Hoechst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther 基因本体分类系统 | Panther | http://pantherdb.org | 用于步骤 4.5 的功能富集分析软件 |
| Partek（BWA 比对器与分析器） | Partek，Ver 7 | N/A | 用于步骤 4.3 的软件比对及统计/标准化分析 |
| 青霉素/链霉素（Pen/Strep） | Corning | 30-002-Cl | |
| 引物 1：5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ | Eurofins Genomics | 引物 1 + 2：250 bp ErbB4 敲除产物和 350 bp Floxed ErbB4 产物； | |
| 引物 2：5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ | Eurofins Genomics | 引物 1 + 2：250 bp ErbB4 敲除产物和 350 bp Floxed ErbB4 产物； | |
| 引物 3：5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA | Eurofins Genomics | 引物 1 + 3：350 bp 野生型 ErbB4 产物。 | |
| 碘化丙啶（Propidium Iodine） | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteome Profiler 磷酸化激酶阵列 | R&D Systems | ARY003B | |
| 实时荧光检测（Real time glo） | Promega | G9712 | 生物发光细胞活力检测 |
| ToppGene 套件 | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | 用于步骤 4.5 的功能富集分析软件 |
| Trizol（基于酸-硫氰酸胍-苯酚和氯仿的试剂） | Invitrogen | 15596026 | |
| 酪胺信号放大试剂盒（Tyramide Signal Amplification Kit） | Perkin Elmer | NEL721001EA |
参考文献
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblast....
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