需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

1.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62740

⸱

2021年8月25日

 ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Pediatrics and Neurology, Perelman School of Medicine of the University of Pennsylvania, 3Division of Child Neurology, Children's Hospital of Philadelphia

本文内容

摘要

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

摘要

靶向人类癌症中关键蛋白质的新型药物研发正在从根本上改变癌症治疗方式。然而，在这些药物投入使用之前，必须在特定癌症类型中验证其靶向蛋白是否可作为有效的治疗靶点。这种验证通常是通过在基因工程小鼠（GEM）癌症模型中敲除编码候选治疗靶点的基因，并评估其对肿瘤生长的影响来实现的。然而，传统基因敲除中的胚胎致死性以及条件性基因敲除中的嵌合现象等技术问题常常限制了该方法的应用。为了克服这些局限，研究人员建立了一种方法，可在由GEM模型产生的恶性外周神经鞘瘤（MPNST）短期培养物中，对带有loxP位点的、具有胚胎致死效应的目的基因进行消融。

本文描述了如何建立具有适当基因型的小鼠模型，从这些动物中获得短期肿瘤培养物，并利用表达Cre重组酶和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的腺病毒载体切除带有loxP位点的胚胎致死基因。随后详细阐述了通过荧光激活细胞分选（FACS）纯化腺病毒感染的细胞，以及定量分析基因敲除对细胞增殖、存活率、转录组和原位同种移植瘤生长的影响。这些方法为识别和验证治疗靶点提供了一种高效且可推广的策略 体外 和 体内 这些方法还可提供一种可再生的低传代肿瘤来源细胞，且其数量减少 体外 生长假象。这使得靶基因在多种生物学过程中的生物学功能得以研究，例如迁移、侵袭、转移以及由分泌组介导的细胞间通讯。

引言

在过去二十年之前，人类癌症的治疗主要依赖于放射疗法和化学治疗药物，这些方法通过损伤DNA或抑制DNA合成，广泛地靶向快速增殖的细胞群体。尽管这些方法确实能够抑制癌细胞的生长，但它们也会对正常快速增殖的细胞类型（如肠上皮细胞和毛囊细胞）产生有害的副作用。近年来，癌症治疗开始采用能够精确靶向个体患者肿瘤生长所依赖的关键信号通路中特定蛋白质的化学治疗药物。这种策略通常被称为"精准医学"，已推动了单克隆抗体和小分子抑制剂种类的不断扩展。这些药物能有效抑制肿瘤细胞的增殖与存活，同时避免传统化疗药物和放疗对正常细胞类型造成的有害副作用。用于治疗人类癌症的单克隆抗体最常靶向细胞表面分子，例如生长因子受体1（如跨膜受体酪氨酸激酶这一大家族）以及免疫应答调节因子2（如程序性死亡蛋白1、程序性死亡配体1）。小分子抑制剂则可靶向细胞表面蛋白或细胞内信号蛋白3。然而，为了有效使用这些新型治疗药物，必须首先确认特定癌症的生长依赖于候选治疗药物所靶向的分子。

尽管这些新型治疗药物的作用更为特异，但其中许多仍会抑制多种蛋白质的功能。此外，针对特定蛋白质，往往存在多种在有效性和特异性上各不相同的药物可供选择。因此，在临床前研究中，采用基因敲除等其他方法来验证候选蛋白是否适合作为治疗靶点是十分必要的。其中一种特别有效的验证方法，是在能够自发产生特定类型癌症的基因工程动物模型中，敲除编码该候选蛋白的基因。如果使用具有功能缺失突变的小鼠（包括天然突变或经基因工程引入的敲除突变[ "敲除"]，或由基因捕获技术引入的无效突变） 可获得且小鼠可存活至成年。遗憾的是，满足这些条件的基因完全敲除小鼠往往无法获得，通常是因为该基因的完全缺失会导致胚胎期死亡或出生后早期死亡。在此情况下，可将易发生目标肿瘤类型的小鼠与关键基因片段两侧带有 loxP 位点的小鼠进行杂交（"条件性等位基因（floxed）")，可通过向肿瘤细胞中引入表达Cre重组酶的转基因来实现基因的特异性敲除（条件性基因敲除）。该策略具有多项优势。首先，若存在一种仅在肿瘤细胞中表达、而在传统基因敲除导致死亡的细胞类型中不表达的Cre驱动系统，则该方法有可能用于验证候选治疗靶点。其次，在肿瘤细胞中特异性敲除编码候选蛋白的基因，而不在肿瘤微环境中的其他组分（如肿瘤相关成纤维细胞或免疫细胞）中敲除，可使研究者区分该治疗靶点的细胞自主性与非细胞自主性效应。最后，使用他莫昔芬诱导型Cre驱动系统（CreERT2) 使研究者能够在肿瘤发展的不同阶段删除目的基因，并确定候选治疗药物最有可能发挥疗效的时间窗口。

遗憾的是，在基因工程小鼠（GEM）模型中产生的肿瘤使用条件性基因敲除技术时，也存在一些技术问题。例如，可能缺乏仅在肿瘤细胞中表达、同时避免在维持生命所必需的正常细胞中发生基因删除的Cre驱动工具。另一个可能被低估的问题是，Cre和CreERT2驱动工具在小鼠中常常对floxed等位基因产生不均一的删除效果，导致GEM癌症模型中出现无效突变的嵌合现象。当这种情况发生时，目标基因未被敲除的肿瘤细胞将继续快速增殖，从而在肿瘤中占据优势，超过已被敲除等位基因的肿瘤细胞。Cre驱动品系中的嵌合现象可能源于目标细胞谱系中Cre表达的非普遍性，也可能独立于Cre表达，由单个细胞中重组失败所致4。这是Cre驱动工具中一种已知的、依赖于细胞类型的特性，在实验设计和数据分析时应予以充分考虑。嵌合现象可能掩盖基因敲除的真实效应，导致研究者错误地认为目标基因对肿瘤细胞的增殖和/或存活并非必需，因而不是一个有效的治疗靶点。

在之前的一项研究中，曾遇到上述多个问题，该研究试图确定受体酪氨酸激酶erbB4是否为恶性周围神经鞘瘤（MPNST）细胞中的潜在治疗靶点5在这些研究中，使用了表达一种转基因的小鼠，该转基因在施万细胞特异性髓鞘蛋白零启动子（P0 promoter）的调控下编码神经调节蛋白-1（neuregulin-1, NRG1）亚型胶质细胞生长因子-β3（glial growth factor-β3, GGFβ3）。0-GGFβ3 小鼠）。P0-GGFβ3 小鼠会发展出多个丛状神经纤维瘤，这些肿瘤通过模拟常染色体显性遗传肿瘤易感综合征 1 型神经纤维瘤病（NF1）患者中所见的神经纤维瘤发病过程以及丛状神经纤维瘤向恶性周围神经鞘瘤（MPNST）进展的过程，最终转化为 MPNST6与具有特定基因型的小鼠杂交时 Trp53 无效突变，所产生的P0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠发生恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs） 从头合成 如所见 顺式-Nf1+/-;Trp53+/- 小鼠

这些恶性周围神经鞘瘤再现了从世界卫生组织（WHO）2级到WHO 4级病变的人类疾病进展过程7. 在 P0在 GGFβ3 小鼠中，恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）出现在三叉神经（58%）和脊髓背根神经（68%）已有的丛状神经纤维瘤内7；发生在P中的MPNST0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠具有高度相似的分布。在人类中，恶性周围神经鞘瘤（MPNSTs）最常发生于坐骨神经，其次为臂丛神经、脊神经根、迷走神经、股神经、正中神经、骶丛神经、腘窝闭孔神经以及胫后神经和尺神经。8. 这些GEM模型中的肿瘤分布与人类中的情况略有不同。然而，在P0-GGFβ3 和 P0-GGFβ3Trp53+/- 小鼠在组织学上与人类恶性周围神经鞘瘤（MPNST）完全相同，携带许多在人类MPNST中观察到的相同突变，并重现了NF1患者中神经纤维瘤向MPNST进展的过程。P的生成0-GGFβ3 或 P0-GGFβ3Trp53+/- 小鼠 Erbb4-/- 不可行，因为具有两个的小鼠 Erbb4 无效等位基因导致死亡 在子宫内 在胚胎第10.5天，继发于心脏缺陷9。因为拯救 Erbb4 通过引入心脏特异性表达在心脏中 Erbb4 转基因（α-肌球蛋白重链（MHC）-Erbb4）可产生具有活力的 Erbb4-/- 小鼠10，生成具有复杂P的小鼠0-GGFβ3Trp53+/-α-MHC-Erbb4;Erbb4-/- 尝试进行基因分型。

然而，杂交配对并未产生符合预期孟德尔比例的小鼠，表明目标基因型具有致死效应。因此，P0-GGFβ3；Trp53+/- 带有flox位点的小鼠 Erbb4 等位基因11 和一个 CreERT2 尝试使用驱动程序以允许删除 Erbb4 在这些小鼠发生的恶性外周神经鞘瘤（MPNSTs）中。在这些动物中，存在大量具有完整 Erbb4 等位基因仍然存在（嵌合现象）。所观察到的嵌合现象可能是由于他莫昔芬递送效率低下，导致组织内重组效率存在差异。此外，自发性代偿机制的可能性也可能通过绕过对他莫昔芬介导重组的依赖，进一步促成嵌合现象的发生 Erbb4 表达。缺失可能导致 Trp53 使肿瘤细胞易于发生额外的自发性变化 "允许的" 可能混淆数据解读的突变。由于似乎很可能 Erbb4-完整的MPNST细胞会掩盖消融的后果 Erbb4 在其他肿瘤细胞中，该方法被弃用。

这些障碍促使了一种消融方法的开发 Erbb4 使用表达 Cre 重组酶和 eGFP 的腺病毒转导极早期传代的 MPNST 细胞。可通过 FACS 将这些细胞与未感染细胞分离，从而显著降低基因敲除后的嵌合现象 Erbb4 基因。以下介绍了实现这一目标所采用的方法，以及用于评估基因敲除效果的方法 体外 和 体内，进行了描述。以下方案示例如何制备荷瘤小鼠，以获得携带目的胚胎致死基因条件性等位基因（floxed alleles）的肿瘤 离体 切除前 体内 异体移植物肿瘤生长评估。包括用于分析所产生影响的方法描述 Erbb4 消融对肿瘤细胞增殖、存活及基因表达的影响 体外 增殖、存活以及原位同种移植中的血管生成。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

在对小鼠进行任何操作之前，所有操作程序必须经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本论文中描述的方案已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。该方案由经过适当培训的人员按照南卡罗来纳医科大学的机构动物护理指南执行。

1. 生成在 Erbb4 flox 等位基因上纯合且可发展为恶性周围神经鞘瘤的小鼠

  1. 产生 P 的 F1 代0-GGFβ3Trp53+/-;Erbb4fl/+ 通过交配P动物0-GGFβ3；Trp53+/- 小鼠7 与 Erbb4fl/fl 小鼠11。使用庞尼特方格（图1) 以指导育种方案，确保产生足够数量的具有目标 P 的雄性和雌性 F1 代仔鼠0-GGFβ3；Trp53+/-;Erbb4fl/+ 基因型
  2. 通过尾部组织取样提取基因组DNA以鉴定F1代子代基因型 按照……收集 IACUC 指南，然后使用先前描述的引物进行 PCR 以检测 P0-GGFβ3 转基因12, Trp53 野生型（+）和无效型（-）等位基因7，以及 Erbb4flox 和 Erbb4 野生型等位基因13.
    1. 使用 jacks-lab.mit.edu/protocols 上详述的方法分离尾部DNA。
    2. 使用25 ng DNA、0.25 nM dNTPs、0.02 U/µL Taq聚合酶、每种引物0.5 µM以及1× PCR缓冲液配制PCR反应体系。PCR反应程序如下：95 °C孵育1 min（使基因组DNA变性并激活Taq聚合酶），随后进行35个循环的PCR扩增，每个循环包括94 °C变性10 s、55 °C退火30 s、72 °C延伸40 s，最后在72 °C延伸5 min。反应结束后将样品置于4 °C保存，待用1.2–1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
      注意：退火温度取决于所使用的PCR缓冲体系；建议进行退火温度梯度实验以确定合适的退火温度。
  3. 产生P的F2代0-GGFβ3；Trp53+/-;Erbb4fl/fl 通过交配适当的F1代子代来繁殖动物（P0-GGFβ3；Trp53-/+;Erbb4fl/+彼此之间。
    注意： 图1 展示了用于计算具有目标基因型的F2代子代预期数量的庞尼特方格预测方法。
  4. 鉴定具有目标 P 的动物0-GGFβ3；Trp53-/+;Erbb4fl/fl 基因型，如步骤1.2所述。
  5. 将F2代子代相互交配以维持P系0-GGFβ3Trp53-/+;Erbb4fl/fl 鉴定所有仔鼠的基因型和克隆来源。确认新引入的条件性等位基因（floxed allele）不影响存活率或肿瘤潜伏期。为此，建立群体队列（每队列20只小鼠）的P0-GGFβ3；Trp53+/- 和 P0-GGFβ3Trp53+/-;Erbb4fl/fl 小鼠并监测其存活率和肿瘤发生频率。
  6. 每周多次监测动物，直至达到实验终点（IACUC批准的最大允许肿瘤尺寸或人道终点）。
    1. 在每周监测期间，评估体重、正常的社交和理毛行为以及肿瘤大小。若出现体重减轻，应安排兽医评估。 >体重的10%、社交隔离和弓背。
    2. 当发现荷瘤小鼠并达到人道终点时，采用二氧化碳吸入法对动物实施安乐死，随后进行颈椎脱位，并使用手术刀无菌切除肿瘤。使用游标卡尺测量肿瘤的长、宽、深，并称量肿瘤重量（质量和体积）。操作应迅速，以避免自溶。
  7. 在无菌条件下，使用手术刀采用面包片式切割法将肿瘤组织分为三部分，以获取用于福尔马林固定/石蜡包埋（FFPE）、早期传代培养以及速冻保存的组织样本。图2A).
    1. 确保第1部分（用于早期传代培养生成，步骤1.7.2）约占肿瘤总体积的10%，第2部分（用于固定和免疫组化，步骤1.7.3）占肿瘤总体积的70%，第3部分（用于速冻，步骤1.7.4）占肿瘤总体积的20%。
    2. 取第1节 用于制备低代次培养物的肿瘤组织（见下文）。
    3. 将肿瘤的第2部分在4%多聚甲醛中于4 °C固定过夜，随后包埋于石蜡中（用于诊断性检查的福尔马林固定石蜡包埋组织，FFPE）。
    4. 闪冻切片 3 用于分析检测（例如，通过免疫印迹验证靶向的floxed基因所编码的蛋白是否正常表达）。
  8. 使用苏木精和伊红对5 µm厚的FFPE组织切片进行染色（H&E）由合格的病理学家进行肿瘤诊断确认。如适用，进行免疫组织化学染色（IHC）以确认肿瘤诊断。
    1. 对恶性周围神经鞘膜瘤（MPNSTs）进行S100钙结合蛋白B（S100β）、巢蛋白（nestin）和Y染色体性别决定区（SRY）-box转录因子10（Sox10）免疫染色——这三种标志物在MPNSTs和施万细胞（肿瘤细胞来源）中均有表达5,6,14,15用识别erbB4的抗体对肿瘤进行染色，erbB4是后续步骤中靶向敲除基因所编码的蛋白质。
    2. 为确诊，应由合格的兽医或人类病理学家根据世界卫生组织（WHO）的诊断和分级标准评估所有染色的肿瘤切片5,6,7,16.

2. 在 MPNST 细胞中进行 ex vivo 条件性敲除 Erbb4 等位基因

  1. 将第1部分（步骤1.7.3）中获取的组织置于10 mL预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，冰上保存，随后转移至无菌操作区域，以新鲜采集的恶性周围神经鞘瘤（MPNST）组织建立早期传代培养图2B)16.
    注意：所有后续操作均须在无菌细胞培养罩内进行。
  2. 将肿瘤组织切成 2-4 mm 的小块，在 10 cm 培养皿中吹打 8-10 次2 用10 mL生长培养基处理组织培养皿。将这些制备物在高糖DMEM-10生长培养基（含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、10 µg/mL链霉素和10 IU/mL青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基）中培养，并添加10 nM神经调节蛋白-1β（NRG1β）和2 µM佛司可林。在此阶段加入佛司可林以抑制成纤维细胞等常见污染细胞类型的生长。
  3. 将机械解离的组织和细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养最多 3 天2 在建立早期传代培养时，将细胞置于培养环境中。此时不要分离分散的细胞与残留的组织碎片。
  4. 每3-4天更换一次新鲜培养基。让肿瘤细胞持续增殖，直至形成汇合。
  5. 将早期传代培养物按比例分种到多个培养皿中进行扩增。吸除培养基，用1× dPBS洗涤细胞。随后，每10 cm培养皿加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在室温下消化2–5分钟。2 处理后的细胞培养皿中，轻柔吹打培养物以促进细胞脱落，获得单细胞悬液。
    1. 通过加入 2 mL DMEM-10 培养基终止消化。收集消化后的细胞混合液，转移至 5 mL 无菌离心管中。在 500 × g 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。 g 在室温下。
    2. 将细胞沉淀重悬于 5 mL DMEM-10 中，将细胞分种至 2 到 4 个 10 cm 细胞培养皿中，每个培养皿加入 10 mL 生长培养基（约 1 × 106 每皿细胞数
  6. 经过5次传代（重复步骤2.5）后，使用不含NRG1β和forskolin的生长培养基。取部分细胞培养物用抗S100β抗体进行免疫染色，以确认培养物完全由肿瘤细胞组成。此后所有传代均使用DMEM-10生长培养基维持细胞培养。
  7. 在下一次传代时，对细胞进行计数，并冻存一部分P0-GGFβ3；Trp53+/-;Erbb4fl/fl 来自融合培养物的MPNST细胞（3 × 106 细胞/小瓶
  8. 平板 P0-GGFβ3；Trp53+/-;Erbb4fl/fl 早期传代 MPNST 细胞，密度为 1.5 × 106 每10 cm培养皿中加入细胞，使用DMEM-10生长培养基。
  9.  第0天： （接种后约12–16小时），用2–4 mL dPBS洗涤贴壁培养物，并在10 mL无血清DMEM中加入Ad5CMV-Cre/eGFP或Ad5CMV-eGFP进行感染，感染剂量约为每细胞400斑块形成单位（pfu）（即2 × 10⁸ pfu/mL的病毒液30 µL）10 每10厘米培养皿含pfu病毒数）。消融floxed Erbb4 使用腺病毒在最大耐受病毒浓度（感染复数，MOI）下转导等位基因，MOI值通过实验确定。参考 图2C 有关该消融工作流程的示意图。
  10. 第1天： 约16小时后，向感染混合物中加入10 mL DMEM-10以恢复培养。
  11. 第2-3天 FACS 分选感染细胞，按照核心实验室推荐的方案，在感染后约 48 h 分选 eGFP 阳性细胞。FACS 分选前，先在荧光显微镜下快速检查细胞的 eGFP 信号，以确认培养物已被有效感染（约 50–100% 阳性细胞）。将 FACS 分选后回收的细胞重新接种至 10 cm 培养皿中 组织培养皿；预留一个培养皿用于基因组DNA提取。
  12. 第4-5天： 分选后，将细胞置于组织培养孵育箱中恢复至少24–48小时，然后制备细胞用于后续实验 体外 基于细胞的分析或 体内 嫁接。确认 Erbb4 通过PCR对分选获得的eGFP阳性细胞部分样品提取的基因组DNA进行缺失检测。验证eGFP阳性细胞是否为 ErbB4通过PCR或使用抗erbB4抗体对培养样品进行免疫染色检测为阴性。
    1. 使用标准的酸-胍-苯酚和氯仿法从细胞中分离基因组DNA17.
    2. 通过标准 PCR 鉴别条件性等位基因（floxed） Erbb4 等位基因和消融 Erbb4 等位基因。使用2 ng DNA和20 µM引物1+2，进行40个循环，扩增产生250 bp产物 Erbb4-null 产物和一个 350 bp 的 floxed 产物13在缺乏可靠抗体的情况下，应同时采用PCR和基于抗体的方法来验证基因敲除。
      ​注意：细胞已准备好用于 体外 如下所述的基于细胞的检测方法。以这种方式制备的细胞可进行多种类型的下游分析。以下方案的目的是提供几个示例 体外 和 体内 消融后这些肿瘤细胞的应用 Erbb4 基因

3. Erbb4 等位基因敲除的 MPNST 细胞中的增殖与存活率检测

  1. 在分选后的MPNST细胞接种于多孔板后，使用基于图像的自动细胞计数仪在接下来的七天内进行增殖检测。
    1. 第6天：在96孔板中，每孔接种2,000个细胞，终体积为150 µL（约13,300个细胞/mL）的生长培养基中。每个实验组设置三个重复，并进行4次每日终点检测（3个重复 × 2种条件 × 4天）。
    2. 第7、9、11、13天：使用Hoechst和碘化丙啶（PI）染料对细胞染色，并在自动酶标仪上成像，以计数每孔中的活细胞和死细胞数量。具体操作为：同时使用Hoechst染料对活细胞和死细胞的细胞核进行染色，并使用碘化丙啶（PI）标记死细胞。每天或每隔一天在相同时间点进行所有检测。
      1. 向当天需检测的各孔（例如仅第7天）加入50 µL的4倍浓缩PI/Hoechst染色液（每种染料浓度均为4 µg/mL），在组织培养孵育箱中37 °C孵育30分钟。实验过程中需将培养板避光保存。
        注：Hoechst的染色浓度需根据经验确定，通常范围为1至10 µg/mL，具体取决于细胞类型。
      2. 孵育结束后，使用自动细胞成像仪的相应荧光通道读取染色孔。读取后将培养板放回孵育箱，用于后续时间点（即第9、11、13天）的检测。
      3. 根据所使用的成像系统对染色强度进行定量，并采用以下设置计算死细胞数、活细胞数和总细胞数：蓝色通道（377/50 nm，Hoechst）：总细胞数（活细胞和死细胞）；红色通道（531/40 nm，PI）：仅死细胞；蓝色减去红色（总数减去死细胞数）= 活细胞数。
  2. 如需要，可在三天内按照试剂盒制造商提供的操作说明进行细胞活力检测。
    注：可通过三重染色（包括钙黄绿素AM（488/32 nm；绿色通道，特异性标记活细胞）、PI和Hoechst）将细胞活力检测与增殖检测结合使用。也可利用上述方法建立的细胞培养体系进行细胞凋亡检测；具体操作方案将取决于所使用的成像系统。
    1. 第6天：在96孔板中，每孔接种4,000个细胞，终体积为150 µL，设置三个重复。
    2. 第7至9天：加入2,000倍浓缩的生物发光细胞活力检测试剂（材料表），将培养板放回孵育箱，1小时后进行读数。后续检测每天在同一时间点进行。对于生物发光（MTT）检测，应严格按照制造商说明书操作，每24小时检测一次，共进行72小时，使用化学发光酶标仪读数。

4. RNA-Seq 分析及由 Erbb4 缺失导致表达改变的基因鉴定

  1. 第6天：使用标准的酸- guanidinium-苯酚-氯仿法从分选的MPNST细胞中分离总RNA。对于旨在检测两个队列之间mRNA水平变化的实验，需从每个队列中至少三个生物学重复样本中制备总RNA。
    1. 为排除由腺病毒载体或eGFP表达引起的效应，而非Erbb4缺失所致，分别从三组经Ad5CMV-Cre/eGFP转导的P0-GGFβ3;Trp53+/-;Erbb4fl/fl MPNST细胞和三组经Ad5CMV-eGFP转导的细胞中分离RNA。
      注意：用于RNA-Seq分析的RNA必须具有RNA完整性数（RIN）评分≥8。确保测序核心在构建文库前测定所有样本的RIN值。
  2. 使用每个样本100–200 ng高质量的总RNA制备RNA-Seq文库（此步骤需与测序核心设施合作完成）。使用下一代DNA测序仪进行高通量测序。为进行mRNA定量，执行单端测序以生成Fastq文件。确保每个样本至少获得5000万条测序读段。
    注意：请参见图3，了解用于处理RNA-Seq数据及定量差异表达转录本表达水平的工作流程示意图。以Fastq文件形式的测序数据需接受质量控制程序；>80%的读段应达到Phred质量分数30，方可用于后续分析。同时使用Trimmomatic18对序列进行预处理（修剪），以去除接头序列并过滤低质量读段。
  3. 使用任意功能完备的软件程序（例如DNAStar19,20或Partek21）对生成的fastq文件进行RNA-Seq比对与分析。按照程序特定步骤，使用默认设置将fastq文件比对至小鼠参考基因组（GRCm38/mm10）。
    注意：以DNAStar为例，其通用工作流程如下所述（补充图1）。
    1. 选择分析方法：RNA-Seq。
    2. 选择参考基因组：小鼠。
    3. 若测序核心提供了BED文件，请上传该文件。
    4. 上传fastq测序文件，并为其分配唯一的重复名称。
    5. 对fastq文件进行重复分组，并将其归入一个重复集（即：GFP, CRE）
      注意：每种比对程序均有其特定操作步骤，用户需参考相应程序的用户指南获取具体协议。程序将从这些Fastq文件中生成基因特异性的原始计数数据。
  4. 使用功能完备的软件程序（如4.3节所述）对原始计数数据进行统计与归一化分析（DESeq2、EdgeR），以Ad5CMV-eGFP样本集作为对照数据集，Ad5CMV-Cre样本集作为实验数据集，识别具有足够统计效力的差异基因表达信号22,23。
    1. 选择GFP fastq文件作为对照数据集。
    2. 选择DESeq2 作为统计与归一化分析方法。
    3. 启动组装与分析。
      注意：每种比对程序均有其特定步骤，用户需参考相应程序的用户指南获取具体协议。程序将从这些Fastq文件中生成基因特异性的原始计数数据。统计与归一化分析是许多程序内置的步骤，如本例所示，包含在序列比对流程中。若使用其他不具备此内置后续分析功能的序列比对软件，则需在终端层面使用R语言编写的DESeq2或EdgeR代码包对原始计数数据进行统计与归一化分析，相关代码包可从Bioconductor.org免费下载。
  5. 使用上述方法识别相对于对照组（本例中为经Ad5CMV-eGFP病毒感染的细胞）至少有1.5倍上调或下调的基因变化。仅选用那些被判定为统计学显著、且变化倍数≥1.5倍、p值≤0.05或padj≤0.1的差异表达基因（DEGs），用于后续的功能富集分析。
    注意：该步骤将生成一份差异表达基因列表及其统计学显著性，用于功能富集分析。
  6. 对在4.4节中鉴定出的具有统计学显著性的Erbb4-介导的差异表达基因（DEG），使用任意一种可免费获取的基于网络的功能富集分析工具，结合排序基因列表文件进行功能富集分析。通过这些开放获取的功能富集分析工具中集成的基因本体（GO）数据集，评估Erbb4基因缺失的生物学与通路意义24,25,26,27（参见材料表中的示例及使用Panther的示例工作流程图3）。
    1. 将第4.4步获得的数据导出为电子表格。
    2. 按log2倍数变化、p/padj值或两者同时进行排序。
    3. 务必删除所有无统计学显著性的数据。
    4. 仅以基因ID导出排序后的基因列表为.txt文件，并上传至网站。
      注意：仅使用具有统计学显著性的差异表达基因（p/padj值分别<0.05或0.1），基于log2倍数变化（从高到低）、p/padj值（从低到高）或两者结合[(-log10(pval)*sign(log2FC)]生成排序输入基因列表。生成排序基因列表的方法有多种，需根据数据集和研究问题经验性确定。 所使用的特定功能富集分析工具也可辅助确定合适的排序基因列表类型。有关RNA-Seq的更多资源，请参阅以下文献28,29,30。

5. 移植经 Erbb4 等位基因敲除的 MPNST 细胞并分析 Erbb4 敲除的影响

  1. 在进行分选后的恶性周围神经鞘瘤细胞原位异体移植前，须确保所有操作均经机构动物照护与使用委员会审查批准，并由经过适当培训的人员执行。
  2. 注射当天，使用非酶细胞解离溶液（例如螯合剂混合物；参见下文）从细胞培养板或培养瓶中收集低代次细胞（约85%汇合度）。 材料表) 并使用血细胞计数板对细胞进行计数。对于坐骨神经原位注射，将细胞重悬于 DMEM-10 中，浓度为 16,667 个细胞/mL（每只动物 3 µL 含 50,000 个细胞）31将细胞置于冰上。
    注意：某些细胞培养物若不将细胞注射至低生长因子的基底膜基质中，则无法成功建立移植物。是否需要添加基底膜基质（10–50%）必须通过实验确定。
  3. 评估 在体 感染后同种异体移植物的生长潜力 通过将 MPNST 细胞注射到坐骨神经中来建立细胞模型 8-10只麻醉的 Hsd：裸鼠-Foxn1无胸腺突变nu 每只小鼠 队列（4-8周龄） 原位 注射 肿瘤细胞，指的是 土耳其 等31. 此处演示了皮下注射操作。
    注意：为确定具有统计学意义所需的实验动物数量，请咨询生物统计学家 或 建议使用免费提供的软件 G*Power332.
  4. 注射后第一周内每天密切观察动物两次，以检查任何疼痛迹象。此后，每周对移植小鼠进行三次卡尺测量，并按前述方法评估体况评分（BCSs）。5,31根据IACUC指南，对体况评分（BCS）为2或更低的动物实施安乐死。
  5. 由于移植细胞的生长速率不同，在进行本节所述实验之前，应使用对照（未修饰）细胞通过经验确定移植时间。在实验终点收集移植物时，先通过吸入二氧化碳对小鼠实施人道安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助措施。记录每个移植物的最终体积和质量测量值。
    注意：由于未经修饰的 P0-GGFβ3Trp53+/-;Erbb4fl/fl MPNST细胞通常在注射后30至45天内达到IACUC允许的最大尺寸，典型时间范围为注射后约30至45天。
  6. 按照步骤1.6–1.8所述分离并切片组织。将部分移植物组织在4%多聚甲醛中固定过夜图2) 然后将其包埋于石蜡中。从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织制备5 µm切片，并将切片贴附于载玻片上。进行H&E 染色及其他必要的免疫染色，以确认移植物组织由肿瘤细胞组成，具体方法如 1.8.1 所述。将剩余的肿瘤组织进行速冻，用于后续分析，例如验证基因缺失情况 Erbb4 表达并评估其影响 Erbb4 表达其他基因时的丢失 Erbb 家庭成员。
    注意：必须对移植物组织中的肿瘤细胞进行确认，因为免疫缺陷小鼠易发生肿瘤。对于较小的移植物，重要的是确保瘢痕组织或炎症不会被误判为肿瘤。
    1. 对FFPE组织进行标准IHC染色，以比较来自Ad5CMV-eGFP和Ad5CMV-Cre/eGFP处理细胞的异体移植物中目标蛋白的表达差异。使用erbB4特异性抗体对切除的移植物组织进行染色，以验证erbB4表达的差异 体内 通过Ki67染色测定两种实验条件下erbB4表达的增殖指数，并通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色检测凋亡水平。
      ​注意：也可通过免疫组化（IHC）检测任何感兴趣的蛋白质靶标。例如，使用抗CD31抗体（1:50稀释）对异体移植物进行免疫染色，以评估基因敲除介导的体内血管微环境差异，并通过计数每40倍视野下的血管轮廓数量进行定量分析。对于基于IHC的检测，应遵循标准IHC染色操作流程以及TUNEL染色试剂盒制造商提供的操作说明。图像定量分析可使用ImageJ插件完成。 "单色图像的自动计数"

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

图4 展示了使用 Ad5CMV-eGFP 腺病毒或 Ad5CMV-Cre/eGFP 腺病毒转导 P0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl/fl MPNST 细胞后获得的典型结果（图4A）。通过荧光显微镜观察可识别表达 eGFP 的细胞，同时通过相差显微镜在相同视野下计数总细胞数量，放大倍数分别为10倍（上方）和40倍（下方）。如有需要，可据此计算表达 eGFP 的细胞百分比。典型的流式细胞术（FACS）输出数据见于补充图S2。经流式分选后，表达 eGFP 的细胞比例将显著提高，每个视野中几乎所有细胞均表达 eGFP。根据转染效率的不同，Cre 介导基因敲除后的典型 PCR 基因分型结果可能为完全基因敲除（100% 效率），或为诱导与未诱导细胞组成的混合群体（<100% 效率），而对照组转导结果则仅表达 GFP，基因型为 fl/fl（图...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文所述的详细方法是利用 MPNSTs 的 GEM 模型开发的。然而，如果感兴趣的肿瘤组织能够被分散成单个细胞，则这些方法可轻松适用于在 GEM 模型中发生的多种肿瘤类型。重要的是要确保条件性等位基因不会导致：i）生存期缩短，从而难以获得足够数量的小鼠用于肿瘤筛选；或 ii）肿瘤潜伏期延长，从而难以获得足够数量的荷瘤小鼠。如果条件性等位基因不影响生存期，则两个队列的生存期应相当。如果其对肿瘤潜伏期无影响，则两个队列中出现荷瘤小鼠的数量应相近，且时间进程相似。

类似的方法已被用于研究神经纤维瘤和恶性周围神经鞘瘤，通过使用条件性基因敲除和他莫昔芬诱导的Cre动物来构建可诱导的条件性基因敲除动物模型。33,34与这些研究的不同之处，除了此前讨论过的使用他莫昔芬诱导 Cre 之外，在于这些研究聚焦于 NF1 组织特异性敲除条件下的肿瘤发生。尽管本研究及上述其他研究均使用 GEMM 构建的肿瘤模型，但差异在于所提出的问题。在本方案中，我们并非研究 NF1 缺失在恶性周围神经鞘...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作获得了来自美国国家神经疾病与卒中研究所（R01 NS048353，R01 NS109655）、美国国家癌症研究所（R01 CA122804）、美国国防部（X81XWH-09-1-0086，W81XWH-11-1-0498，W81XWH-12-1-0164，W81XWH-14-1-0073 和 W81XWH-15-1-0193）以及儿童肿瘤基金会（2014-04-001 和 2015-05-007）的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Ad5CMV-eGFP基因转移载体中心，爱荷华大学VVC-U of Iowa-4
Ad5CMVCre-eGFP基因转移载体中心，爱荷华大学VVC-U of Iowa-1174
alexa 568 二抗Thermo/FisherGaR A11036
Bioconductor 生物信息学开源软件Bioconductorhttp://www.bioconductor.org用于步骤 4.4 的替代统计分析工具
CD31Abcamab28364
Celigo 图像细胞仪Nexcelom BioscienceN/A
Cell StripperCorning25-056-Cl螯合剂混合物
DAB 染色试剂盒Vector LabsMP-7800
DAVID（注释、可视化与集成发现数据库）DAVIDhttps://david.ncifcrf.gov用于步骤 4.5 的功能富集分析软件
DMEMCorning15-013-Cl
DreamTaq 及缓冲液（基因型 PCR）Thermo/FisherEP0701 和 K1072
erbB4 抗体Santa Cruzsc-284
erbB4 抗体Abcamab35374
erbB4 抗体MilliporeHFR1: 05-1133
FACS 分选仪BD BiosciencesAria II
福斯科林（Forskolin）SigmaF6886
GenomeSpace 工具与数据源GenomeSpacehttps://genomespace.org/support/tools/用于步骤 4.5 的多种开源生物信息学工具通用资源
谷氨酰胺（Glutamine）Corning25-005-Cl
Gorilla 基因本体富集分析与可视化工具GorillaN/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il用于步骤 4.5 的功能富集分析软件
GSEA 基因集富集分析Broad 研究所N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp用于步骤 4.5 的功能富集分析软件
HSD：无胸腺裸鼠 FOxn1nuEnvigo（前身为 Harlan Labs）69
Illumina HiSeq2500（下一代 DNA 测序仪）IlluminaHi Seq 2500用于步骤 4.2 的 DNA 测序仪
Lasergene：ArrayStar 基因表达与变异分析DNAStar LaserGene 软件N/A用于步骤 4.4 的软件统计与标准化分析
Lasergene：SeqMan NGen 序列比对组装用于步骤 4.3 的软件比对N/A用于步骤 4.3 的软件比对
Matrigel，低生长因子基底膜基质Corning354230
NRG1-beta本实验室制备由 SLC 生成，也可从 R & D Systems（396-HB-050/CF）商业购买。
核染料 Hoechst 33342Thermo62249
Panther 基因本体分类系统Pantherhttp://pantherdb.org用于步骤 4.5 的功能富集分析软件
Partek（BWA 比对器与分析器）Partek，Ver 7N/A用于步骤 4.3 的软件比对及统计/标准化分析
青霉素/链霉素（Pen/Strep）Corning30-002-Cl
引物 1：5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT
GTCTG- 3′		Eurofins Genomics引物 1 + 2：250 bp ErbB4 敲除产物和 350 bp Floxed ErbB4 产物；
引物 2：5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC
AGAAGC-3′		Eurofins Genomics引物 1 + 2：250 bp ErbB4 敲除产物和 350 bp Floxed ErbB4 产物；

引物 3：5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA
ACCCAG-3′

Eurofins Genomics引物 1 + 3：350 bp 野生型 ErbB4 产物。
碘化丙啶（Propidium Iodine）Fisher51-351-0
Proteome Profiler 磷酸化激酶阵列R&D SystemsARY003B
实时荧光检测（Real time glo）PromegaG9712生物发光细胞活力检测
ToppGene 套件ToppGenehttps://toppgene.cchmc.org用于步骤 4.5 的功能富集分析软件
Trizol（基于酸-硫氰酸胍-苯酚和氯仿的试剂）Invitrogen15596026
酪胺信号放大试剂盒（Tyramide Signal Amplification Kit）Perkin ElmerNEL721001EA

参考文献

  1. Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
  2. Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblastoma multiforme. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5347(2019).
  3. Roskoski, R. Properties of FDA-approved small molecule protein kinase inhibitors. Pharmacological Research. 144, 19-50 (2019).
  4. Heffner, C. S., et al. Supporting conditional mouse mutagenesis with a comprehensive cre characterization resource. Nature Communications. 3, 1218(2012).
  5. Longo, J. F., et al. ErbB4 promotes malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis via Ras-independent mechanisms. Cell Communication and Signaling. 17 (1), 74(2019).
  6. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  7. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropatholica. 127 (4), 573-591 (2014).
  8. Ducatman, B. S., Scheithauer, B. W., Piepgras, D. G., Reiman, H. M., Ilstrup, D. M. Malignant peripheral nerve sheath tumors. A clinicopathologic study of 120 cases. Cancer. 57 (10), 2006-2021 (1986).
  9. Gassmann, M., et al. Aberrant neural and cardiac development in mice lacking the ErbB4 neuregulin receptor. Nature. 378 (6555), 390-394 (1995).
  10. Tidcombe, H., et al. Neural and mammary gland defects in ErbB4 knockout mice genetically rescued from embryonic lethality. Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 100 (14), 8281-8286 (2003).
  11. Golub, M. S., Germann, S. L., Lloyd, K. C. Behavioral characteristics of a nervous system-specific erbB4 knock-out mouse. Behavioral Brain Research. 153 (1), 159-170 (2004).
  12. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  13. Jackson-Fisher, A. J., et al. Formation of Neu/ErbB2-induced mammary tumors is unaffected by loss of ErbB4. Oncogene. 25 (41), 5664-5672 (2006).
  14. Byer, S. J., et al. Tamoxifen inhibits malignant peripheral nerve sheath tumor growth in an estrogen receptor-independent manner. Neuro-oncology. 13 (1), 28-41 (2011).
  15. Kang, Y., Pekmezci, M., Folpe, A. L., Ersen, A., Horvai, A. E. Diagnostic utility of SOX10 to distinguish malignant peripheral nerve sheath tumor from synovial sarcoma, including intraneural synovial sarcoma. Modern Pathology. 27 (1), 55-61 (2014).
  16. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  17. Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
  18. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  19. Grozdanov, P. N., Li, J., Yu, P., Yan, W., MacDonald, C. C. Cstf2t regulates expression of histones and histone-like proteins in male germ cells. Andrology. 6 (4), 605-615 (2018).
  20. Kaur, S., et al. CD63, MHC class 1, and CD47 identify subsets of extracellular vesicles containing distinct populations of noncoding RNAs. Scientific Reports. 8 (1), 2577(2018).
  21. Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891(2020).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  23. Lin, Y., et al. Comparison of normalization and differential expression analyses using RNA-Seq data from 726 individual Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 17, 28(2016).
  24. Eden, E., Navon, R., Steinfeld, I., Lipson, D., Yakhini, Z. GOrilla: a tool for discovery and visualization of enriched GO terms in ranked gene lists. BMC Bioinformatics. 10, 48(2009).
  25. Huang, D. W., et al. The DAVID Gene Functional Classification Tool: a novel biological module-centric algorithm to functionally analyze large gene lists. Genome Biology. 8 (9), 183(2007).
  26. Mi, H., Muruganujan, A., Casagrande, J. T., Thomas, P. D. Large-scale gene function analysis with the PANTHER classification system. Nature Protocols. 8 (8), 1551-1566 (2013).
  27. Subramanian, A., et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proceedings of the Nationall Academy of the Sciences of the United States of America. 102 (43), 15545-15550 (2005).
  28. Merico, D., Isserlin, R., Stueker, O., Emili, A., Bader, G. D. Enrichment map: a network-based method for gene-set enrichment visualization and interpretation. PLoS One. 5 (11), 13984(2010).
  29. Yoon, S., Kim, S. Y., Nam, D. Improving gene-set enrichment analysis of RNA-Seq data with small replicates. PLoS One. 11 (11), 0165919(2016).
  30. Koch, C. M., et al. A beginner's guide to analysis of RNA sequencing data. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 59 (2), 145-157 (2018).
  31. Turk, A. N., Byer, S. J., Zinn, K. R., Carroll, S. L. Orthotopic xenografting of human luciferase-tagged malignant peripheral nerve sheath tumor cells for in vivo testing of candidate therapeutic agents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2558(2011).
  32. Faul, F. E., Lang, A. G., Buchner, A. G*Power 3: a flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39 (2), 175(2007).
  33. Chen, Z., et al. Cells of origin in the embryonic nerve roots for NF1-associated plexiform neurofibroma. Cancer Cell. 26 (5), 695-706 (2014).
  34. Mo, J., et al. Humanized neurofibroma model from induced pluripotent stem cells delineates tumor pathogenesis and developmental origins. Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139807(2021).
  35. Chau, V., et al. Preclinical therapeutic efficacy of a novel pharmacologic inducer of apoptosis in malignant peripheral nerve sheath tumors. Cancer Research. 74 (2), 586-597 (2014).
  36. Dodd, R. D., et al. NF1(+/-) Hematopoietic cells accelerate malignant peripheral nerve sheath tumor development without altering chemotherapy response. Cancer Research. 77 (16), 4486-4497 (2017).
  37. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

基因剔除基因工程小鼠腺病毒Cre重组酶荧光激活细胞分选肿瘤细胞培养原位同种移植差异基因表达功能富集分析
通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。