我们介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具 体内 采用光片荧光显微镜技术。具体而言，我们推荐使用心脏荧光信号强烈的转基因品系，并介绍新的温和包埋与固定技术，以避免发育异常和心脏缺陷。同时提供了一套适用于心脏成像的数据采集与分析流程。
本文内容
摘要
摘要
胚胎心脏研究已从快速成像技术的进步中获益良多 体内 光片荧光显微镜（LSFM）。结合斑马鱼体外发育迅速、遗传操作简便以及身体透明的特性， Danio rerio，光片显微镜（LSFM）在无明显光毒性和光漂白的情况下，以高空间和时间分辨率揭示了心脏的形态与功能。对跳动心脏的成像给现有的样本制备和显微技术带来了挑战。研究者需要在受限的视野内维持样本的生理活性，并获取超快速图像以解析心跳过程。本文介绍了用于研究斑马鱼心脏的优化工具与解决方案 体内我们展示了利用明亮的转基因品系标记心脏组分的应用，并介绍了新型的温和包埋与固定技术，可避免发育缺陷及心率变化。同时，我们提出了一套适用于心脏成像的数据采集与分析流程。本文所述的完整工作流程主要聚焦于斑马鱼胚胎心脏成像，但也可应用于多种其他样本与实验。
引言
为了揭示早期跳动心脏中复杂的事件与相互作用， 体内 需要对整个器官进行成像。由于其光毒性极低1,2,3，低光漂白4，高速光片显微镜已成为胚胎发育和心脏发育研究的主要成像工具5,6它在高空间和时间分辨率下揭示了心脏的形态与功能。7,8,9 并使研究人员能够以高速对心脏的荧光标记部分进行成像和追踪，研究血流动力学力，并直接在发育中胚胎体内观察心脏发育过程6,10,11,12.
为了在视野中精确且可重复地固定斑马鱼，目前已存在多种适用于光片显微镜的包埋方案，涵盖短期与长期、单样本或多样本的实验需求13,14,15,16,17,18,19。最常用的方案是使用三卡因（tricaine）麻醉斑马鱼，并将其包埋于玻璃或塑料管内的琼脂糖中。然而，由于心率可能受到温度、麻醉剂及包埋材料的影响20,21,22，斑马鱼心脏成像需要采用特定且温和的方案，以确保样本健康6,8,11,12,20,21,22,23。对于短期成像（最长一小时），可将斑马鱼置于130 mg/L三卡因溶液中麻醉，随后使用含0.1%琼脂糖溶液及塞子的氟化乙烯丙烯共聚物（Fluorinated Ethylene Propylene, FEP）管进行包埋，具体步骤如Weber等（2014）所述16。然而，由于三卡因可能导致发育缺陷20,22，长期成像需采用不同的实验方案。
本文介绍了一种用于长期心脏成像的新策略。尽管已存在多种光片显微镜实现方式24，我们推荐在T-SPIM显微镜中使用悬挂样品的方式（一个检测物镜和两个照明物镜位于水平面内，样品垂直悬挂在共同焦点处）。该配置为精确的样品定位提供了必要的运动和旋转自由度。在单细胞或双细胞阶段向斑马鱼胚胎注射30 pg α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）mRNA以实现固定。α-银环蛇毒素是一种蛇毒，可使肌肉麻痹，但不影响心血管系统的发育或生理功能22。为了实现精确且无畸变的成像，我们建议将鱼置于由FEP（氟化乙烯丙烯共聚物）制成的管中，该聚合物的折射率与水几乎相同。我们讨论了如何通过在成像前拉直和清洗FEP管来最佳地制备这些管。随后将鱼头朝下放置于管内的培养基中，并用2%琼脂糖塞子密封管底，鱼头即 resting 在该塞子上。在FEP管上打孔有助于气体交换并确保鱼的正常生长。嵌入后的鱼可在培养基中长期保存，直至成像前再安装到样品支架上。我们还提出了一套用于可重复高速成像的数据采集与分析流程。此外，我们探讨了使用细胞质标记与细胞膜标记的转基因品系进行稳健的心肌细胞标记的优劣，以及多种停跳心脏的方法。这些样品固定技术在保障样品健康的同时，能够将心脏精确且可重复地约束在视野范围内。
方案
所有斑马鱼（Danio rerio）成鱼和胚胎的处理均遵循威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
1. 斑马鱼的准备
- 根据既定方案操作斑马鱼25,26 并遵循机构指导原则。培育所需转基因品系的成年鱼（参见讨论部分）。收集胚胎并将其置于 28 °C 在含有鱼类培养基（如 E3）的培养皿中27.
- 选择一种固定方法（参见讨论部分）。
- 如果使用 α-bungarotoxin mRNA 以固定鱼类，注射 30 pg mRNA22 使用安装在显微操作仪上并连接至皮升注射仪的玻璃毛细针，将物质注入单细胞或双细胞期胚胎的卵黄中28.
- 若使用三卡因（tricaine），用1 M Tris碱缓冲至pH 7.0–7.4，配制0.4%的储存液，并于-20°C保存。20 °C 直至成像。
- 将卵置于盛有E3的培养皿中 28 °C 每隔24小时将胚胎转移至含有新鲜E3培养基的新培养皿中，直至成像。
- 为防止色素形成，若斑马鱼品系非白化品系，于受精后24小时（hpf）将鱼转移至含0.2 mM 酪氨酸酶抑制剂1-苯基-2-硫脲的新E3培养皿中（见讨论部分）。
2. FEP 管的制备
图1：FEP管的清洗与矫直。（a）卷绕在电缆盘上的FEP管。（b）矫直前的FEP管。（c）置于可耐受高压灭菌的玻璃和不锈钢套管中的FEP管。（d）矫直并冷却后冲洗FEP管。（e）将FEP管切割至适合超声处理的离心管尺寸。（f）超声处理后冲洗FEP管。（g）将清洗并矫直后的FEP管储存于离心管中。（h）成像前切割FEP管。请点击此处查看该图的放大版本。
- 拉直FEP管图1a，b) 将其置于可耐受高压灭菌的玻璃或钢制导管中（图1c) 选用合适内径（通常为 1.6 或 2.4 mm）以适配 FEP 管的部件，并进行高压灭菌处理 180 °C 孵育2 h。于室温下冷却至少5 h。随后，从拉直管中取出。
注意：操作管子时需佩戴手套，并每次处理50 cm长的管子。 - 清洁FEP管。
注意：出于安全考虑，建议使用带有钝头针尖且内衬FEP管尺寸合适的注射器，但普通针头也可使用。- 用50 mL注射器以1 M NaOH冲洗管子两次（图1d).
- 用剃刀将FEP管切割至与50 mL离心管相同长度（图1e），将切割后的管置于盛有0.5 M NaOH的离心管中，超声处理10分钟。
- 用双蒸水冲洗 FEP 管2O，然后用70%乙醇重复冲洗（图1f).
- 将试管转移至70%乙醇中，超声处理10分钟。
- 用双蒸水冲洗试管2O，并将它们存放在离心管中，置于双蒸水H2O (图1g).
3. 2% 琼脂糖培养皿的制备
- 在玻璃烧瓶中，将低熔点琼脂糖粉末溶于 E3 溶液中。使用微波炉加热溶液，每隔 20 秒搅拌一次，直至粉末完全溶解。
- 将琼脂糖倒入玻璃或塑料培养皿中，形成 1–2 mm 厚的涂层。等待琼脂糖完全凝固。
- 储存时，在琼脂糖表面轻轻倒入 E3 溶液以防止干燥。用封口膜包裹后，于 4 °C 保存。
4. 包埋介质的制备
- 准备足量的E3培养基以填充样品室。
注意：如果培养基与物镜接触，请避免使用亚甲基蓝。 - 若使用三卡因（tricaine），请先解冻储备液，然后向E3培养基中加入0.02%的三卡因。
5. 样品安装
图2：FEP管中胚胎的固定。（a）在固定介质中的无色素麻醉鱼。（b）带有钝端针头并连接FEP管的注射器。（c）当介质和鱼被吸入FEP管后，在针头边缘处剪断FEP管。（d）将剪断的FEP管浸入涂有2%琼脂糖的培养皿中，以封堵其末端。（e）置于带琼脂塞FEP管中的斑马鱼。（f）以30°角轻轻剪切FEP管，形成气体交换孔。（g）在嵌入的斑马鱼上方具有四个孔的FEP管。（h）斑马鱼嵌入FEP管的示意图，标示了孔和琼脂塞。（i）多个已嵌入且准备成像的斑马鱼。请点击此处查看该图的放大版本。
- 使用一次性玻璃移液管将鱼转移至包埋介质中（图 2a）。若使用三卡因（tricaine），则在成像前 10 分钟将鱼转移至含有三卡因的 E3 溶液的培养皿中。两种情况下均需在体视显微镜下观察，确认鱼已停止运动，且心跳速率与对照组相似。
- 使用剃刀片将 FEP 管切割至理想长度（图 1h）。
注意：长度应根据显微镜样品 holder 进行调整；通常长度约为 3 cm。 - 准备一支带有钝端套管的注射器。先将注射器内充满空气，然后将 FEP 管安装到针头上，并通过排空注射器轻轻冲出残留的水分（图 2b）。
注意：排气时应缓慢操作，避免产生气泡。 - 将已安装 FEP 管的注射器先吸入包埋介质以充满管体，随后头朝下吸入胚胎。尽量使鱼的头部靠近管端。操作过程中避免产生气泡；若出现气泡，应弃用该样品。
- 使用剃刀片，小心地在钝端套管或针头边缘处切断 FEP 管（图 2c）。
- 弃去琼脂涂层培养皿表面的多余液体。将 FEP 管垂直插入琼脂中（图 2d）。旋转管体并拔出，以从琼脂糖基质中释放出凝胶塞。
- 在体视显微镜下确认 FEP 管末端存在琼脂凝胶塞（图 2e）。
- 对于长期成像，需在 FEP 管的每个正交方向上距离鱼体末端至少 5 mm 处切割 3–5 个孔。
- 在体视显微镜下，使用剃刀片垂直于管轴方向，在 FEP 管上做一 30° 切口，直至穿透至包埋介质（图 2f）。
- 在 180° 位置做第二次切割，形成一个孔（图 2g,h）。
- 将头朝下固定的胚胎转移至含有包埋介质的 1.5 mL 微离心管中，待成像时取出（图 2i）。
6. 样品定位
图3：样品室。（a）安装在样品支架上的FEP管。（b）带有载物台和物镜的样品室。（c）充满培养基的样品室的顶视图，采用T-SPIM构型进行照明和检测的物镜。（d）安装在显微镜上的样品支架，样品位于样品室内。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：心脏成像的胚胎定位。（a）24 hpf的Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)斑马鱼，眼部未对齐。（a'）同一条鱼，眼部已对齐。（b）该鱼分别旋转-100°（b'）和-50°，以实现最佳心脏成像。（c）48 hpf斑马鱼，眼部未对齐。（c'）同一条鱼，眼部已对齐。（d）该鱼旋转30°以实现最佳心脏成像。黑色箭头指向心脏。比例尺：100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
- 在显微镜下，将FEP管安装到样品架中（图3a），并向成像室中加入包埋介质（图3b、c）。随后，将样品架放置在载物台上，使样品浸入成像室中（图3d）。
- 检查样品的健康状况。通过与未固定的对照鱼比较，目视评估心率以判断鱼的整体健康状况，因为特定心率与发育阶段和温度相关。如果心跳过慢，则弃用该鱼。
注意：确保轻柔操作胚胎，小心转移至包埋介质中，包埋后立即进行成像，避免温度快速变化，避免使用三卡因（tricaine），并尽量缩短暴露于三卡因的时间。 - 为获得可重复的成像结果，应始终使用相同的样品位置。建议对齐眼睛，并以一定角度进行成像。
- 旋转鱼体，使两只眼睛（图4a、c）均处于焦平面内（图4a'、c'）。
- 从该位置开始，进一步将鱼体顺时针旋转约50°–100°，用于24 hpf的成像（图4b、b'）；或逆时针旋转约20°–30°，用于48 hpf的成像（图4d）。
注意：在30 hpf之前，早期心脏由于位置隐蔽，成像可能较为困难（图4b）。
7. 图像采集
- 选择能提供最佳图像质量的照明侧，并针对每条鱼调整激光功率。
注意：记录所用激光功率，以供后续图像分析使用。 - 在每个 z 平面，以每秒 300 帧（fps）或更高的速度记录 4-5 次心跳。
注意：可裁剪视野以提高采集速度。例如，在 48 hpf 时，斑马鱼心脏每秒跳动两到三次，因此在 300 fps 下，采集四到六次心跳需要 300 至 600 帧。 - 为记录跳动的心脏，逐步移动样品通过光片。使用 1-2 µm 的 z 间距，覆盖心脏的整个深度。
8. 图像处理
- 使用 Fiji（Image J229,30）插件，按照先前所述方法6，将录制的视频同步，以重建四维（x，y，z，时间）心脏图像。
- 为探索数据并生成斑马鱼心脏的三维渲染视频，请将四维文件（x，y，z，时间）载入三维渲染软件中。
结果
图548 小时受精龄斑马鱼心脏 (a一帧画面 z48小时斑马鱼Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP)的明场、腹侧前视图，采用LSFM成像，(b) 电影序列的三维重建，心房切面视图。c一个z平面下完整心动周期中四个时间点的拼接图。饼状图表示心动周期中的时间。比例尺 50 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
我们根据上述方案记录了Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP)斑马鱼在48小时后受精（hpf）时跳动的心脏（图5）。使用488 nm和561 nm的激光片层同时照射样品，通过16x/0.8 W水镜物镜和科学级金属氧化物半导体（sCMOS）相机垂直检测发射的荧光信号。
在48 hpf时，心脏刚刚完成 looping 过程，具有两个腔室，即心室和心房，但尚未发育出瓣膜。在我们的视频中，不同的心脏结构（如流入道、心室、房室管（AVC）、心房和流出道）清晰可辨（图5a，b）。这些数据精确展示了心脏的搏动过程，并揭示了心脏两层细胞之间的复杂相互作用：心肌层为单层肌肉细胞，通过收缩产生力量（图5c，红色）；而心内膜为单层细胞，连接心脏与血管系统（图5c，青色）。
根据Mickoleit等人的方法，进行了x、y、z（三维）+ 时间（四维）+ 颜色（五维）的心跳重建6。该重建基于两个假设：心脏运动具有重复性，且数据采集时需采用较小的z轴步长。输出结果为单个心跳的五维重建数据，每个心跳的数据量为30 GB至80 GB。为了渲染数据，我们使用了免费的开源工具FluoRender进行深度渲染31，该工具专为处理多维数据集而设计，可轻松生成包含细胞层及单个层的五维视频（图5b）。
讨论
用于心脏成像的转基因品系
图6：细胞质标记与膜标记斑马鱼转基因品系的比较。 采用光片荧光显微镜（LSFM）成像的48小时斑马鱼心脏的腹侧前部视图。白色箭头指示仅在膜标记转基因品系中可见的结构。(a) 心脏中Tg(kdrl:EGFP)32信号以青色显示，以及(a') 心室中的信号。( b) 心脏中Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33信号以红色显示，以及(b') 心室中的信号。( c,c') Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) 与 Tg(kdrl:EGFP) 信号的叠加图像。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
对斑马鱼心脏进行成像需要精确的心脏细胞标记。尽管心肌细胞的厚度在整个细胞中相对恒定，但内皮细胞在细胞核周围较厚，却具有较薄的膜突起，在某些区域甚至薄于2 µm。细胞质转基因品系（如Tg(kdrl:EGFP)32）能有效标记内皮细胞核周围的区域，但在较远的位置，由于细胞质过薄，可能无法在如此短的曝光时间内发射足够的光子而被检测到，从而导致数据中出现人为的空缺（图6a）。相比之下，膜标记转基因品系（如Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33）能够有效标记内皮层，并揭示更多细节（图6b、c）。在每项实验中，应仔细选择最合适的转基因品系。
斑马鱼固定
固定方法的选择取决于成像实验的持续时间和斑马鱼的年龄。三卡因（Tricaine）常被用于斑马鱼的固定，主要因其使用简便。实际上，只需在鱼培养液中加入130 mg/L的三卡因，10分钟内即可实现麻醉。然而，三卡因可能导致发育缺陷并影响心脏生理功能20,22，因此我们建议仅在短时间实验（少于30分钟）中使用。对于长时间成像，可在单细胞期或双细胞期注射α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）mRNA，使斑马鱼在受精后3天内（dpf）保持麻痹状态，且不会影响心血管系统的发育或生理功能22。
选择合适的FEP管
FEP管有多种直径和厚度可供选择。对于0-5天的斑马鱼成像，0.8 mm的内径较为合适；可选择厚壁的0.8 × 1.6 mm管或薄壁的0.8 × 1.2 mm管。我们推荐使用薄壁管；然而，厚壁管具有更高的稳定性和刚性，在样品腔内有流动介质可能扰动或移动薄壁管的情况下尤为重要。对于较大的样品，可使用1.6 × 2.4 mm和2 × 3 mm的FEP管。
温度与气体交换
斑马鱼胚胎健康的一个关键因素是温度。理想情况下，在成像过程中应将鱼类维持在28.5 °C，因为环境温度会影响胚胎的发育和心率34。
根据我们的经验，通过2%琼脂糖塞进行的氧气交换仅能将心率稳定维持至3-4 dpf。因此，需要在管壁上打孔以确保氧气扩散。如果需要向样品中递送药物，打孔也同样必要。
心跳暂停
配备适当的光片显微镜的快速采集速度可实现对跳动心脏的记录 体内然而，为了获得未受干扰的z轴层扫图像，可以减慢或停止心脏跳动。但是，停止心脏跳动会导致心肌松弛，可能引起心脏结构塌陷6心跳暂停可通过吗啡啉、低温、肌肉收缩抑制剂或光遗传学方法实现。这些方法各有其局限性，需针对每个实验仔细评估。
在单细胞阶段注射 4 ng 的silent heart (sih)吗啉代寡核苷酸，可通过靶向对肌节形成至关重要的tnnt2a基因，抑制心跳35。sih斑马鱼无心跳，仅能存活至受精后7天（7 dpf），此时胚胎开始依赖循环血液进行氧供。由于心脏形态发生受遗传因素和生物力学因素共同驱动36，这些鱼类在约受精后3天（3 dpf）出现心脏畸形。
由于Ca2+的流动对温度敏感，温度会影响斑马鱼胚胎的心率21。因此，降低成像室的温度可减缓心跳。要停止心跳，则需要低于15 °C的温度。由于斑马鱼通常饲养在28.5 °C条件下，如此低的温度只能维持短暂时间（少于10分钟）。
可以向斑马鱼培养液中添加一些化学抑制剂类药物，例如肌肉收缩抑制剂2,3-丁二酮单肟（BDM，50 nM37,38），以暂时停止心跳。BDM使用方便，可在15分钟内抑制心脏收缩，并可通过洗脱恢复心脏功能。然而，由于BDM会改变心脏动作电位，因此必须谨慎使用37。
最后，通过光照表达光控离子通道或泵（如通道视紫红质或盐视紫红质）的转基因斑马鱼流入道起搏点，可操控甚至停止其心肌中的心脏活动39,7,40,41,9。
展望
斑马鱼心脏研究的优化工具与解决方案 体内 可实现对超快速心脏动态进行长期、温和的成像。样品包埋方法可根据不同的成像模式进行调整，适用于共聚焦显微镜、双光子显微镜或光学投影断层成像（OPT）。然而，光片显微镜可能是首选技术，因其具备足够快的光学切片速度，能够捕捉心脏的动态过程。尽管本方案主要聚焦于斑马鱼胚胎心脏的成像，但我们认为该方法也可应用于其他多种样品和实验。未来值得关注的是，在发育后期阶段，当心脏更加隐蔽且幼体透明度降低时，类似的包埋与成像技术是否仍可成功应用。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Madelyn Neufeld 为图 2h 提供的插图。本工作得到马克斯·普朗克学会、莫里奇生物医学研究所、陈·扎克伯格倡议基金以及人类前沿科学计划（HFSP）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | 用于携带包埋样品 |
| 15 mL Falcon 管 | Falcon | 352095 | 用于携带包埋样品 |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352070 | 用于超声步骤以及储存清洗后拉直的 FEP 管 |
| 50 mL 注射器 | BD | 309654 | 用于 FEP 清洗的 50 mL 注射器 |
| 低凝胶温度琼脂糖 | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | 用于制备凝胶塞 |
| 钝头针头，21 号 | VWR | 89500-304 | 适用于内径 0.8 mm 的 FEP 管的钝头针 |
| 硼硅酸盐玻璃管 | McMaster-Carr | 8729K33 | 用于 FEP 管拉直，外径 9.5 mm，内径 5.6 mm，长 30 cm，也可提供其他尺寸 |
| 硼硅酸盐玻璃管 | McMaster-Carr | 8729K31 | 用于 FEP 管拉直，外径 6.35 mm，内径 4 mm，长 30 cm，也可提供其他尺寸 |
| 普通针头，21 号 | BD | 305165 | 适用于内径 0.8 mm 的 FEP 管的普通针头 |
| 一次性玻璃移液管 | Grainger | 52NK56 | 用于转移斑马鱼，需与移液泵配合使用 |
| 斑马鱼胚胎用 E3 培养基 | |||
| 乙醇 | Sigma Aldrich | 64-17-5 | 用于 FEP 管清洗 |
| FEP 管，0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | 薄壁 FEP 管，也可提供其他尺寸 |
| FEP 管，0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | 厚壁 FEP 管，也可提供其他尺寸 |
| FEP 管，2/3 mm | BGB | 211581 | 大尺寸厚壁 FEP 管，也可提供其他尺寸 |
| 耐热橡胶手套（Hot Hand） | Cole-Parmer | 691000 | 用于高压灭菌后搬运高温设备 |
| Omnifix 1 mL 注射器 | B Braun | 9161406V | 用于样品包埋的 1 mL 注射器 |
| 小型培养皿 | Dot Scientific | PD-94050 | 用于制备琼脂糖凝胶塞 |
| 移液泵 | Argos Technologies | 04395-05 | 用于转移斑马鱼，需与一次性玻璃移液管配合使用 |
| PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | 又称： N-苯基硫脲、1-苯基-2-硫脲、苯硫代卡巴胺 |
| 剃须刀片 | Azpack | 11904325 | 用于切割 FEP 管 |
| 氢氧化钠 | Dot Scientific | DSS24000 | 用于 FEP 管清洗的 NaOH |
| 三卡因（Tricaine） | Sigma Aldrich | E10521 | 又称：MS-222， 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐、三卡因 |
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