秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

摘要

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

摘要

在神经元中，微管的取向是识别轴突和树突的关键指标：轴突的微管呈正端朝外，而树突的微管通常具有混合取向。本文描述了标记、成像和分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）触觉神经元发育与再生过程中微管动态行为及生长的方法。利用基因编码的微管末端荧光报告系统，我们对轴突内的微管进行了成像。该方案可用于量化在轴突切断后启动轴突再生过程中微管行为的局部变化。本检测方法可适用于其他类型的神经元和不同遗传背景，以研究微管动态在多种细胞过程中的调控机制。

引言

神经元具有复杂的结构，包含树突、胞体、轴突和突触等特化区室。神经元细胞骨架由微管、微丝和神经丝构成，其独特的组织形式在结构和功能上支持着神经元的不同区室^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10}。多年来，微管的组织方式被确认为决定神经元极性和功能的关键因素。在神经元发育或再生过程中发生结构重塑时，微管的动力学行为和取向决定了各种神经元区室的身份特征、极性运输、生长及发育过程⁷。因此，必须在活体条件下评估微管的动力学行为和取向，以与神经元的重塑过程建立关联。

微管由α和β微管蛋白异源二聚体的原纤维组成，具有动态的正端和相对稳定的负端^....

方案

1. 报告基因菌株：培养与保藏

注意：为了测量 PLM 神经元中微管的动力学和取向，我们使用了在触觉神经元特异性启动子 mec-4（juIs338 等位基因）驱动下表达 EBP-2::GFP 的线虫品系^18,25,26。该品系采用标准的线虫培养与维持方法²⁷。

1. 制备线虫生长培养基（3.0 g/L 氯化钠、2.5 g/L 蛋白胨、20.0 g/L 琼脂、10 mg/L 胆固醇（由10 mg/mL 储备液稀释）），加水溶解后高压灭菌。
2. 将培养基混合物短暂冷却10–15分钟，然后加入1 mM 氯化钙、1 mM 硫酸镁和25.0 mM 磷酸二氢钾（pH 6.0）。
3. 使用无菌分液器将约9 mL培养基倒入60 mm培养皿中，室温下无菌环境中静置一天，随后于4 °C保存。
4. 制备50 mL LB液体培养基（5.0 g/L 氯化钠、10.0 g/L Bacto-Tryptone），高压灭菌并冷却后，接种单个大肠杆菌（Escherichia col....

结果

作为一个代表性示例，我们描述了在PLM神经元的稳态轴突和再生轴突中对EBP彗星结构的活体观察。PLM神经元位于线虫尾部，具有一条向前延伸并形成突触的长轴突以及一条较短的向后突起。这些神经元紧邻表皮沿前后方向生长，负责介导线虫对轻触刺激的感觉。由于其结构简单，且易于进行成像和显微手术操作，PLM神经元已被广泛用于研究微管细胞骨架²⁹、轴突运输^30,31、再生能力^19,32、神经元极性^24,33,34、行为与衰老^35,36，以及其他多种神经元过程。本研究利用在<.......

讨论

多年来，微管动力学一直是细胞骨架研究领域的关键关注点。微管经历成核和灾变，并伴随着持续的动态不稳定性过程^44,45,46,47。这些信息大部分是通过体外实验获得的，例如通过光散射检测游离与聚合微管蛋白，以及利用荧光标记微管蛋白进行微管生长实验等⁴⁸。尽管在较薄的细胞中可以实现对荧光和非荧光微管的活体观察，但在体内测量微管动力学仍具有挑战性。

利用这种转基因品系，也可对其他触觉神经元（如PVM、ALM和AVM）的微管取向进行评估。此处描述的成像和分析方法可适用于具有适当报告基因转基因的其他C. elegans神经元类型，但不同神经元之间彗星状信号动态的变异性是预期存在的^49.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CZ18975 线虫品系	Yishi Jin 实验室	CZ18975	由 Anindya Ghosh-Roy 构建
琼脂糖	Sigma	A9539	线虫封片
盖玻片（18 mm × 18 mm）	Zeiss	474030-9010-000	线虫封片
带加热模块的干浴器	Neolab		线虫封片
载玻片（35 mm × 25 mm）	Blue Star		线虫封片
聚苯乙烯微球溶液（4.55 × 10¹³ 粒子/mL，水相介质含极少量表面活性剂）	Polysciences Inc.	00876	线虫封片
试管			线虫封片
OP50 细菌品系	秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）	OP50	线虫操作
60 mm 培养皿	Praveen Scientific	20440	线虫操作
吸管/毛细管	VWR	53432-921	线虫操作
培养箱	Panasonic	MIR554E	线虫操作
铂金丝			线虫操作
带荧光附件的体视显微镜	Leica	M165FC	线虫操作
0.3% 氯化钠	Sigma	71376	线虫生长培养基
0.25% 蛋白胨	T M Media	1506	线虫生长培养基
10 mg/mL 胆固醇	Sigma	C8667	线虫生长培养基
1 mM 氯化钙二水合物	Sigma	223506	线虫生长培养基
1 mM 硫酸镁七水合物	Sigma	M2773	线虫生长培养基
2% 琼脂	T M Media	1202	线虫生长培养基
25 mM 磷酸二氢钾（一碱式）	Sigma	P9791	线虫生长培养基
0.1 M 磷酸二氢钾（一碱式）	Sigma	P9791	1× M9 缓冲液
0.04 M 氯化钠	Sigma	71376	1× M9 缓冲液
0.1 M 氯化铵	Fisher Scientific	21405	1× M9 缓冲液
0.2 M 磷酸氢二钠七水合物（二碱式）	Sigma	S9390	1× M9 缓冲液
玻璃瓶	Borosil		缓冲液储存
488 nm 激光器	Zeiss		成像
5× 物镜	Zeiss		成像
63× 物镜	Zeiss		成像
相机	Photometrics	Evolve 512 Delta	成像
转盘共聚焦系统计算机	HP	Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz	成像
落射荧光显微镜	Zeiss	Observer.Z1	成像
卤素灯	Zeiss		成像
汞弧灯	Zeiss		成像
转盘共聚焦单元	Yokogawa	CSU-X1	成像
ZEN2 软件	Zeiss		成像
Image J（Fiji 版本）			图像分析与处理
Adobe Creative Cloud	Adobe		图像分析与处理
图像分析计算机系统	Dell	Intel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz	图像处理/展示