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方法文章

秀丽隐杆线虫神经元中微管动态与取向的活体评估

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DOI：

10.3791/62744

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2021年11月20日

 , 
1DBT-National Brain Research Centre

本文内容

摘要

动态微管成像方案 体内 使用荧光标记的末端结合蛋白对秀丽隐杆线虫后侧微管（PLM）神经元中动态微管进行标记、成像和分析的方法已得到描述。 秀丽隐杆线虫.

摘要

在神经元中，微管的取向是识别轴突和树突的关键指标：轴突的微管呈正端朝外，而树突的微管通常具有混合取向。本文描述了标记、成像和分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）触觉神经元发育与再生过程中微管动态行为及生长的方法。利用基因编码的微管末端荧光报告系统，我们对轴突内的微管进行了成像。该方案可用于量化在轴突切断后启动轴突再生过程中微管行为的局部变化。本检测方法可适用于其他类型的神经元和不同遗传背景，以研究微管动态在多种细胞过程中的调控机制。

引言

神经元具有复杂的结构，包含树突、胞体、轴突和突触等特化区室。神经元细胞骨架由微管、微丝和神经丝构成，其独特的组织形式在结构和功能上支持着神经元的不同区室1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。多年来，微管的组织方式被确认为决定神经元极性和功能的关键因素。在神经元发育或再生过程中发生结构重塑时，微管的动力学行为和取向决定了各种神经元区室的身份特征、极性运输、生长及发育过程7。因此，必须在活体条件下评估微管的动力学行为和取向，以与神经元的重塑过程建立关联。

微管由α和β微管蛋白异源二聚体的原纤维组成，具有动态的正端和相对稳定的负端11,12. 加端复合物及相关末端结合蛋白的发现为评估微管组织提供了研究平台13末端结合蛋白（EBP）会瞬时结合到微管的生长正端，其结合动力学与微管原纤维的生长相关。14,15由于加端复合物与微管频繁地结合和解离，GFP标记的EBP的点扩散函数表现为一个 "彗星" 在延时电影中15,16. 自从在哺乳动物神经元中首次观察到这一现象以来16，已利用荧光蛋白标记的末端结合蛋白在不同模式系统和神经元类型中测定微管动力学17,18,19,20,21,22,23.

由于其简单的神经系统和透明的身体， 秀丽隐杆线虫 已被证明是研究发育和再生过程中神经元重塑的优良模型系统 体内. 本文描述了在触觉神经元发育与再生过程中标记、成像和分析微管动态及生长的方法 秀丽隐杆线虫 利用基因编码的 EBP-2::GFP，我们对 PLM 神经元中的微管进行了成像，从而能够确定该神经元两种不同神经突中微管的极性24该方法可观察并量化EBP彗星结构，以评估不同细胞环境中的微管动态。例如，可通过本方案检测轴突切断后启动轴突再生的微管行为局部变化。该检测方法可适用于多种细胞类型和遗传背景下，研究微管动态在各种细胞过程中的调控机制。

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方案

1. 报告基因菌株：培养与保藏

注意：为了测量 PLM 神经元中微管的动力学和取向，我们使用了在触觉神经元特异性启动子 mec-4（juIs338 等位基因）驱动下表达 EBP-2::GFP 的线虫品系18,25,26。该品系采用标准的线虫培养与维持方法27。

  1. 制备线虫生长培养基（3.0 g/L 氯化钠、2.5 g/L 蛋白胨、20.0 g/L 琼脂、10 mg/L 胆固醇（由10 mg/mL 储备液稀释）），加水溶解后高压灭菌。
  2. 将培养基混合物短暂冷却10–15分钟，然后加入1 mM 氯化钙、1 mM 硫酸镁和25.0 mM 磷酸二氢钾（pH 6.0）。
  3. 使用无菌分液器将约9 mL培养基倒入60 mm培养皿中，室温下无菌环境中静置一天，随后于4 °C保存。
  4. 制备50 mL LB液体培养基（5.0 g/L 氯化钠、10.0 g/L Bacto-Tryptone），高压灭菌并冷却后，接种单个大肠杆菌（Escherichia coli OP50菌株）菌落。
  5. 在37 °C下培养细菌12小时。将冷藏的NGM平板恢复至室温用于接种，使用无菌玻璃涂布棒将OP50菌液均匀涂布于NGM平板表面。
  6. 将接种后的NGM平板置于37 °C培养12小时，以形成用于秀丽隐杆线虫（C. elegans）培养的细菌菌苔。这些平板可存放于20 °C培养箱中，待后续使用。
  7. 在已接种细菌的NGM平板上培养转基因品系。
  8. 将铂金丝接种环在火焰上灭菌，挑取20–25只产卵期成年雌雄同体个体，转移至新接种的培养皿中。
  9. 转移后，将培养皿置于20 °C培养箱中1小时，随后移除成虫。此时培养皿中将含有发育同步的卵。
  10. 将含有卵的培养皿继续置于20 °C培养箱中培养，直至线虫发育至目标阶段，本实验中为产卵后43.5小时的L4幼虫阶段。如需更多个体，可同时培养多块平板以避免过度拥挤。
  11. 在目标发育阶段，可将线虫置于载玻片上进行EBP-2::GFP彗星结构的显微成像。

2. 样品制备：用于成像EBP-2彗星的线虫固定

注意：为了实现对 PLM 神经元中 EBP 斑点的活体观察，我们将线虫置于琼脂糖垫上，以最大限度减少其活动性，同时不损害神经元的生理状态。在多种固定方法中，我们选择了 commercially readily available 的 0.1 µm 聚苯乙烯微球溶液。我们详细说明了专门用于 EBP-2::GFP 观察的制片步骤。

  1. 在5 mL玻璃试管中，将0.2 g琼脂糖溶于2 mL 1× M9缓冲液（0.02 M KH2PO4、0.02 M Na2HPO4、0.008 M NaCl、0.02 M NH4Cl）中，用火焰加热制备10%琼脂糖溶液。该试管可轻松放入加热块中，使琼脂糖保持熔融状态直至使用。
  2. 使用宽口滴管，将约100 µL熔融琼脂糖滴加至一块尺寸为35 mm × 25 mm的洁净载玻片上。
  3. 在琼脂糖仍处于熔融状态时，用另一块载玻片压住液滴，使琼脂糖在两块载玻片之间形成一层薄膜。琼脂糖约在30秒内凝固，形成厚度约为0.5–1.0 mm的凝胶膜。
  4. 琼脂糖凝固后，用非惯用手握住底部载玻片，惯用手握住顶部载玻片。固定底部载玻片，翻转顶部载玻片，使琼脂糖垫粘附于其中一块载玻片上。
  5. 若形成的琼脂糖垫大于盖玻片尺寸（18 mm × 18 mm），则修剪其边缘至所需尺寸，以确保盖玻片能正确放置。这些琼脂糖垫仅供立即使用，不应储存。
  6. 目视检查琼脂糖垫表面是否光滑、湿润且适合封片。若琼脂糖垫暴露于空气中而变干，其表面会出现皱褶。在此情况下，应按照本节步骤2–6重新制备新鲜琼脂糖垫。
  7. 在琼脂糖垫上加入2 µL浓度为0.1 µm的聚苯乙烯微球溶液，作为封片介质。
  8. 使用铂金丝挑取3–4条线虫，转移至未接种细菌的NGM平板上。此步骤可去除附着于线虫表面的细菌，避免其在封片过程中干扰固定效果。
  9. 待线虫爬离表面细菌后，用铂金丝重新挑取并将其悬浮于琼脂糖垫上的聚苯乙烯微球液滴中。
  10. 小心地将一块18 mm × 18 mm的盖玻片覆盖在线虫上。为防止封片后线虫内脏外溢，盖玻片放置后不得移动。
  11. 将制备好的玻片安装至显微镜上进行成像。

3. 成像设置与采集

注意：据观察，EBP 彗星在哺乳动物以及 C. elegans 的 PLM 神经元中的移动速度约为 0.22 µm/s16,18。为了根据奈奎斯特准则28对时间序列成像中的事件进行最佳采样，所需的空间和时间尺度分别为 0.09 µm 和 0.43 s。为防止光毒性或光漂白，我们采用了转盘式显微成像（Spinning Disk）采集方式。我们将在下方描述成像装置及采集参数设置。

  1. 使用配备转盘单元和相机的倒置显微镜拍摄图像。按照制造商的说明开启设备。
  2. 启动控制该设备的软件。
  3. 由于使用的是倒置显微镜，将载有样本的载玻片放置在载物台上，选用低倍物镜（5x 或 10x），并使盖玻片朝下。
  4. 将光路设置为目视或可见光模式，透射光使用卤素灯照明，反射光使用汞弧灯照明。
  5. 在明场模式下对焦并使目标线虫位于视野中央。
  6. 滴加浸油，将放大倍数切换至 63x（1.4NA/油），并在明场下重新对焦线虫尾部以观察 PLM 神经元。
  7. 短暂开启汞弧灯的荧光照明以重新对焦 PLM 神经元。在光路中插入正确的反射镜组（AF488），用于 GFP 的观察。
  8. 通过将光路导向相机，将显微镜设置为相机采集模式。
    注意：通过显微镜的薄膜晶体管（TFT）屏幕控制上述步骤 4–7 可加快操作速度，并避免样本不必要的光照暴露。也可通过软件控制照明和反射镜组。
  9. 在软件界面中，当 PLM 神经元已在视野中对焦后，选择 488 nm 激光，激光功率设为 30%，相机曝光时间为 300 ms，电子倍增（EM）增益值设为 70。根据报告基因的表达情况，可适当调整这些参数。将这些设置保存为配置文件，以便后续成像实验使用。
  10. 通道 选项卡用于存储各个具有特定照明和相机设置的通道轨道。高亮显示的轨道可用于实时预览；若要采集图像，则需勾选相应轨道。为在工作区中实时观察线虫尾部，应高亮显示明场（DIC）通道。样本应在工作区的实时成像窗口中完成对焦和居中。
  11. 高亮显示 488 nm 激光激发通道，以便在实时成像窗口中快速对焦 PLM 神经元。对焦完成后，按照下一步所述设置时间序列参数，开始时间序列采集。
  12. 使用 488 nm 激光照明，设置一个持续 2 分钟的时间序列实验，帧间无时间间隔。为保持图像采集的时间尺度一致性，仅采集 GFP 荧光信号。
  13. 点击开始实验 选项卡启动采集。使用 63x 物镜时，空间分辨率为 0.21 µm，相机以 0.09 µm 的像素尺寸进行采样。以 3.3 帧/秒的速度采集延时图像，以充分采样目标事件。该延时图像共包含在 2 分钟内采集的 396 个时间帧。采集完成后，将图像保存为默认 格式，后续可通过默认软件 或 ImageJ 进行访问。

4. 观察与分析

  1. 在默认软件中预览延时成像采集结果，或通过 Image J 的 Bioformats 插件打开图像。
    注意：我们已在 Image J 中描述了图像分析的过程。
  2. 在 ImageJ 中安装 Bioformats 插件。
    1. 或者，将默认 格式文件导出为 .tif 格式，以确保与 ImageJ 的兼容性。ZEN2 中的导出功能会将图像的每一帧保存为独立的 .tif 文件。我们避免使用此方法，以防止生成大量文件。
  3. 通过 ImageJ 的“Bioformats”插件直接以 '.czi' 格式打开图像。图像将以多图像堆栈形式打开。如果使用默认软件的"导出”功能，则需在 ImageJ 中使用以下工作流程将图像重新构建成多图像堆栈：ImageJ 程序 > 图像菜单 > 堆栈子菜单 > 图像合成为堆栈。
  4. 使用图像窗口左下角的播放 图标将图像以视频形式预览。在 PLM 神经元的胞体及突起中，可观察到明亮且可移动的点状结构即为彗星状信号。若彗星状信号清晰可见，则继续执行步骤 8；否则，请执行本节中的步骤 5–7。
  5. 使用查找表（LUT）将图像的颜色配置转换为灰度图像：ImageJ 程序 > 图像菜单 > 查找表子菜单 > 选择灰度。
  6. 反转图像的 LUT 配置以方便观察：ImageJ 程序 > 图像菜单 > 查找表子菜单 > 反转 LUT。
  7. 调整图像的亮度和对比度以清晰观察彗星状信号：ImageJ 程序 > 图像菜单 > 调整子菜单 > 亮度/对比度。
    1. 移动最小值、最大值、亮度和对比度滑块，以实现图像中强度的合适缩放。我们对彗星状信号清晰可辨的图像进行了量化分析。
  8. ImageJ 的基础版本在启动时会显示一系列工具图标。找到并右键单击带有线条图标的工具以打开下拉菜单，选择分段线。在感兴趣区域（ROI）上绘制分段线，其起点应位于神经元胞体上或附近。
    1. 为便于后续分析，通过 ROI 管理器保存已绘制的分段线 ROI，操作流程如下：ImageJ > 分析 > 工具 > ROI 管理器 > 在图像中选择已绘制的轨迹，点击 ROI 管理器窗口中的添加 > 点击 ROI 管理器窗口中的更多 > 保存。
  9. 在生成明场图（kymograph）之前，由于空间和时间尺度不同，需移除标尺以获得以像素为单位的测量值，操作如下：
    ImageJ > 分析 > 设置标尺 > 点击清除标尺 > 确定。
  10. 使用图像 > 堆栈下拉菜单中的重新切片 功能生成明场图。明场图是将分段 ROI 随时间变化的可视化表示，其中横轴代表距离，纵轴代表时间。对角线轨迹代表移动的彗星状信号。通常，明场图会继承原图像的颜色配置；否则，可按照前述步骤 5–6 所述方法指定颜色配置，以便于观察对角线轨迹。
  11. 使用直线工具的下拉菜单中的直线功能（参见本节步骤 9），在每条对角线轨迹上绘制直线，并将其添加至 ROI 管理器中。
  12. 在分析 选项卡下，进入设置测量值 ，选择平均强度和边界矩形参数以用于测量轨迹。
  13. 在 ROI 管理器窗口中，点击测量，将弹出结果窗口，显示 ROI 的平均强度、线迹的 X 和 Y 坐标、宽度、高度、角度和长度。该窗口可保存为 .csv 格式，随后导入数据分析程序中进行处理。
  14. 在电子表格程序中，结果窗口将以行列分布的形式打开。相关数值包括轨迹的宽度、高度和角度。宽度表示轨迹的位移，高度表示持续时间，角度表示运动方向向量。由于宽度和高度值以像素为单位，需分别乘以空间和时间标尺，以获得标准可测参数。
  15. 由于明场图左侧靠近细胞体，可根据角度将彗星状信号分类为正端向外或负端向外（即分别远离或朝向细胞体）。将角度在 1° 至 -89° 范围内的归类为正端向外，-91° 至 -179° 范围内的归类为负端向外。将多个明场图的数据汇总至电子表格中进行研究，并进行统计学表示。

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结果

作为一个代表性示例，我们描述了在PLM神经元的稳态轴突和再生轴突中对EBP彗星结构的活体观察。PLM神经元位于线虫尾部，具有一条向前延伸并形成突触的长轴突以及一条较短的向后突起。这些神经元紧邻表皮沿前后方向生长，负责介导线虫对轻触刺激的感觉。由于其结构简单，且易于进行成像和显微手术操作，PLM神经元已被广泛用于研究微管细胞骨架29、轴突运输30,31、再生能力19,32、神经元极性24,33,34、行为与衰老35,36，以及其他多种神经元过程。本研究利用在<...

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讨论

多年来，微管动力学一直是细胞骨架研究领域的关键关注点。微管经历成核和灾变，并伴随着持续的动态不稳定性过程44,45,46,47。这些信息大部分是通过体外实验获得的，例如通过光散射检测游离与聚合微管蛋白，以及利用荧光标记微管蛋白进行微管生长实验等48。尽管在较薄的细胞中可以实现对荧光和非荧光微管的活体观察，但在体内测量微管动力学仍具有挑战性。

利用这种转基因品系，也可对其他触觉神经元（如PVM、ALM和AVM）的微管取向进行评估。此处描述的成像和分析方法可适用于具有适当报告基因转基因的其他C. elegans神经元类型，但不同神经元之间彗星状信号动态的变异性是预期存在的49...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢 Yishi Jin 和 Andrew Chisholm 对本研究的初始支持以及所提供的菌株。实验所用大肠杆菌菌株 OP50 由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）商业购得。我们还感谢 Dharmendra Puri 在实验流程标准化方面所做的工作。本研究得到了印度生物技术部资助的国家脑研究中心核心经费、DBT/惠康信托印度联盟早期职业资助（项目编号：IA/E/18/1/504331，授予 S.D.）、惠康信托-DBT 印度联盟中期资助（项目编号：IA/I/13/1/500874，授予 A.G.-R）以及印度科学与工程研究委员会（SERB：CRG/2019/002194，授予 A.G.-R）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CZ18975 线虫品系Yishi Jin 实验室CZ18975由 Anindya Ghosh-Roy 构建
琼脂糖SigmaA9539线虫封片
盖玻片（18 mm × 18 mm）Zeiss474030-9010-000线虫封片
带加热模块的干浴器Neolab线虫封片
载玻片（35 mm × 25 mm）Blue Star线虫封片
聚苯乙烯微球溶液（4.55 × 10¹³ 粒子/mL，水相介质含极少量表面活性剂）Polysciences Inc.00876线虫封片
试管线虫封片
OP50 细菌品系秀丽隐杆线虫遗传中心（CGC）OP50线虫操作
60 mm 培养皿Praveen Scientific20440线虫操作
吸管/毛细管VWR53432-921线虫操作
培养箱PanasonicMIR554E线虫操作
铂金丝线虫操作
带荧光附件的体视显微镜LeicaM165FC线虫操作
0.3% 氯化钠Sigma71376线虫生长培养基
0.25% 蛋白胨T M Media1506线虫生长培养基
10 mg/mL 胆固醇SigmaC8667线虫生长培养基
1 mM 氯化钙二水合物Sigma223506线虫生长培养基
1 mM 硫酸镁七水合物SigmaM2773线虫生长培养基
2% 琼脂T M Media1202线虫生长培养基
25 mM 磷酸二氢钾（一碱式）SigmaP9791线虫生长培养基
0.1 M 磷酸二氢钾（一碱式）SigmaP97911× M9 缓冲液
0.04 M 氯化钠Sigma713761× M9 缓冲液
0.1 M 氯化铵Fisher Scientific214051× M9 缓冲液
0.2 M 磷酸氢二钠七水合物（二碱式）SigmaS93901× M9 缓冲液
玻璃瓶Borosil缓冲液储存
488 nm 激光器Zeiss成像
5× 物镜Zeiss成像
63× 物镜Zeiss成像
相机PhotometricsEvolve 512 Delta成像
转盘共聚焦系统计算机HPIntel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz成像
落射荧光显微镜ZeissObserver.Z1成像
卤素灯Zeiss成像
汞弧灯Zeiss成像
转盘共聚焦单元YokogawaCSU-X1成像
ZEN2 软件Zeiss成像
Image J（Fiji 版本）图像分析与处理
Adobe Creative CloudAdobe图像分析与处理
图像分析计算机系统DellIntel ® Core ™ i7-9700 CPU 3.00GHz图像处理/展示

参考文献

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