方法文章

穿梭箱实验作为成年斑马鱼学习与记忆研究中认知评估的关联学习工具

DOI：

10.3791/62745

⸱

2021年7月12日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Zebrafish Research, University of Notre Dame, 3Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, University of Notre Dame

本文内容

摘要

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学习和记忆是研究发育过程、疾病相关或环境诱导的认知障碍时的重要指标。大多数认知评估方法需要专用设备并耗费大量时间。然而，穿梭箱实验是一种利用常规凝胶电泳槽对成年斑马鱼认知能力进行快速、可靠评估的联合学习工具。

摘要

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认知功能障碍，包括学习和记忆能力受损，是多种发育性和年龄相关性神经退行性疾病以及创伤性脑损伤（TBI）的主要症状。斑马鱼因其在发育过程中的透明性以及神经损伤后强大的再生能力，成为重要的神经科学研究模型。尽管目前已存在多种斑马鱼认知检测方法，但大多数快速认知评估主要检测非关联性学习；而关联性学习检测通常需要数天甚至数周时间。本文介绍一种利用有害刺激（电击）的快速关联性学习检测方法，且所需准备时间极短。本文所展示的穿梭箱实验操作简便，非常适合初学者，且所需设备极少。我们证明，该穿梭箱检测方法在TBI后能够稳定地评估从幼年到老年斑马鱼的认知功能障碍及其恢复情况。此外，该方法可灵活用于检测即时记忆或延迟记忆。我们发现，单次TBI和重复TBI均会显著损害学习能力和即时记忆，但对延迟记忆无明显影响。因此，我们得出结论：穿梭箱实验能够稳定地追踪认知功能障碍的发展进程及恢复情况。

引言

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学习和记忆通常被用作评估认知功能障碍的指标，而认知功能障碍可由衰老、神经退行性疾病或损伤引起。创伤性脑损伤（TBIs）是最常导致认知缺陷的损伤类型。由于TBIs与多种神经退行性疾病（如额颞叶痴呆和帕金森病）相关，其日益受到关注1,2。此外，在部分TBI患者中观察到β-淀粉样蛋白聚集增加，提示其可能也与阿尔茨海默病的发生有关3,4。TBI通常由钝力创伤引起，严重程度各异5，其中轻度脑损伤（miTBI）最为常见。然而，由于miTBI仅导致短暂的轻微认知障碍，且受伤个体通常能完全恢复，因此常被漏报或误诊6。相比之下，反复发生的miTBI事件正引起越来越多的关注，因其在青壮年人群中高度普遍，可能随时间累积7，影响认知发育，并加剧神经退行性疾病进程1,2,3,4,

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方案

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斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本手稿中描述的方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会（动物福利保证编号 A3093-01）的批准。

1. 穿梭箱学习范式（图1A）

注意：该学习范式可快速评估与联想学习相关的认知能力。

  1. 通过在尺寸为 30.5 × 19 × 7.5 cm 的凝胶电泳槽两侧各添加一块 5 × 19 cm、呈 45° 角的水族级有机玻璃，改装成穿梭箱。在水箱中央位置做一条标记线，用于判断鱼是否穿过水箱中线（图 1B）。
  2. 向穿梭箱中加入 800 mL 系统用水。系统用水的配制方法为：将 60 mg Instant Ocean 溶解于 1 L 去离子 RO 水中。加水至水箱中部，水深达 5 cm。
    注：每小时或每测试 3 条鱼后，需更换为新鲜的 28 °C 系统用水。
  3. 将 2–3 条鱼放入一个置于暗室中的暂养箱内，该暗室即为后续进行穿梭箱实验的场所。
    1. 在暗室内，将 1 条鱼放置于穿梭箱中央，盖上盖子，并将电极连接至电源。
      注：在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
  4. 让鱼在穿梭箱中适应 15 分钟。
    注：....

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结果

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本研究中所述的学习范式（见方案与示意图，图1）可快速评估与关联学习相关的认知能力。此外，该范式具有高度严谨性，将学习定义为连续5次成功试验的重复且一致的表现。该范式同样适用于不同年龄阶段及损伤状态的个体。在8个月（青年成年）、18个月（中年成年）和24个月（老年成年）的未损伤鱼类中，学会回避红光行为所需的试验次数相似（未损伤8个月：15.28 ± 4.92次，18个月：17.66 ± 5.5次，24个月：16.2 ± 4.79次，8个月 vs. 18个月，p=0.92；8个月 vs. 24个月，p=0.98；18个月 vs. 24个月，p=0.97， 图2A）。我们还采用了重度钝力性脑外伤（sTBI）模型22，观察到不同年龄的鱼类在伤后1至5天内掌握该检测所需的试验次数亦相似（伤后天数：dpi；8个月 vs. 18个月，p=0.09；8个月 vs. 24个月，p=0.96；18个月 vs. 24个月，p=0.12，

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讨论

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认知功能障碍会显著且负面地影响生活质量。由于脑震荡和创伤性脑损伤在人群中的发生率和受关注程度日益增加，了解这些损伤如何导致认知障碍，以及如何将损伤最小化或逆转，变得尤为重要。因此，可用于检测认知衰退的模式生物在这些研究中发挥着关键作用。长期以来，啮齿类动物一直是研究神经行为和认知的主要模型，然而斑马鱼作为一种具有多种明确行为特征的模型已逐渐兴起，可用于研究一系列发育性、年龄相关性及后天获得性认知缺陷17,20,23,24,25,26。已有多种方法被用于评估认知功能，包括从习惯化形式的一维学习，到复杂的学习与空间记忆、新物体与新位置识别以及决策能力 18,.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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作者谨此感谢Hyde实验室成员的深入讨论，以及圣母大学Freimann生命科学中心技术人员在斑马鱼饲养与管理方面的支持。本研究得到圣母大学斑马鱼研究中心、圣母大学干细胞与再生医学中心，以及美国国立卫生研究院国家眼科研究所R01-EY018417（DRH）、美国国家科学基金会研究生研究基金项目（JTH）、圣母大学LTC Neil Hyland奖学金（JTH）、Sentinels of Freedom奖学金（JTH）和Pat Tillman奖学金（JTH）的资助。图1使用BioRender.com制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
手电筒Ultrafire9145
海水盐混合物Instant OceanSS15-10
大容量DNA凝胶电泳槽Fisher ScientificFB-SB-1316穿梭电泳槽
电源Fisher ScientificFB-105

参考文献

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  1. Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
  2. Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in la....

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