穿梭箱实验作为成年斑马鱼学习与记忆研究中认知评估的关联学习工具

摘要

学习和记忆是研究发育过程、疾病相关或环境诱导的认知障碍时的重要指标。大多数认知评估方法需要专用设备并耗费大量时间。然而，穿梭箱实验是一种利用常规凝胶电泳槽对成年斑马鱼认知能力进行快速、可靠评估的联合学习工具。

摘要

认知功能障碍，包括学习和记忆能力受损，是多种发育性和年龄相关性神经退行性疾病以及创伤性脑损伤（TBI）的主要症状。斑马鱼因其在发育过程中的透明性以及神经损伤后强大的再生能力，成为重要的神经科学研究模型。尽管目前已存在多种斑马鱼认知检测方法，但大多数快速认知评估主要检测非关联性学习；而关联性学习检测通常需要数天甚至数周时间。本文介绍一种利用有害刺激（电击）的快速关联性学习检测方法，且所需准备时间极短。本文所展示的穿梭箱实验操作简便，非常适合初学者，且所需设备极少。我们证明，该穿梭箱检测方法在TBI后能够稳定地评估从幼年到老年斑马鱼的认知功能障碍及其恢复情况。此外，该方法可灵活用于检测即时记忆或延迟记忆。我们发现，单次TBI和重复TBI均会显著损害学习能力和即时记忆，但对延迟记忆无明显影响。因此，我们得出结论：穿梭箱实验能够稳定地追踪认知功能障碍的发展进程及恢复情况。

引言

学习和记忆通常被用作评估认知功能障碍的指标，而认知功能障碍可由衰老、神经退行性疾病或损伤引起。创伤性脑损伤（TBIs）是最常导致认知缺陷的损伤类型。由于TBIs与多种神经退行性疾病（如额颞叶痴呆和帕金森病）相关，其日益受到关注^1,2。此外，在部分TBI患者中观察到β-淀粉样蛋白聚集增加，提示其可能也与阿尔茨海默病的发生有关^3,4。TBI通常由钝力创伤引起，严重程度各异⁵，其中轻度脑损伤（miTBI）最为常见。然而，由于miTBI仅导致短暂的轻微认知障碍，且受伤个体通常能完全恢复，因此常被漏报或误诊⁶。相比之下，反复发生的miTBI事件正引起越来越多的关注，因其在青壮年人群中高度普遍，可能随时间累积⁷，影响认知发育，并加剧神经退行性疾病进程^1,2,3,4,5，其影响与经历中度或重度TBI的个体相似⁸。

斑马鱼（Danio rerio）是研究多种神经科学问题的有用模型，包括在整个中枢神经系统中再生丢失或受损神经元的能力^{9,10,11,12,13}。神经再生也在端脑中得到证实，端脑的背内侧区域含有原脑皮层。这一神经解剖区域类似于海马体，可能在鱼类认知功能以及人类短期记忆中发挥重要作用^14,15,16。此外，斑马鱼的行为已被广泛表征和归类¹⁷。学习能力可通过多种技术进行研究，包括对惊吓反应的习惯化¹⁸，当以短时间区块进行并关注其快速衰减时间时，该方法可代表一种快速的非联想学习形式¹⁹。更复杂的联想学习测试，如T型箱、十字迷宫和视觉辨别^20,21，虽然已被使用，但通常耗时较长，需要数天至数周的准备时间，并依赖于群游行为或正向强化。本文中，我们描述了一种快速范式，用于评估联想学习以及即时或延迟记忆。该穿梭箱实验利用厌恶刺激和负强化条件反射，评估钝性创伤性脑损伤（TBI）后的认知缺陷及其恢复情况。我们证明，未受损的成年对照斑马鱼（8–24月龄）在穿梭箱中可在20次试验内（<20分钟评估时间）可靠地学会躲避红光，且不同观察者之间的结果具有高度一致性。此外，利用穿梭箱实验，我们证明成年斑马鱼（8–24月龄）的学习和记忆能力稳定，适用于检测认知功能，能够显著区分不同严重程度的TBI或重复TBI所导致的认知损伤。此外，该方法可快速用作评估多种疾病进展或药物干预在成年斑马鱼中对认知维持或恢复效果的指标。

本文提供了一种快速认知评估方法的指导性概述，可用于检测复杂的联想学习（第1部分）以及即时记忆和延迟记忆。该范式可对已习得的联想认知任务的短期和长期记忆进行评估（第2部分）。

方案

斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼设施中饲养和维护。本手稿中描述的方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会（动物福利保证编号 A3093-01）的批准。

1. 穿梭箱学习范式（图1A）

注意：该学习范式可快速评估与联想学习相关的认知能力。

1. 通过在尺寸为 30.5 × 19 × 7.5 cm 的凝胶电泳槽两侧各添加一块 5 × 19 cm、呈 45° 角的水族级有机玻璃，改装成穿梭箱。在水箱中央位置做一条标记线，用于判断鱼是否穿过水箱中线（图 1B）。
2. 向穿梭箱中加入 800 mL 系统用水。系统用水的配制方法为：将 60 mg Instant Ocean 溶解于 1 L 去离子 RO 水中。加水至水箱中部，水深达 5 cm。
   注：每小时或每测试 3 条鱼后，需更换为新鲜的 28 °C 系统用水。
3. 将 2–3 条鱼放入一个置于暗室中的暂养箱内，该暗室即为后续进行穿梭箱实验的场所。
   1. 在暗室内，将 1 条鱼放置于穿梭箱中央，盖上盖子，并将电极连接至电源。
      注：在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
4. 让鱼在穿梭箱中适应 15 分钟。
   注：实验人员应在适应期间留在房间内，或在测试开始前足够早地安静返回测试室，以便鱼能适应实验人员的存在。当鱼自由探索水箱时，可认为适应成功。
   1. 如果鱼未进行探索行为，则继续延长适应时间 15 分钟。若鱼仍无法适应穿梭箱环境，则将其移出，不得用于后续测试。
5. 适应结束后，使用一个带有红色镜片、亮度为 800 流明的手电筒，从凝胶电泳槽壁距离鱼所在侧约 2 cm 处手动照射。
   注：若鱼静止在穿梭箱深端靠近箱壁的铂丝电极旁，则不应开始试验。
6. 将光刺激直接照射在鱼身上，并随着鱼的横向移动手动移动光源，以确保持续可见刺激（图 1C）。持续提供光刺激，直至满足以下任一条件：
   1. 若鱼在 15 秒光照期间穿过水箱中线，则视为试验成功。一旦鱼越过中线，立即停止光刺激（图 1D）。
   2. 若鱼在 15 秒内未穿过水箱中线，则视为试验失败。此时使用电泳仪施加负向电击刺激（20 mV : 1 A），以开启 2 秒、关闭 2 秒的方式交替进行，持续 15 秒（最多给予 4 次电击），或直至鱼穿过水箱中线为止，此时同时终止光刺激和电击刺激。
7. 让鱼休息 30 秒，重复步骤 1.5–1.6.2。详细记录每次试验的成功（1.6.1）与失败（1.6.2）顺序。
   注：本研究中将学习定义为连续完成 5 次成功的试验。一旦确认鱼已学会，应立即将其从穿梭箱中取出并实施人道安乐死。

2. 记忆范式（图1A）

注意：该范式可用于评估习得性关联认知任务的短期和长期记忆。

1. 训练期
   1. 向穿梭箱中加入 800 mL 系统用水。系统用水的配制方法为：将 60 mg Instant Ocean 溶解于 1 L 去离子 RO 水中。加水至水箱中部，水深达到 5 cm。
      注意：每小时或每测试 3 条鱼后，应更换为新鲜的 28 °C 系统用水。
   2. 将 2–3 条鱼放入一个置于暗室中的暂养箱内，暂养箱中盛有系统用水，暗室即为后续进行穿梭箱实验的房间。
   3. 在暗室内，将 1 条鱼放置于穿梭箱中央，盖紧盖子，并将电极连接至电源。
      注意：在适应期和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
   4. 让鱼在穿梭箱中适应 15 分钟。
      注意：实验人员应在适应期间留在房间内，或在测试开始前足够早的时间安静地返回测试室，以便让鱼适应实验人员的存在。当鱼开始自由探索水箱时，表明适应成功。
   5. 如果鱼未进行探索行为，则继续适应 15 分钟。若鱼仍无法适应穿梭箱环境，则将其取出，不再用于后续测试。
   6. 成功适应后，手动将一个 800 流明红光镜头手电筒置于凝胶箱侧壁附近，距离约 2 cm，照射位置为鱼所在一侧的穿梭箱侧壁。
   7. 将光刺激直接照射在鱼体上，并随着鱼的侧向移动同步移动光源，以确保鱼能够持续观察到刺激。
   8. 在光照鱼体的同时，同步施加有害电刺激（20 mV:1 A），刺激模式为 2 秒开启、2 秒关闭，持续 15 秒（最多 4 次电击），或直至鱼越过穿梭箱中线。一旦鱼越过中线，立即终止光照和有害刺激。
      注意：让鱼休息 30 秒，然后重复步骤 2.1.6–2.1.8，共进行 25 次循环（图 1A）。
2. 初始测试
   1. 训练期结束后，让鱼休息 15 分钟，期间无需将其从穿梭箱中取出。紧接着进行初始记忆保持测试，以每次试验严格记录为通过或失败。
   2. 仅施加光刺激，最长持续 15 秒，并按以下方式记录反应。
      1. 若在光刺激开始后 15 秒内，鱼越过穿梭箱中线，则视为试验成功。一旦鱼越过中线，立即停止光刺激。
      2. 若在光刺激开始后 15 秒内，鱼未越过穿梭箱中线，则视为试验失败。15 秒后停止光刺激。
         注意：在初始测试期间，若试验失败，不施加任何有害刺激。
   3. 重复步骤 2.2.2，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.2.2.1）和失败试验次数（2.2.2.2）。该数值将作为每条鱼的个体参考值。
3. 即时记忆
   1. 在初始测试结束后立即按照选定的损伤模型（例如，使用改良 Marmarou 重物坠落法造成钝力损伤）诱导损伤。将鱼单独饲养以便于识别。记录其初始测试数值，并将鱼送回动物饲养设施。
      ​注意：鱼的钝力性脑损伤（TBI）模型构建方法如前所述²²。
   2. 在初始测试后 4 小时和/或损伤后 4 小时（或根据实验设计的时间点），从动物饲养设施中取出 2–3 条未损伤或已造成 TBI 的鱼。将所有鱼置于暗室中，分别放入盛有系统用水的独立水箱中。
   3. 将鱼逐条放置于穿梭箱中央（穿梭箱已按步骤 1.1 所述加入系统用水），盖紧盖子，连接电源，并让鱼适应 15 分钟。
   4. 适应结束后，仅施加光刺激（最长 15 秒），评估即时记忆（严格记录为通过或失败），并按以下方式记录反应。
      1. 若在 15 秒测试期内鱼越过箱体中线，则视为试验成功。一旦鱼越过中线，立即终止光刺激。
      2. 若在光刺激开始后 15 秒内鱼未越过箱体中线，则视为试验失败。15 秒结束后终止光刺激。
         注意：在此次损伤后测试中，若试验失败，不施加有害电刺激。
   5. 重复步骤 2.3.4，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.3.4.1）和失败试验次数（2.3.4.2）。
   6. 使用以下公式计算损伤后成功试验次数相对于初始测试期的百分比差异：
      
4. 延迟记忆
   1. 初始测试结束后，将已单独饲养以便于识别并记录初始测试数值的鱼立即送回动物饲养设施。
   2. 在初始测试与损伤之间，或在初始测试与延迟记忆测试之间，让鱼恢复 4 天（或根据实验设计的时间间隔）。
   3. 采用选定的损伤模型（例如，使用改良 Marmarou 重物坠落法造成钝力损伤）诱导损伤。将鱼单独饲养以便于识别其初始测试数值，并将鱼送回动物饲养设施。
      注意：鱼的钝力性脑损伤（TBI）模型构建方法如前所述²²。
   4. 在初始测试后 4 小时和/或损伤后 4 小时（或根据实验设计的时间点），从动物饲养设施中取出 2–3 条未损伤或已造成 TBI 的鱼。
   5. 将所有鱼置于暗室中，分别放入盛有系统用水的独立水箱中，逐条将鱼放置于穿梭箱中央（穿梭箱已按步骤 1.1 所述加入系统用水），盖紧盖子，连接电源，并让鱼适应 15 分钟。
   6. 适应结束后，仅施加光刺激（最长 15 秒），评估即时记忆（严格记录为通过或失败），并记录以下反应：
      1. 若在 15 秒测试期内鱼越过箱体中线，则视为试验成功。一旦鱼越过中线，立即终止光刺激。
      2. 若在光刺激开始后 15 秒内鱼未越过箱体中线，则视为试验失败，终止光刺激。
         注意：在此次损伤后测试中，若试验失败，不施加有害电刺激。
   7. 重复步骤 2.4.6，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.4.6.1）和失败试验次数（2.4.6.2）。
   8. 使用以下公式计算损伤后成功试验次数相对于初始测试期的百分比差异：
      

结果

本研究中所述的学习范式（见方案与示意图，图1）可快速评估与关联学习相关的认知能力。此外，该范式具有高度严谨性，将学习定义为连续5次成功试验的重复且一致的表现。该范式同样适用于不同年龄阶段及损伤状态的个体。在8个月（青年成年）、18个月（中年成年）和24个月（老年成年）的未损伤鱼类中，学会回避红光行为所需的试验次数相似（未损伤8个月：15.28 ± 4.92次，18个月：17.66 ± 5.5次，24个月：16.2 ± 4.79次，8个月 vs. 18个月，p=0.92；8个月 vs. 24个月，p=0.98；18个月 vs. 24个月，p=0.97， 图2A）。我们还采用了重度钝力性脑外伤（sTBI）模型²²，观察到不同年龄的鱼类在伤后1至5天内掌握该检测所需的试验次数亦相似（伤后天数：dpi；8个月 vs. 18个月，p=0.09；8个月 vs. 24个月，p=0.96；18个月 vs. 24个月，p=0.12，

讨论

认知功能障碍会显著且负面地影响生活质量。由于脑震荡和创伤性脑损伤在人群中的发生率和受关注程度日益增加，了解这些损伤如何导致认知障碍，以及如何将损伤最小化或逆转，变得尤为重要。因此，可用于检测认知衰退的模式生物在这些研究中发挥着关键作用。长期以来，啮齿类动物一直是研究神经行为和认知的主要模型，然而斑马鱼作为一种具有多种明确行为特征的模型已逐渐兴起，可用于研究一系列发育性、年龄相关性及后天获得性认知缺陷^{17,20,23,24,25,26}。已有多种方法被用于评估认知功能，包括从习惯化形式的一维学习，到复杂的学习与空间记忆、新物体与新位置识别以及决策能力 ¹⁸,^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手电筒	Ultrafire	9145
海水盐混合物	Instant Ocean	SS15-10
大容量DNA凝胶电泳槽	Fisher Scientific	FB-SB-1316	穿梭电泳槽
电源	Fisher Scientific	FB-105