穿梭箱实验作为成年斑马鱼学习与记忆研究中认知评估的关联学习工具

摘要

学习和记忆是研究发育过程、疾病相关或环境诱导的认知障碍时的重要指标。大多数认知评估方法需要专用设备并耗费大量时间。然而，穿梭箱实验是一种利用常规凝胶电泳槽对成年斑马鱼认知能力进行快速、可靠评估的联合学习工具。

摘要

认知功能障碍，包括学习和记忆能力受损，是多种发育性和年龄相关性神经退行性疾病以及创伤性脑损伤（TBI）的主要症状。斑马鱼因其在发育过程中的透明性以及神经损伤后强大的再生能力，成为重要的神经科学研究模型。尽管目前已存在多种斑马鱼认知检测方法，但大多数快速认知评估主要检测非关联性学习；而关联性学习检测通常需要数天甚至数周时间。本文介绍一种利用有害刺激（电击）的快速关联性学习检测方法，且所需准备时间极短。本文所展示的穿梭箱实验操作简便，非常适合初学者，且所需设备极少。我们证明，该穿梭箱检测方法在TBI后能够稳定地评估从幼年到老年斑马鱼的认知功能障碍及其恢复情况。此外，该方法可灵活用于检测即时记忆或延迟记忆。我们发现，单次TBI和重复TBI均会显著损害学习能力和即时记忆，但对延迟记忆无明显影响。因此，我们得出结论：穿梭箱实验能够稳定地追踪认知功能障碍的发展进程及恢复情况。

引言

学习和记忆通常被用作评估认知功能障碍的指标，而认知功能障碍可由衰老、神经退行性疾病或损伤引起。创伤性脑损伤（TBIs）是最常导致认知缺陷的损伤类型。由于TBIs与多种神经退行性疾病（如额颞叶痴呆和帕金森病）相关，其日益受到关注^1,2。此外，在部分TBI患者中观察到β-淀粉样蛋白聚集增加，提示其可能也与阿尔茨海默病的发生有关^3,4。TBI通常由钝力创伤引起，严重程度各异⁵，其中轻度脑损伤（miTBI）最为常见。然而，由于miTBI仅导致短暂的轻微认知障碍，且受伤个体通常能完全恢复，因此常被漏报或误诊⁶。相比之下，反复发生的miTBI事件正引起越来越多的关注，因其在青壮年人群中高度普遍，可能随时间累积⁷，影响认知发育，并加剧神经退行性疾病进程^1,2,3,4,5，其影响与经历中度或重度TBI的个体相似⁸。

斑马鱼（Danio rerio）是研究多种神经科学问题的有用模型，包括在整个中枢神经系统中再生丢失或受损神经元的能力^{9,10,11,12,13}。神经再生也在端脑中得到证实，端脑的背内侧区域含有原脑皮层。这一神经解剖区域类似于海马体，可能在鱼类认知功能以及人类短期记忆中发挥重要作用^14,15,16。此外，斑马鱼的行为已被广泛表征和归类¹⁷。学习能力可通过多种技术进行研究，包括对惊吓反应的习惯化¹⁸，当以短时间区块进行并关注其快速衰减时间时，该方法可代表一种快速的非联想学习形式¹⁹。更复杂的联想学习测试，如T型箱、十字迷宫和视觉辨别^20,21，虽然已被使用，但通常耗时较长，需要数天至数周的准备时间，并依赖于群游行为或正向强化。本文中，我们描述了一种快速范式，用于评估联想学习以及即时或延迟记忆。该穿梭箱实验利用厌恶刺激和负强化条件反射，评估钝性创伤性脑损伤（TBI）后的认知缺陷及其恢复情况。我们证明，未受损的成年对照斑马鱼（8–24月龄）在穿梭箱中可在20次试验内（<20分钟评估时间）可靠地学会躲避红光，且不同观察者之间的结果具有高度一致性。此外，利用穿梭箱实验，我们证明成年斑马鱼（8–24月龄）的学习和记忆能力稳定，适用于检测认知功能，能够显著区分不同严重程度的TBI或重复TBI所导致的认知损伤。此外，该方法可快速用作评估多种疾病进展或药物干预在成年斑马鱼中对认知维持或恢复效果的指标。

本文提供了一种快速认知评估方法的指导性概述，可用于检测复杂的联想学习（第1部分）以及即时记忆和延迟记忆。该范式可对已习得的联想认知任务的短期和长期记忆进行评估（第2部分）。

方案

斑马鱼在弗赖曼生命科学中心的圣母大学斑马鱼养殖设施中进行饲养和维护。本论文中描述的方法已获得圣母大学动物护理与使用委员会（动物福利保证编号 A3093-01）的批准。

1. 穿梭箱学习范式（图1A）

注意：该学习范式可快速评估与联想学习相关的认知能力。

1. 通过在尺寸为 30.5 x 19 x 7.5 cm 的电泳槽两侧各添加一块 5 x 19 cm 的水族箱级有机玻璃板，改装制备穿梭电泳槽 45° 角度。在鱼缸中央位置画一条线，用于判断鱼是否游过鱼缸中点图1B).
2. 向穿梭箱中加入 800 mL 系统水。通过将 60 mg Instant Ocean 溶解于 1 L 去离子反渗透水中制备该系统水。加水至水箱中部，水深达 5 cm。
   注意：用新鲜的系统水替换 28 °C 每小时或每检测3条鱼后。
3. 将2-3条鱼放入一个置于暗室中的暂养缸内，暗室内将进行穿梭箱实验，暂养缸中盛有系统用水。
   1. 在暗室中，将1条鱼置于穿梭箱中央，固定盖子，并将电极连接至电源。
      注意：在适应和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
4. 将鱼在穿梭箱中适应15分钟。
   注意：在适应期间，实验人员应留在实验室内，或在测试开始前有充足时间安静地返回测试室，以便鱼类适应实验人员的存在。当鱼类能够自由探索鱼缸时，可认为已成功适应。
   1. 如果鱼未进行探索行为，则继续适应15分钟。若鱼仍无法适应穿梭箱，则将其移出，不可用于后续测试。
5. 在适应后，手动将一个800流明的红光镜头手电筒置于鱼所在一侧的胶箱壁约2 cm处照射。
   注意：如果斑马鱼在穿梭箱深端靠近墙壁的铂丝旁休息，则不要启动试验。
6. 将光刺激直接照射在鱼体上，并手动跟随鱼的任何侧向移动调整光照位置，以确保持续观察到刺激（图1C）。持续提供光刺激，直至满足以下任一条件。
   1. 如果在15秒光照刺激期间，鱼游过水箱的中点位置，则视为该次实验成功。一旦鱼越过中点位置，立即停止光照刺激。图1D).
   2. 如果斑马鱼在15秒内未越过实验箱的中点，则视为该次实验失败。此时，使用电泳电源施加负向电刺激（20 mV:1 A），刺激模式为开启2秒、关闭2秒，交替持续15秒（最多给予4次刺激），或持续至斑马鱼越过实验箱中点为止，随即同时终止光照和电刺激。
7. 让鱼休息30秒，然后重复步骤1.5–1.6.2。详细记录成功试验（1.6.1）和失败试验（1.6.2）的顺序。
   注意：此处我们将学习定义为连续完成5次成功试验。一旦证实鱼类已学会，应将其从穿梭箱中取出并实施人道安乐死。

2. 记忆范式（图1A）

注意：该范式可用于评估习得性关联认知任务的短期和长期记忆。

1. 训练期
   1. 向穿梭箱中加入 800 mL 系统用水。该系统用水的配制方法为：将 60 mg Instant Ocean 溶解于 1 L 去离子 RO 水中。加水至水箱中部，水深达 5 cm。
      注：水应每隔 1 小时或每测试 3 条鱼后，更换为新鲜的 28 °C 系统用水。
   2. 将 2–3 条鱼放入一个置于暗室中的暂养箱内，该暂养箱中盛有系统用水，暗室即为将要进行穿梭箱实验的房间。
   3. 在暗室内，将 1 条鱼放置于穿梭箱中央，盖上盖子并固定，然后将电极连接至电源。
      注：在适应期和测试期间，房间应尽可能保持黑暗。
   4. 让鱼在穿梭箱中适应 15 分钟。
      注：实验人员应在适应期间留在房间内，或在测试开始前足够早的时间安静返回测试室，以便让鱼适应实验人员的存在。当鱼在箱内自由探索时，视为成功完成适应。
   5. 若鱼未表现出探索行为，则继续适应 15 分钟。若鱼仍无法适应穿梭箱环境，则将其取出，不再用于测试。
   6. 成功适应后，手动使用 800 流明的红光镜头手电筒，从鱼所在一侧的穿梭箱侧壁方向，距离约 2 cm 处照射凝胶盒侧壁。
   7. 将光刺激直接照射在鱼体上，并随着鱼的横向移动同步移动光源，以确保鱼持续感知到光刺激。
   8. 在光照鱼体的同时，同步施加有害电刺激（20 mV:1 A），交替通断 2 秒开、2 秒关，持续 15 秒（最多 4 次电击），或直至鱼越过箱体中线。一旦鱼越过中线，立即终止光照和有害刺激。
      注：让鱼休息 30 秒，然后重复步骤 2.1.6–2.1.8，共进行 25 次循环（图 1A）。
2. 初始测试
   1. 训练期结束后，让鱼休息 15 分钟，期间不将其从穿梭箱中取出。通过记录每次试验的结果（严格分为通过/失败），立即测试初始记忆保持情况。
   2. 仅施加光刺激，最长持续 15 秒，并按以下方式记录反应：
      1. 若在开始光刺激后 15 秒内，鱼越过穿梭箱中线，则视为试验成功。一旦鱼越过中线，立即停止光刺激。
      2. 若在开始光刺激后 15 秒内，鱼未越过穿梭箱中线，则视为试验失败。15 秒后停止光刺激。
         注：在初始测试期间，若试验失败，不施加有害刺激。
   3. 重复步骤 2.2.2，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.2.2.1）和失败试验次数（2.2.2.2）。该数值将作为每条鱼的个体参考值。
3. 即时记忆
   1. 初始测试结束后，立即按照选定的损伤模型（例如，使用改良 Marmarou 重物坠落法造成钝力创伤）诱导损伤。将鱼单独饲养以便于识别。记录其初始测试数值，并将鱼送回动物饲养设施。
      ​注：鱼的钝力性创伤性脑损伤（TBI）按先前所述方法造成²²。
   2. 在初始测试后 4 小时和/或损伤后 4 小时（或根据实验设定的时间点），从动物饲养设施中取出 2–3 条未损伤或已造成 TBI 的鱼。将所有鱼置于暗室中，分别饲养于盛有系统用水的独立水箱中。
   3. 将鱼逐条放置于穿梭箱中央（穿梭箱已按 1.1 所述方法用系统用水准备），盖上并固定盖子。连接电源，让鱼适应 15 分钟。
   4. 适应结束后，仅施加光刺激（最长 15 秒），评估即时记忆（严格分为通过/失败），并记录以下反应：
      1. 若在 15 秒测试期内，鱼越过箱体中线，则视为试验成功。一旦越过中线，立即终止光刺激。
      2. 若在开始光刺激后 15 秒内，鱼未越过箱体中线，则视为试验失败。15 秒结束后终止光刺激。
         注：在此次损伤后测试中，若试验失败，不施加有害电刺激。
   5. 重复步骤 2.3.4，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.3.4.1）和失败试验次数（2.3.4.2）。
   6. 使用以下公式计算损伤后成功试验次数相对于初始测试期的百分比差异：
      
4. 延迟记忆
   1. 初始测试结束后，立即将单独饲养的鱼送回动物饲养设施，以便于识别和记录其初始测试数值。
   2. 在初始测试与损伤之间，或在初始测试与延迟记忆测试之间，给予鱼 4 天（或根据实验设定的时间间隔）的恢复期。
   3. 采用选定的损伤模型（例如，使用改良 Marmarou 重物坠落法造成钝力创伤）诱导损伤。将鱼单独饲养以便于识别其初始测试数值，并将鱼送回动物饲养设施。
      注：鱼的钝力性创伤性脑损伤（TBI）按先前所述方法造成²²。
   4. 在初始测试后 4 小时和/或损伤后 4 小时（或根据实验设定的时间点），从动物饲养设施中取出 2–3 条未损伤或已造成 TBI 的鱼。
   5. 将所有鱼置于暗室中，分别饲养于盛有系统用水的独立水箱中，并逐条将其放置于穿梭箱中央（穿梭箱已按 1.1 所述方法用系统用水准备），盖上并固定盖子，连接电源，让鱼适应 15 分钟。
   6. 适应结束后，仅施加光刺激（最长 15 秒），评估即时记忆（严格分为通过/失败），并记录以下反应：
      1. 若在 15 秒测试期内，鱼越过箱体中线，则视为试验成功。一旦越过中线，立即终止光刺激。
      2. 若在开始光刺激后 15 秒内，鱼未越过箱体中线，则视为试验失败，终止光刺激。
         注：在此次损伤后测试中，若试验失败，不施加有害电刺激。
   7. 重复步骤 2.4.6，每次试验之间休息 30 秒，共进行 25 次试验，记录成功试验次数（2.4.6.1）和失败试验次数（2.4.6.2）。
   8. 使用以下公式计算损伤后成功试验次数相对于初始测试期的百分比差异：
      

结果

本研究中所述的学习范式（见实验方案与示意图（图1））可快速评估与关联学习相关的认知能力。此外，该范式具有较高的严谨性，将学习定义为连续5次成功通过的试验结果。该范式同样适用于不同年龄阶段及损伤情况。在8个月（年轻成年）、18个月（中年成年）和24个月（老年成年）的未损伤鱼类中，学会避免红光行为所需的试验次数相似（未损伤8个月：15.28 ± 4.92次，18个月：17.66 ± 5.5次，24个月：16.2 ± 4.79次，8个月 vs. 18个月 p=0.92，8个月 vs. 24个月 p=0.98，18个月 vs. 24个月 p=0.97， 图2A）。我们还采用了重度钝性创伤性脑损伤（sTBI）模型²²，观察到在损伤后1-5天内，不同年龄的鱼类掌握该检测所需的试验次数也相似（损伤后1天 vs. 5天；8个月 vs. 18个月，p=0.09；8个月 vs. 24个月，p=0.96；18个月 vs. 24个月，p=0.12，

讨论

认知功能障碍会显著且负面地影响生活质量。由于脑震荡和创伤性脑损伤在人群中的发生率和受关注程度日益增加，了解这些损伤如何导致认知障碍，以及如何将损伤最小化或逆转，变得尤为重要。因此，可用于检测认知衰退的模式生物在这些研究中发挥着关键作用。长期以来，啮齿类动物一直是研究神经行为和认知的主要模型，然而斑马鱼作为一种具有多种明确行为特征的模型已逐渐兴起，可用于研究一系列发育性、年龄相关性及后天获得性认知缺陷^{17,20,23,24,25,26}。已有多种方法被用于评估认知功能，包括从习惯化形式的一维学习，到复杂的学习与空间记忆、新物体与新位置识别以及决策能力 ¹⁸,^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手电筒	Ultrafire	9145
海水盐混合物	Instant Ocean	SS15-10
大容量DNA凝胶电泳槽	Fisher Scientific	FB-SB-1316	穿梭电泳槽
电源	Fisher Scientific	FB-105