一种用于评估缺血/再灌注大鼠模型中心肌微血管内皮屏障通透性的荧光检测方法

摘要

本文介绍了一种通过测量渗出的70,000 Da FITC-葡聚糖的平均荧光强度，并与伊文思蓝进行比较，从而在缺血/再灌注损伤后对心脏微血管内皮屏障功能进行评估的方法。

摘要

无论采用经皮冠状动脉介入治疗还是冠状动脉旁路移植术，对罪犯动脉进行血运重建治疗均被认为是改善急性冠脉综合征（ACS）患者临床预后的最佳策略。然而，有效血运重建后的心肌再灌注可能引发显著的心肌细胞死亡和冠状动脉内皮塌陷，这一现象被称为心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）。通常情况下，内皮细胞及其细胞间的紧密连接协同维持微血管内皮屏障及其相对较低的通透性，但在再灌注区域这一功能会失效。

由缺血/再灌注（IR）引起的微血管内皮高通透性可导致心肌水肿、促炎细胞浸润增加以及心肌内出血加重，这些因素可能恶化急性冠脉综合征（ACS）的预后。本研究使用的示踪剂——70,000 Da FITC-葡聚糖（一种由异硫氰酸荧光素（FITC）标记的支链葡萄糖分子）——在正常情况下分子过大，无法穿透心脏微血管内皮。然而，在心肌缺血/再灌注损伤（MIRI）后，该分子能够穿透受损的屏障。因此，内皮通透性越高，FITC-葡聚糖在血管外细胞间隙中的积聚就越多。由此，FITC荧光强度可反映微血管内皮屏障的通透性。本实验方案利用FITC-葡聚糖对心脏微血管内皮屏障功能进行功能性评估，并通过自动化定量病理成像系统进行检测。

引言

数十年来，尽管越来越多的冠心病患者从血运重建治疗中获益，但这并不能否定心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）所导致的致命后果。正如Yellon和Hausenloy所述，最终梗死面积中约有30%可归因于MIRI¹。心肌微血管内皮功能障碍是MIRI及“无复流”现象的核心机制，也是多种心脏保护药物和经典心脏保护通路的作用靶点²。此外，微血管内皮通透性增高可引发心肌水肿³，并导致中性粒细胞⁴、巨噬细胞和红细胞⁵等促炎性细胞过度浸润。

MIRI 引发的氧化应激以及促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子家族⁶和白细胞介素家族⁷）的过表达，会激活细胞凋亡信号通路，从而加速缺血心肌的死亡。红细胞穿透脆弱的内皮屏障，在细胞外基质（ECM）中积聚，形成心肌内血肿⁸。巨噬细胞和中性粒细胞来源的基质金属蛋白酶可降解ECM中的胶原蛋白，增加机械性并发症和梗死后心室动脉瘤的风险⁹。因此，内皮屏障的通透性是急性心肌梗死预后评估的重要指标，在一定程度上也反映了MIRI的严重程度。

FITC-葡聚糖是一类由不同长度的支链葡萄糖分子组成的多糖，其分子量范围为4,000 Da至70,000 Da。它被广泛用作标准示踪剂，用于检测细胞膜通透性以及血脑屏障等功能性生理屏障的通透性。¹⁰以及黏膜¹¹ 在特定处理和病理条件下，特定膜对不同物质的通透性因其分子量不同而有所差异。通常情况下，白蛋白受限于心肌微血管内；然而，在缺血-再灌注（IR）早期，白蛋白可穿透内皮屏障，导致心肌水肿。由于白蛋白的分子量约为68,000 Da，因此70,000 Da的FITC-葡聚糖是用于显示IR后内皮高通透性的合适示踪剂。此外，葡聚糖已广泛应用于维持休克患者的血容量和胶体渗透压，而FITC标记的示踪物已被用于众多研究中 体内 或 体外 不良反应较少的研究。

除了使用FITC-葡聚糖外，内皮通透性还可通过伊文思蓝（Evans Blue, EB）染色进行测定。EB注入血液循环后，会与血清白蛋白紧密结合并形成复合物¹²。因此，用于通透性检测的是EB-白蛋白复合物，而非游离EB。这意味着基于EB的方法的准确性可能受到实验对象血清白蛋白浓度差异的影响。此外，已有报道指出EB可通过细胞变性和血管通透性增加，对实验动物的器官（尤其是心脏、肝脏和肺脏）产生毒性作用¹³。经历缺血/再灌注的内皮细胞比正常内皮细胞对这类有害效应更为敏感，这可能干扰实验结果的准确性。

与伊文思蓝染料相比，FITC-葡聚糖为外源性物质，其与白蛋白的结合亲和力可忽略不计。因此，FITC-葡聚糖在体内保持游离状态，不会与白蛋白或组织蛋白等大分子物质结合。因此，若按体重给药，FITC-葡聚糖可在血液中维持相等的浓度，且不受个体间血清白蛋白浓度和血容量差异的影响。通心络（TXL）是一种中药，被用于测试该方法的诊断敏感性。TXL通过维持内皮细胞超微结构和内皮屏障完整性来减轻心肌缺血再灌注损伤（MIRI）¹⁴。临床上，TXL也用于治疗心绞痛，并改善心肌梗死后无复流现象¹⁵。其成分包括人参根、Buthus martensi、水蛭、土鳖虫、Scolopendra subspinipes、蝉蜕、赤芍根、酸枣仁、降香、白檀香和合成冰片。研究表明，TXL可通过MEK/ERK信号通路¹⁶以及内皮型一氧化氮合酶介导的机制^5,17保护微血管内皮，并以剂量依赖的方式缓解器官的缺血/再灌注损伤（IRI）¹⁸，尤其是心脏。本研究中，大鼠按0.5 g/kg剂量给予TXL粉末（相当于临床人用等效剂量），具体给药方法见文献¹⁹。本文提供了一种通过测定外渗的70,000 Da FITC-葡聚糖总荧光强度与伊文思蓝（EB）的比较，来功能性评估缺血再灌注后心脏微血管内皮屏障的方法。

方案

动物实验按照 "实验动物护理和使用的指南" 由美国国立卫生研究院（美国马里兰州贝塞斯达，NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）和 "实验动物护理与使用的管理条例" 由中国北京动物护理委员会（1996年）规定执行。本研究方案经阜外医院实验动物护理委员会批准。实验选用雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠），体重150–180 g。

1. 试剂、材料和仪器的准备

1. 准备试剂和溶液，包括70%乙醇、异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran，70,000 Da，溶于冰冻生理盐水中配制成10% w/v 溶液用于实验）、脱毛膏、含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，0.5–10 µg/mL）的封片剂、1% w/v 溴化乙锭/生理盐水溶液，以及5% w/v 戊巴比妥钠/生理盐水溶液（避光保存于4 °C）。
2. 预先对所有手术器械和材料进行灭菌，包括手术胶带、纱布垫、外科手套、16 G 气管插管、胰岛素注射器、手术剪、大型弯头解剖镊、直头解剖镊、直头蚊式止血钳、弯头蚊式止血钳、牵开器（30 mm 展开式）、5 cm 微型持针器、3-0 聚丙烯缝合线（圆锥形针头）和6-0 聚丙烯缝合线（圆形针头）。
3. 检查并确保所有设备处于良好工作状态，包括恒温加热系统、照明系统、呼吸机、自动定量病理成像系统以及紫外冷冻切片机。

2. 手术前大鼠的准备

1. 将所有SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（IR组）和通心络组（TXL组，即IR+TXL组）。
   注：本实验方案中，每组随机分配6只大鼠，n=6。
2. 称量每只SD大鼠的体重，记录体重数据，并计算每只大鼠所需给予的TXL剂量。
3. 在开胸术前至少12小时，通过灌胃方式以30 mg/kg的剂量给予每只大鼠布洛芬，以减轻术前疼痛和应激反应。
4. 按照文献¹⁹所述方法，在麻醉前12小时和1小时，通过灌胃方式以0.5 g/kg的剂量给予IR+TXL组每只SD大鼠通心络超微粉制剂。
5. 用70%乙醇对手术台进行消毒，并将已灭菌的手术器械和材料放置于消毒后的台面上。
6. 调节恒温加热系统的温度，使大鼠体温维持在37 ± 1 °C。

3. 建立大鼠心肌缺血/再灌注模型

1. 向大鼠腹腔注射5% w/v戊巴比妥钠/磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，剂量为50 mg/kg（0.1 mL/100 g体重），以进行麻醉。通过剃毛或使用脱毛膏小心去除颈部至胸部的毛发，准备手术区域。
2. 根据需要使用无菌镊子轻轻调整舌头位置，并用无菌棉球擦拭呼吸道分泌物。保持声门清晰可见，轻柔地将气管插管插入气管。
3. 将气管插管连接至呼吸机，设定呼吸频率为65–80次/分钟，并通过固定大鼠头部和四肢来调节潮气量至4–5 mL。
4. 用无菌手术巾覆盖大鼠，先用碘酊消毒手术区域，再用70%乙醇脱碘，重复此过程三次。
5. 在第四肋间水平做左侧胸骨旁切口，暴露左侧胸大肌和胸小肌。
6. 采用钝性分离技术分离胸大肌与胸小肌之间的筋膜，以暴露左侧第四肋间空间。
   注意：避免过度组织损伤和血管损伤，以免引起严重出血及术后死亡。
7. 分离肋间肌，在第四肋间置入胸廓牵开器，然后撑开肋骨。
8. 撕开心包膜并去除附着的脂肪组织。
   注意：避免使用锐利手术器械损伤其他器官，尤其是肺脏。肺组织损伤可能导致术中发生气胸或血气胸，进而引发从血流动力学紊乱到动物存活率下降等一系列不良后果。
9. 调整胸腺位置，轻柔暴露升主动脉和左心房。识别并用6-0聚丙烯缝线暂时结扎左前降支（LAD）近端45分钟（见图1 A-D）。
   注意：假手术对照组大鼠的操作步骤与此相同，但不结扎LAD。
10. 取出胸廓牵开器，使用3-0聚丙烯缝线以间断缝合法将肋骨拉拢闭合。
11. 恢复胸腔负压以确保有效呼吸。
    注意：恢复胸腔负压可采用两种方法：i）在关闭胸腔前，研究人员可堵塞呼吸机排气口2个呼吸周期，使肺膨胀；ii）在肋间切口缝合后，可用注射器抽出胸腔内残留空气。
12. 完成脱毛和消毒后，在右下肢做切口，分离右股静脉的浅筋膜。
13. 松开结扎线，在心肌缺血诱导45分钟后检查呼吸和循环状况。
14. 经股静脉注射10% (w/v) FITC-葡聚糖/生理盐水溶液，剂量为0.15 mL/100 g体重，并用无菌棉球压迫股静脉1分钟以止血（图2A,B）。
    注意：也可选择经股静脉注射1% w/v伊文思蓝（EB）/生理盐水溶液，剂量为0.5 mL/100 g体重。
15. 使用3-0聚丙烯缝线缝合切口并对切口进行消毒，随后按照前述方法给予布洛芬进行术后镇痛。

4. 荧光测量用冷冻组织切片的制备

1. 在心肌再灌注3小时后，通过腹腔注射5% w/v戊巴比妥钠/PBS溶液，剂量为150 mg/kg（0.3 mL/100 g体重），使大鼠深度麻醉。
2. 切开腹腔，暴露腹主动脉和下腔静脉（见图3A）。
3. 从下腔静脉稳定注入50 mL冰冻PBS，同时剪断腹主动脉以冲洗心肌中的血液，并取出心脏。
   注意：观察肺和肝脏的变化。肝脏表面出现水珠表明生理盐水准确注入下腔静脉（见图3C），肺组织呈苍白则提示心肌灌注良好（见图3B）。
4. 在暗室中，用冰冻生理盐水或PBS轻轻冲洗心脏，以去除心腔内残留的血液和FITC-葡聚糖（或EB）。
5. 从结扎线处剪下心脏，并弃去结扎线以上的心肌组织。
6. 将心脏置于包埋模具中，加入包埋剂后于-80 °C保存。
7. 将冷冻组织从包埋模具中取出，转移至冷冻切片机预冷至-20 °C的样品台中。
8. 调节单一切片厚度为5–8 µm，并沿心尖-心底轴中点附近（例如缺血区域中部）进行切片。
9. 将切片转移至载玻片上，每张切片滴加一滴（约40 µL）含DAPI的荧光封片剂进行封片。
10. 将载玻片置于干燥、避光的盒子中。
    ​注意：若无法立即扫描，应将载玻片存放在干燥、阴凉且避光的环境中，以防冷凝水形成和荧光淬灭。

5. 荧光测量与数据分析

1. 设置成像系统并检查与扫描仪连接的软件。
2. 将玻片放入玻片架中，并将其插入扫描仪。
3. 打开玻片扫描软件（参见材料表），通过点击编辑协议 | 新建…来设置新的曝光协议。
   注意：如果无法使用扫描仪或其配套软件，可使用激光共聚焦显微镜（参见材料表）或其他具备荧光模式的普通玻片扫描仪（参见材料表）作为自动定量荧光扫描仪的替代方案。
4. 重命名协议和研究项目，并选择荧光模式。
5. 将全片扫描 | 像素分辨率和多光谱区域 | 像素分辨率均设置为0.25 µm (40x)。
6. 点击编辑滤光片和波段…，选择全片扫描滤光片列和多光谱区域波段列。
   注意：若使用EB，请选择全片扫描滤光片 | DAPI和Texas Red 或 AF495；若使用FITC-葡聚糖，请选择多光谱区域波段 | DAPI和FITC或AF488。
7. 点击编辑曝光…并加载载物台。
8. 选择目标槽位，点击获取概览图。
   注意：此步骤将对每张心脏切片进行明场扫描。可选择心肌区域进行对焦，也可盲选区域。
9. 选择目标玻片，将载物台高度调整至约-50 µm，然后点击自动对焦。
10. 点击全扫描曝光时间(ms)-DAPI | 自动曝光。
    注意：由于DAPI图像仅用于显示心脏横截面，便于勾画心肌区域，但不用于计算荧光密度，因此每张玻片的DAPI曝光时间不必相同。
11. 点击全扫描曝光时间(ms)-FITC | 自动曝光。
    注意：若使用EB，则点击全扫描曝光时间(ms)-Texas Red | 自动曝光。务必记住并确保所有玻片扫描中FITC或Texas Red的曝光时间保持一致。
12. 再次点击自动对焦，确认玻片已清晰对焦。
13. 点击返回并保存协议。
14. 对每张玻片重复步骤5.7–5.14。
15. 返回主页并点击扫描玻片。
16. 选择槽位，重命名所有玻片，并为每张玻片选择相应的曝光协议。
17. 扫描玻片并采集图像。
18. 使用玻片查看软件打开扫描图像（参见材料表）。
19. 将所有图像放大至相近的倍数。
20. 截取图像并保存为.tiff格式。
    注意：建议同时保存带标尺和不带标尺的图像。带标尺的图像可用于发表，而不带标尺的图像可用于统计分析。
21. 打开ImageJ软件，点击分析，然后选择设置测量。
22. 选择面积 | 积分密度。
23. 在ImageJ中打开FITC通道的图像。
24. 再次点击分析，记录出现的积分密度数值（IntDen）。
    注意：由于计算机可能将图像中的标尺误认为荧光灰度，因此应使用不带标尺的图像测量IntDen。
25. 关闭FITC图像，打开DAPI通道的图像。
26. 勾画心肌的一个横截面区域。
27. 点击分析并收集面积数据。
28. 计算每颗心脏的IntDen/面积比值（平均荧光强度）。
29. 将所有比值输入统计分析软件中进行分析。

结果

在进行FITC-葡聚糖实验以评估心肌缺血再灌注（IR）后心脏内皮通透性的变化之前，我们强烈建议由同一位擅长建立大鼠心肌IR模型的研究人员来完成实验，以确保所有大鼠的冠状动脉阻塞位置一致且成功，并保证缺血区域/总面积的比例在各实验动物之间保持恒定。如图1A、B所示，暴露心脏（黄色箭头指示），并在左心室前壁心肌处（位于左心耳边缘下方约2 mm）使用内径为0.5 mm的毛细硅胶管和6-0缝线形成一个环状结构（绿色箭头指示）。如图1C所示，当收紧该环时，缺血心肌立即由粉红色变为灰粉色（白色箭头指示）。

此外，松开结扎线后，心肌立即恢复灌注并呈现粉红色，如图1D所示。松开结扎线后，在大腿内侧沿股骨长轴方向做一平行切口。暴露股静脉，并用胰岛素注射器穿刺，如图2A、B所示。经过3小时再灌注后，在下腹部做“V”形切口，将腹主动脉和下腔静脉从腹膜中分离出来（图3A）。轻轻向下腔静脉注入冷生理盐水，同时剪开腹主动脉，以防止心室壁因心室内压力过度扩张，从而影响其组织病理学结构。漂白的肺组织（图3B中红色箭头所示）以及图3C中的肝脏表明组织已得到良好的生理盐水再灌注。

因此，三组之间的横截面积差异无统计学意义：假手术组为1.00 ± 0.08，IR组为0.97 ± 0.08，IR+TXL组为1.02 ± 0.04（图 4A，每组 n = 6，p > 任意两组之间差异为0.05）。如图所示， 图4B, C假手术组大鼠全脑切片中绿色荧光的平均强度极低。相比之下，缺血再灌注组外渗的FITC-葡聚糖荧光强度显著增强，以假手术组为基准进行标准化后，缺血再灌注组的荧光强度为5.52 ± 0.85，假手术组为1.00 ± 0.19（n = 6，p < 0.05）。此外，已知通心络超微粉具有保护心肌微血管内皮的作用^14,16，显著逆转了IR诱导的较高荧光强度（IR+TXL组为2.87 ± 0.52，IR组为5.52 ± 0.85，n = 6，p < 0.05）。区域心肌的图像显示，FITC-葡聚糖主要积聚在细胞外基质中，而非微血管内，且通心络可改善内皮屏障功能（图5).

与FITC-葡聚糖相比，伊文思蓝（EB）可能是一个次优的替代选择，因为在图像质量和灵敏度方面，EB均逊色于70,000 Da的FITC-葡聚糖。同样，三组之间的横截面积无显著差异：假手术组为1.00 ± 0.08，缺血再灌注组（IR组）为0.97 ± 0.08，IR+TXL组为0.98 ± 0.05（补充图S1A，每组n = 6，任意两组间p > 0.05）。如补充图S1B,C所示，假手术组大鼠整个横截面的红色荧光平均强度相对较高，尤其是在心内膜和心外膜区域。尽管IR组中EB发出的红色荧光显著增强（IR组为4.41 ± 0.66，假手术组为1.00 ± 0.22，n = 6，p < 0.05），但IR+TXL组与IR组之间的差异并不显著（IR+TXL组为3.73 ± 0.47，IR组为4.41 ± 0.66，n = 6，p = 0.0956）。

此外，该方法还在心肌梗死（MI）模型中进行了测试（补充图 S2）。在心肌梗死先注射组（Myocardial Infarction Injection first，MII组）中，FITC-葡聚糖溶液（浓度同前文所述）于左前降支结扎前5分钟注入循环系统。这与本方案前文所述的MIL大鼠（Myocardial Infarction Ligation first，先结扎组）在结扎后立即注射FITC-葡聚糖溶液的处理方式相反。有趣的是，在两组心肌梗死大鼠中，仅有少量FITC-葡聚糖渗出至受损心肌的细胞外基质（ECM），表现为补充图 S2中较弱的绿色荧光强度。

图1：大鼠模型中开胸术视野及缺血/再灌注模型的建立。（A）暴露大鼠心脏（黄色箭头所示）；（B）形成环线以环绕冠状动脉（绿色箭头所示）；（C）收紧环线并诱导心肌缺血45分钟（白色箭头所示）；（D）松开环线，允许心肌再灌注3小时（蓝色箭头所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：股静脉分离与静脉内注射。（A）暴露股静脉（左侧箭头指示股神经；中间箭头指示股动脉；右侧箭头指示股静脉）。（B）使用胰岛素注射器将FITC-葡聚糖溶液注入股静脉。缩写：FITC = 异硫氰酸荧光素。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：组织灌注与有效灌注的症状。 （A）解剖腹主动脉和下腔静脉（白色箭头指示腹主动脉；黑色箭头指示下腔静脉）。（B）肺组织变白是灌注充分的表现；（C）黏膜变白、肾脏变白以及肝脏出汗均为灌注充分的表现（红色箭头：黏膜；白色箭头：肝脏；黑色箭头：肾脏）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4FITC-葡聚糖染色的代表性图像及平均荧光强度分析。 (A各组横截面积相对值，以假手术组横截面积为基准进行归一化处理（p > 0.05); (B) 各组在FITC通道中的相对荧光强度，以假手术组为基准进行归一化；C) 各组在 9.5 倍放大下的代表性图像。比例尺 = 800 µm。采用 Tukey 法进行单因素方差分析 事后 多组比较。* 与假手术组相比，p < 0.05；# 与 IR 组相比，p < 0.05。柱状图显示组均值±标准差。缩写：IR = 缺血/再灌注；TXL = 通心络；FITC = 异硫氰酸荧光素；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；ANOVA = 方差分析；SD = 标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5：FITC-葡聚糖染色后各组感兴趣区域在200倍放大下的代表性图像。 比例尺 = 50 µm。缩写：FITC = 异硫氰酸荧光素；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：伊文思蓝染色的代表性图像及平均荧光强度分析。（A）各组相对横截面积，以假手术组为基准进行归一化（p > 0.05）；（B）各组德克萨斯红通道的相对荧光强度，以假手术组为基准进行归一化；（C）各组代表性图像。采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合 Tukey's post-hoc 多组比较法。比例尺 = 800 µm。* 与假手术组相比，p < 0.05。柱状图显示各组均值 ± 标准差（SD）。缩写：IR = 缺血/再灌注；TXL = 通心络；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；ANOVA = 方差分析；SD = 标准差。请点击此处下载该文件。

补充图 S2：心肌梗死模型中 FITC-葡聚糖染色的代表性图像（9.5 倍放大）。 比例尺 = 800 µm。缩写：MII = 先注射心肌梗死（在诱导心肌梗死前注射 FITC-葡聚糖）；MIL = 先结扎心肌梗死（在诱导心肌梗死后立即注射 FITC-葡聚糖）；FITC = 异硫氰酸荧光素；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种用于评估心肌缺血-再灌注损伤（MIRI）后心脏内皮屏障功能障碍的实验方案。需要注意的是，该方案中有若干关键步骤决定了结果的可靠性和准确性。所有涉及异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）的操作均需在避光环境中进行。FITC-dextran/生理盐水溶液必须保存在4 °C，并用锡箔纸包裹。此外，必须按照图1所示结扎冠状动脉，以便在松开结扎线后心肌能够立即再灌注。研究人员可选择5-0或6-0聚乙烯缝合线，因为直径小于7-0的缝线更容易切断心肌纤维和血管。重要的是，示踪剂溶液应注入股静脉而非尾静脉。每颗心脏在处死前和处死后均应分别用冰冻生理盐水充分灌注和彻底冲洗。

许多专注于心肌缺血再灌注损伤（MIRI）的研究人员倾向于在心肌再灌注早期，通过电子显微镜检查内皮细胞亚细胞结构的破坏情况——如凋亡小体的形成、线粒体肿胀以及细胞间连接异常——来证明内皮通透性增高。免疫印迹法也被用于评估微血管通透性，因为紧密连接蛋白水平的下降被认为是内皮损伤及内皮屏障功能随时间失常的核心机制。例如，VE-cadherin²⁰ 和 β-catenin²¹ 是内皮细胞间黏附连接的关键组分，这些连接对于维持血管完整性具有重要作用²²。在循环系统中，紧密连接蛋白如 JAM-A^23,24 和 occludin²⁵ 也协同参与内皮屏障的构建。

目前，越来越多的研究表明，线粒体功能和线粒体稳态可能是对抗再灌注损伤的保护性通路的关键靶点。根据病理生理学和药理学研究报道，线粒体自噬在缺血-再灌注（IR）诱导的内皮细胞和心肌细胞死亡过程中可能发挥重要作用²⁶。此外，线粒体分裂、线粒体蛋白质稳态以及线粒体质量控制可能对再灌注区域的高危心肌具有保护作用^27,28。上述方法更多地侧重于揭示高通透性的不同机制或成因，而非直接、直观地展示内皮通透性。此外，用于电子显微镜检查的样品制备过程复杂且存在危险。电子显微镜中使用的戊二醛、丙酮和锇酸溶液可能挥发，并腐蚀黏膜、结膜和皮肤，在未受控环境中使用甚至可能危及生命。

与这些间接且危及生命的方法相比，本方法通过检测FITC-葡聚糖外渗所发射的荧光强度来评估心肌微血管通透性，具有显著优势。首先，在正常生理条件下，70,000 Da的FITC-葡聚糖无法穿透内皮层，但在缺血再灌注（IR）条件下可进入心肌间质空间，从而能够清晰区分不同处理组的大鼠。此外，FITC-葡聚糖溶液通过股静脉注入血液，可确保所有液体均进入大鼠循环系统。相比之下，尾静脉注射在大鼠中操作更为困难，因为尾静脉不明显且被较厚的角质层覆盖。此外，与常规的多聚甲醛固定和石蜡包埋不同，本研究采用快速冷冻病理切片技术，简化并优化了心肌组织处理流程。短暂的保存时间、避光环境以及低温冷冻保存可共同减轻FITC的荧光淬灭现象。

更重要的是，该方法可在统计分析过程中最大限度地减少选择偏倚。我们使用生理盐水进行充分的心脏灌流，以确保心肌和心腔内几乎所有与FITC-葡聚糖混合的血液均被冲洗干净，从而消除血管中残留FITC所发出的荧光。若未达到此效果，则应人工排除并修剪与毛细血管重叠的荧光信号。在采集感兴趣区域组织时，缺血心肌与远端心肌之间未观察到明显的视觉边界，尤其是在使用伊文思蓝染色后，这阻碍了从这些代表性区域采集样本。通过本文所述方法，研究人员可获得完整切片的图像，并利用定量滑动扫描仪分析荧光强度。

有趣的是，溴化乙锭（EB）染料可作为异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）的一种替代方案，尽管其效果次优。与FITC-dextran相对苛刻的储存条件相比，EB粉末或其溶液在室温下可长期保持稳定。此外，EB对大多数机构而言成本相对较低。然而，某些缺点可能限制其应用。首先，EB染色的灵敏度低于FITC-dextran，可能导致低估组间差异，并增加每组所需的样本量。此外，EB对蛋白质具有更强的黏附性。心内膜和心外膜更容易被EB染色，从而影响荧光密度的检测结果。进一步地，再灌注区域中明显的充盈缺损会显著降低图像质量，这可能限制EB的使用。

为了在心肌梗死（MI）模型中拓展该方法的应用，研究人员在MI模型中对该方法进行了测试。首先，在左前降支（LAD）结扎后将FITC-葡聚糖注入血管。正如预期，由于血流中的FITC-葡聚糖无法通过结扎部位，因此切片发出的荧光信号非常微弱，且无FITC-葡聚糖进入缺血区域。此外，在结扎前5分钟也应用了FITC-葡聚糖，以确保其能够进入所有器官。然而，FITC-葡聚糖仍未能穿透微血管内皮，这可能是因为结扎后的血管中缺乏灌注压，无法推动FITC-葡聚糖穿过内皮层。总体而言，该方法可能需要进行更大幅度的改进，才能适用于MI模型的应用。

尽管具有上述优点，该方法仍存在一些局限性。首先，本方案尚未在其他动物的缺血-再灌注（IR）模型中进行测试，这可能会限制其在临床前和临床研究中的应用。其次，荧光素（FITC）标记的染料比其他常用染料（如伊文思蓝，EB）更昂贵。然而，与EB不同的是，将10%（w/v）FITC-葡聚糖溶液用血清稀释后，极少改变心肌的颜色，因此可在同一心脏组织中同时进行FITC-葡聚糖染色与EB/2,3,5-三苯基四氮唑氯化物（TTC）双染，从而减少实验动物数量和染料使用量，节省经费。最后，本研究所使用的切片扫描仪——定量切片扫描仪及类似仪器——可能在部分实验室中无法获得。综上所述，本方案提供了一种简化、可靠且可视化的检测方法，通过基于自动化定量病理成像系统的荧光检测技术，用于评估大鼠IR模型中心脏微血管内皮通透性。该方案表明，在评估IR损伤后心脏微血管内皮屏障功能时，70,000 Da的FITC-葡聚糖比EB具有更优的性能。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16 G 血管导管	Becton Dickinson, USA	2089312
3-0 聚丙烯缝合线，锥形针	Ethicon, USA	KGP693
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Invitrogen, USA	D3571	DAPI 封片剂的替代品
6-0 聚丙烯缝合线，圆针	Ethicon, USA	KGJ656
粘附性显微镜载玻片	CITOTEST, 中国	188105
ALC-V8S 呼吸机	上海奥尔科特生物科技有限公司，中国	ALC-V8S
恒温加热系统	上海奥尔科特生物科技有限公司，中国	ALC-HTP203
大号有齿解剖镊	RWD 生命科学，中国	F12007-10
直头解剖镊	RWD 生命科学，中国	F12005-10
FITC-葡聚糖，70,000 Da	Sigma-Aldrich, USA	53471
脱毛膏	Nair, USA	N/A
胰岛素注射器，1 ml	Becton Dickinson, USA	8155672
微针持针器	RWD 生命科学，中国	F31047-12
蚊式有齿止血钳	RWD 生命科学，中国	F22007-12
含 DAPI 的封片剂	ZSGB-BIO, 中国	ZLI-9557
多位置光纤照明系统	RWD 生命科学，中国	76301
手术剪	RWD 生命科学，中国	S14014-12
Pannoramic SCAN	3DHISTECH, 布达佩斯，匈牙利	SC150-211305	Vectra Polaris 的替代切片扫描仪
Phenochart 1.0.8	PerkinElmer, USA	N/A	切片查看软件
磷酸盐缓冲液	HyClone, USA	SH30256.01
牵开器，30 mm 展开宽度，5 cm	RWD 生命科学，中国	F22005-45
SP8 共聚焦显微镜	Leica, 德国	TCS-SP8 SR	Vectra Polaris 的替代设备
外科胶带	3M, USA	1527C-0
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	SAKURA, 日本	0822-00
通心络超微粉	以岭药业，中国	Z19980015
紫外冷冻切片机	Leica, 德国	CM1950
Vectra Polaris 1.0.7 软件	PerkinElmer, USA	N/A	切片扫描软件
Vectra Polaris 定量切片扫描仪	PerkinElmer, USA	VP1814N1068