N-基于亲水相互作用液相色谱结合荧光与质谱检测的糖蛋白聚糖谱分析

摘要

N-糖蛋白的聚糖谱分析对于发现新型生物标志物以及理解聚糖在细胞事件中的功能至关重要。此外， N-用于人体的蛋白质生物制药的糖链分析非常重要。本文介绍了一种高通量策略，用于鉴定和定量 N-采用HILIC-FLD-MS/MS技术展示了糖链结构。

摘要

糖基化是一种存在于蛋白质中的重要修饰。 N-糖蛋白的聚糖分析对于检测新型生物标志物候选物以及确定疾病中的聚糖改变至关重要。大多数市售的生物制药蛋白均为糖蛋白，其疗效受糖基化模式的影响。因此，需要一种深入的表征方法以全面分析 N-糖链的分析是必要的。在此，我们提出一种用于定性和定量分析的综合方法 N-使用配备荧光检测器和串联质谱的亲水相互作用液相色谱（HILIC-FLD-MS/MS）分析糖链N-采用简便的方法从糖蛋白中释放糖链，并通过普鲁卡因胺荧光标记物进行标记。随后，对普鲁卡因胺标记的 N-采用HILIC-FLD-MS/MS技术对糖链进行分析. 在此方法中， N-通过串联质谱分析确认聚糖结构，而定量分析则采用荧光检测。检测数据的分析应用 N-研究中描述了糖链峰的分析方法。该方案可应用于从各种物种中提取的任何糖蛋白。

引言

糖基化是一种在蛋白质中常见的关键翻译后修饰¹。多种酶促过程调控细胞生物中的糖基化修饰。通过这些酶促过程，糖链被连接到蛋白质上，经过此类修饰的蛋白质称为糖蛋白¹。蛋白质中通常存在两种类型的糖基化。O-糖基化是指O-糖链与丝氨酸或苏氨酸氨基酸残基侧链的连接；N-糖基化是指N-糖链与蛋白质中天冬酰胺氨基酸残基侧链的连接。

糖链的连接会影响蛋白质的结构、稳定性和折叠过程²。糖基化过程显著影响蛋白质的功能，而糖蛋白在生物体中调控多种细胞功能^3,4。例如，高度糖基化的蛋白质可保护其糖蛋白免受蛋白水解降解⁵。另一个例子是甲状腺蛋白中的糖链，可调控甲状腺球蛋白（Tg）的转运及激素合成^6,7。为了阐明其在细胞事件中的作用，需要对糖蛋白进行深入的表征分析⁸。

N-糖蛋白的聚糖谱在疾病状....

方案

注意：所使用的人血浆为商业可得（材料表）。未使用任何其他来自人类的生物样本。

1. ​糖链释放

1. （糖基化）蛋白质的变性
   1. 制备糖蛋白标准品（如 IgG、单克隆抗体），浓度为 10 µg·µL^-1 在去离子水中₂O. 对于人血浆，所用浓度为 70 µg·µL^-1.
      注意：样品应涡旋振荡至所有固体蛋白质完全溶解。血浆样品制备使用人血浆（冻干粉）。
   2. 取20 µL糖蛋白样品（200 µg）和冻干人血浆（1.4 mg）。
   3. 加入40 µL的2% SDS（十二烷基硫酸钠）（w/v）。
   4. 在60 °C下孵育样品10分钟，以变性（糖基化）蛋白质。
      注意：孵育过程中，样品可在恒温混匀仪中以500 rpm转速混合，也可选择使用摇床水浴箱。
2. 聚糖释放
   1. 向步骤1.1.4的样品中加入20 µL 4% Igepal-CA630。
   2. 加入20 µL的5倍浓度PBS（磷酸盐缓冲液）。
   3. 将PNGase F酶配制为1 U·µL的浓度^-1 在去离子水中。
   4. 为糖蛋白标准品添加1 U酶，为人血浆样品添加2 U酶。<....

结果

在本研究方法中，首先将 N-聚糖释放，并用普鲁卡因胺标签进行标记，再通过含纤维素的固相萃取小柱进行纯化。随后，采用高效液相色谱-亲水相互作用液相色谱-荧光检测-串联质谱（HPLC-HILIC-FLD-MS/MS）系统对IgG、曲妥珠单抗和人血浆中的 N-聚糖进行分析。从IgG和曲妥珠单抗中获得的已鉴定 N-聚糖结构的质谱（基峰）图和荧光色谱图分别如图1所示。这些分析获得的MS/MS数据被导入软件，并与聚糖数据库进行比对。来自MS/MS谱图的聚糖结构示例性MS/MS注释见补充图5。检测到的IgG和曲妥珠单抗的 N-聚糖结构列表分别见补充信息表S1和S2。此外，通过串联质谱分析获得的碎片离子（proc-N1F1 (m/z 587.3⁺)、proc-H1N3 (m/z 1009.5⁺) 和 proc-H1N3F1 (m/z 1155.5⁺)）分析，可检测到核心岩藻糖基化和双分支的 .......

讨论

N-糖蛋白的聚糖谱分析包含若干技术难点。尽管目前存在多种不同的方法，但仍需为聚糖的鉴定与定量选择一种适宜的策略 N-糖链结构¹⁴. HILIC-FLD 是用于定量分析的金标准方法 N-糖类。然而，鉴定所有 N-通过FLD检测无法实现对糖链类型的确认，因此需要进行串联质谱分析以验证 N-来自糖蛋白的聚糖结构。通过在同一系统中结合FLD和MS检测，可对聚糖进行分析 N-糖链的处理效率更高²³由于这些原因，对两者进行鉴定和定量 N-糖链通过HILIC-FLD-MS/MS方法对标准糖蛋白以及人血浆等复杂样品进行分析。

N-糖链从其还原端通过荧光标记进行标记，以便通过荧光检测器（FLD）进行检测和定量²⁵. N-聚糖在质谱分析中的电离效率较低。与常用的荧光标记物如2-AB（2-氨基苯甲酰胺.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	Carlo Erba Reagents	401413	色谱纯 LC/MS 级冰醋酸
乙腈	Merck	1000292500	LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 系列高效液相色谱仪，配备 1260 系列荧光检测器	Agilent Technologies
甲酸铵	Carlo Erba Reagents	419741	LC/MS 级
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) 质谱仪	Bruker Daltonics
纤维素	Sigma Aldrich	310697	微晶型，粉末，20 μm
去离子水	Carlo Erba Reagents	412111	LC/MS 级
二甲基亚砜	Sigma Aldrich	41639	BioUltra 级，分子生物学用，≥99.5%（GC）
空的聚丙烯固相萃取小柱，含聚乙烯筛板	Sigma Aldrich	54220	孔隙率 20 μm，体积 1 mL
20 位固相萃取装置	Waters	WAT200607	配有 13 x 100 mm 试管架
人血浆	Sigma Aldrich	P9523	冻干粉
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	I8896	分子生物学级
IgG	Sigma Aldrich	I4506	冻干粉末
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P4417	片剂
PNGase F 酶	Promega	V483A
盐酸普鲁卡因胺	abcam	ab120955
氰基硼氢化钠	Sigma Aldrich	156159	试剂级，95%
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	71725
曲妥珠单抗	Roche Diagnostics
三氟乙酸	Sigma Aldrich	302031	HPLC 级，≥99.9%