用于小分子化合物快速定量检测的侧向流动免疫层析试纸条的开发

摘要

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本自我诊断的有用工具，已高效应用于毒素、生理指标和临床生物标志物的检测。在本方案中，我们详细描述了开发一种快速、灵敏且定量的侧向流动免疫分析方法的步骤（以金纳米颗粒作为标记物，单克隆抗体作为探针）。该流程包括胶体金的制备与表征、AuNP-单克隆抗体偶联物的合成、免疫层析试纸条的组装，以及检测方法的系统研究。结果表明，最终的试纸条可进一步用于小分子的快速便捷自我诊断，可能为生理和生物学指标的快速精确分析提供一种替代工具。

引言

基于膜的侧向流动免疫层析试纸条（ICSs）是用于低成本和快速检测的有用工具。以硝酸纤维素膜作为载体、胶体金作为标记物的免疫层析快速诊断试剂，是最常用的POCT（即时检测）方法，其检测项目范围广泛。该技术最初应用于妊娠监测，现已扩展至凝血状态^1,2、心肌损伤³、兽医学⁴、农药残留⁵、传染病⁶以及药物浓度的检测。可检测的样本类型也越来越多，包括尿液、唾液、全血、血清及其他体液^7,8,9。

近年来，已开发出多种用于检测疾病诊断中生物标志物的新方法，包括高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（UPLC）、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）和酶联免疫吸附测定法（ELISA），这些方法具有高灵敏度、准确性、可靠性和特异性。然而，这些方法需要复杂的仪器设备、繁琐的预处理步骤以及耗时的检测过程⁹。因此，迫切需要开发一种更快速、便捷的即时诊断策略，用于药物活性成分的自我检测和实时监测^10,11。

免疫层析试纸条（ICS）因其使用简便而广受欢迎，尤其适用于常规检测，无需专业人员或复杂的仪器设备¹²。换句话说，未经特殊培训的人员也可操作试纸条或自测试剂¹³。检测结果可在5分钟内获得，因此可用于现场检测¹⁴。此外，根据我们的计算，试纸条的成本可低于1元人民币¹⁵，意味着其推广成本较低¹⁶。因此，ICS是一种相对准确、操作简单且成本低廉的一次性检测装置。基于胶体金的ICS^17,18也已应用于新冠病毒的快速检测。

免疫层析法（ICS）的原理可分为夹心法ICS和竞争法ICS。图1A为夹心法ICS的示意图，主要用于检测蛋白质等大分子物质，包括肿瘤标志物、炎症因子和人绒毛膜促性腺激素（HCG，早期妊娠抗原）。该方法使用针对抗原不同表位的一对抗体，其中捕获抗体被干燥于硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线，标记抗体被干燥于结合垫上，而二抗则作为质控线。

图1B 是竞争性免疫层析法（ICS）的示意图，主要用于检测小分子物质（分子量截留值 MWCO < 2000 Da）。包被抗原固定在硝酸纤维素（NC）膜上作为检测线，标记抗体则干燥于结合垫上。在检测过程中，样本与标记抗体在毛细作用下流经检测线，包被抗原与样本中的游离抗原竞争结合标记抗体，并在检测线上显现出红色。

最近，我们描述了针对天然产物的单克隆抗体的制备方法¹⁹。在本研究中，我们基于已制备的抗SSD单克隆抗体（mA²⁰）开发了一种新型侧向流动免疫分析法，用于快速、现场检测。结果表明，免疫层析检测法是检测天然产物衍生化合物的一种不可或缺且便捷的工具。

图1 免疫层析分析示意图（A）夹心型免疫层析试纸条。（B）间接竞争型免疫层析试纸条。该图改编自 Zhang et al., 2018²¹。请点击此处查看此图的放大版本。

方案

本研究中进行的所有操作均经北京中医药大学伦理审查委员会批准（批准编号：2017BZYYL00120）。

1. 胶体金的制备与表征

注意：在胶体金合成过程中，由于胶体金容易吸附在容器内壁，并易受杂质影响而发生沉淀，因此用于合成和储存胶体金的容器应彻底清洗并用酸液浸泡（40 mL 蒸馏水、360 mL 浓硫酸、20 g 重铬酸钾）或进行表面钝化处理。本实验采用柠檬酸还原法合成胶体金。

1. 打开磁力搅拌器，将烧瓶（250 mL）放置在搅拌器上。
2. 分别配制4%的氯金酸溶液和1%的柠檬酸钠溶液。
3. 向圆底烧瓶中加入120 mL蒸馏水，并在恒温磁力搅拌器上加热至沸腾。
4. 保持沸腾状态，迅速加入0.5 mL的4%氯金酸溶液和5 mL的1%柠檬酸钠溶液。
5. 观察溶液颜色变化。淡黄色的氯金酸溶液在数分钟内变为酒红色。
6. 继续加热10分钟，直至溶液由无色变为透明的酒红色。
7. 关闭恒温磁力搅拌器电源，冷却至室温，将混合液转移至洁净的容器中，于4 °C保存。
8. 采用紫外光谱法和透射电镜（TEM）成像测定金纳米颗粒（AuNPs）的尺寸和形貌。
   ​注意：通过调整柠檬酸钠与氯金酸的比例，可获得适用于不同应用的多种尺寸的胶体金颗粒。

2. AuNPs-mAb 偶联物的合成

注意：由于抗体通过静电吸附与胶体金结合，蛋白质和胶体金表面的电荷直接影响结合强度；因此，缓冲液的pH值是影响抗体-胶体金结合物稳定性的关键因素。本方案以SSD和抗SSD单克隆抗体为例进行说明。

1. 偶联 pH 值的评估
   1. 向八支试管中各加入 100 μL NaCl 溶液（10% m/v）。
   2. 用 0.1 M K₂CO₃ 将金纳米颗粒（AuNP）溶液的 pH 值分别调节至 5、6、7、8、9、10、11 和 12。
   3. 向含有 NaCl 的八支试管中各加入 100 μL 胶体金溶液（pH 已调节至 5–12）。
   4. 混合后静置数分钟，观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。
   5. 选择 K₂CO₃ 添加量最少且溶液颜色稳定的 pH 值，作为制备 AuNP-单克隆抗体（mAb）偶联物的最佳 pH 值。
      ​注意：请勿使用 pH 计，因为探针可能被 AuNPs 损坏。
2. 抗体用量的评估
   1. 向八支试管中各加入 100 μL NaCl 溶液（10% m/v）。
   2. 向每支试管中加入 100 μL 最佳 pH 值的胶体金溶液。
   3. 向上述八支试管中分别加入单克隆抗体溶液（蛋白浓度为 0.1 mg/mL–3.2 mg/mL）。
   4. 混合后静置数分钟，观察每支试管中溶液的颜色变化，并记录仍保持红色的试管。
   5. 选择单克隆抗体浓度最低且溶液颜色稳定的抗体用量，作为制备 AuNP-mAb 偶联物的最佳抗体用量。
3. 制备重悬缓冲液：加入 1 M Tris-HCl（pH 8.8）、1%（w/v）BSA、0.5%（v/v）Tween 20 和 1%（v/v）PEG 20000，充分混匀。
4. AuNP-mAb 偶联物的合成
   1. 取 10 mL 胶体金溶液，用 0.1 M K₂CO₃ 将溶液调节至最佳 pH 值。
   2. 缓慢加入适当浓度的 SSD 单克隆抗体（mAbs），在室温下振荡反应 30 分钟。
   3. 在 4 °C 条件下，以 83 × g（1,000 rpm）离心 10 分钟，弃去沉淀（其中含有杂质或已沉淀的胶体金）。
   4. 在 4 °C 条件下，以 8,330 × g（10,000 rpm）离心 30 分钟，弃去上清液，沉淀即为胶体金-mAb 偶联物。
   5. 加入重悬缓冲液以重新分散沉淀。

3. 条带的组装

注意：对于后续的流动免疫测定，膜材料的选择和预处理将直接影响检测结果，需进行考察。免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜、吸收垫和聚氯乙烯（PVC）板组成（图1）。应使用体视显微镜对膜材料进行检查和评估，以排除不均匀性。

1. 将NC膜粘贴在PVC板上，距离板的吸水端边缘2 cm处。
2. 将SSD-BSA（2 mg/mL）溶液以滴加方式加至NC膜上（距上边缘2 cm处），作为检测线（宽度1 mm）；再将羊抗小鼠IgG（1.5 mg/mL）溶液以滴加方式加至NC膜上（距下边缘2 cm处），作为质控线（宽度1 mm）。注意控制蛋白添加量。
3. 将吸水垫贴于PVC板上NC膜的上方，并与NC膜重叠2 mm。
4. 将玻璃纤维膜浸入AuNPs-mAb偶联物溶液中，随后置于37 °C恒温培养箱中干燥。
5. 将玻璃纤维膜裁剪为长5 cm、宽2 cm，作为偶联物垫。
6. 将预处理后的偶联物垫粘贴在NC膜下方，与NC膜重叠长度为0.1 cm。
   NOTE: 玻璃纤维膜具有较强的蛋白质结合与释放能力。
7. 将融合3膜裁剪为长1.8 cm、宽3.5 cm，作为样品垫。
8. 将样品垫粘贴在PVC板上，并与偶联物垫重叠2 mm。
9. 使用切条机将组装好的纸板切割成宽度为3.5 mm的试纸条，并通过批量覆膜系统进行压合。
10. 最后，将试纸条装入外壳中，密封于含干燥剂的铝箔袋内，避光保存。此时免疫层析试纸条（ICSs）已组装完成。
    ​NOTE: 上述为实验室操作流程；在生产过程中，使用喷金设备和划膜仪进行喷金及T线、C线的包被。

4. 定量检测

1. 将50 µL样品溶液滴加到样品孔中，观察层析过程。
   注意：由于吸水垫产生的毛细作用，样品溶液会向试纸条的另一端迁移。当样品溶液到达结合垫时，样品中的SSD（抗原）会与预载在垫上的AuNPs-mAb发生反应。当溶液继续迁移并到达检测线（T线）时，未结合SSD的AuNPs-mAb可被SSD-BSA（抗原-载体蛋白偶联物）特异性捕获，从而在T线上呈现红色。随后，溶液迁移至质控线（C线），此处AuNPs-mAb会被区域内的羊抗小鼠IgG捕获，从而在C线上呈现红色。
2. 使用便携式试纸条读取仪分析试纸条。仪器可提供检测线与质控线的信号比值（T/C）。
3. 评估ICS检测的特异性、灵敏度、重复性和稳定性。
   注意：在定性检测中，仅出现一条红色质控线表示结果为阳性（质控线）；出现两条红色线（检测线和质控线）表示结果为阴性。若质控线未出现，则该检测结果视为无效。

结果

胶体金的表征
制备的胶体金溶液呈深红色。采用透射电子显微镜（TEM）分析来确定金纳米颗粒（AuNPs）的形貌和形状。图2A- D). 图2A 和 图2B 显示颗粒呈多面体形貌且分布均匀。AuNPs的平均直径约为14 nm（图 2C）。AuNPs 的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像如图所示 图 2D 和 图2E单个金纳米颗粒（AuNP）的高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像显示连续的条纹图案，晶格间距为0.117 nm。五种金溶胶溶液的紫外-可见吸收峰分别为518 nm、521 nm、524 nm、534 nm和540 nm，表明随着柠檬酸钠浓度的降低，颗粒尺寸略有...

讨论

在本研究中，我们介绍了一种针对天然产物衍生小分子的单克隆抗体（mAb）制备方案。文中概述了该方法的关键步骤及注意事项，并以小分子SSD为例展示了该方案的应用价值。代表性数据展示了示例谱图、透射电子显微镜（TEM）图像、定量结果以及方法学验证。因此，我们证明了本文所采用的胶体金制备、AuNP-单克隆抗体偶联及试纸条组装策略，可成功构建一种新型免疫分析方法，用于快速检测目标分子。

免疫层析试纸条操作简便，反应迅速。仅需50 μL样本，5分钟内即可完成检测。相比之下，同为免疫分析方法的ELISA则需要数小时，包括多次洗涤和长时间孵育。多次洗涤和较长的孵育时间可有效去除样本基质的非特异性反应，通过提高信号值来改善信噪比和灵敏度。这意味着层析纸条的抗干扰能力及其优化技术是本研究需要解决的关键问题。技术优化可通过多种途径实现：选择合适的样本垫和结合物垫材料；适当增加样本垫的长度，以有效提升样本的预处理能力；采用高pH、高离子强度和高缓冲容量的材料预处理条件，避免生物样本pH值对抗原-抗体反应等干扰因素的影响。由于"三高"条件可能干扰抗体的结合，应综合考虑这一因素。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯金酸溶液 (HAuCl4)	天津福晨化学试剂厂	JY-SJ102
牛血清白蛋白	AMRESCO	332
15 mL 离心管	Corning	430645
50 mL 离心管	Corning	430828
96 孔 ELISA 板	NUNC	655101
滤纸	国药集团	H5072
玻璃纤维膜	洁益	XQ-Y6
羊抗小鼠 IgG 抗体	applygen	C1308
硝酸纤维素膜	Millipore	millipore 180
卵白蛋白	北京博德瑞	5008-25g
PEG20000	Sigma Aldrich	RNBC6325
10 mL 移液管	COSTAR	4488
25 mL 移液管	FALCON	357525
半硬质 PVC 片材	洁益	JY-C104
柠檬酸钠	北京化工厂	C1034
高碘酸钠	国药集团化学试剂	BW-G0008
Sulfo-GMBS	Perbio Science Germany	22324
TipOne 吸头 1,000 µL	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5