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方法文章

从生物膜中的Pseudomonas aeruginosa分离总RNA以检测基因表达

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DOI：

10.3791/62755

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2021年9月24日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

本文内容

摘要

本方案介绍了一种从 铜绿假单胞菌 用于高通量测序的腔室载片上培养的生物膜。

摘要

Pseudomonas aeruginosa 是一种机会性细菌病原体，可导致囊性纤维化（CF）患者呼吸道感染。P. aeruginosa 以其形成生物膜的能力而闻名，这些生物膜由胞外多糖基质保护。该基质使微生物对外界因素（包括抗生素治疗）具有更强的耐受性。目前用于研究生物膜生长的最常见方法是在微量滴定板或带腔载玻片中进行培养。这些系统的优点在于可同时测试多种生长条件，但其缺点是产生的生物膜量较少，难以用于RNA提取。本文旨在提供一份详细、逐步的操作方案，介绍如何从小量生物膜中提取出足够质量和数量的总RNA，以满足高通量测序的要求。该方案可用于研究这些生物膜系统中的基因表达情况。

引言

大多数慢性细菌感染，例如囊性纤维化（CF）患者中的肺部感染以及与假体相关的感染，其特征均为细菌在生物膜内生长。生物膜1是指被主要由多糖组成的基质包裹的细菌群落2。生物膜内的细菌可能生长缓慢、代谢不活跃，并处于厌氧或缺氧环境中。由于抗生素渗透性降低、药物外排泵表达增加以及细胞分裂减少等因素，生物膜对抗生素具有更强的耐药性3。由于上述及其他原因，生物膜具有重要的研究价值。

为了准确研究囊性纤维化（CF）患者中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等持续性感染，体外实验必须真实反映生物膜形成过程中的生长条件。in vitro。一种常见且高通量的方法是在腔室载玻片或微孔板中培养细菌，并通过共聚焦显微镜监测生物膜的形成4。已知，细菌从浮游状态（自由漂浮）向生物膜生活方式转变的关键调控因子是第二信使环二鸟苷酸（cyclic-di-GMP）5。环二鸟苷酸水平的升高可增强特定基因的表达，从而促进生物膜的生长。小非编码调控RNA和群体感应也在生物膜形成的调控中发挥重要作用5。通过测序提取的细菌RNA来检测生物膜基因表达具有挑战性。例如，P. aeruginosa 会产生三种胞外多糖（Psl、Pel和藻酸盐），这些多糖在生物膜中大量产生6,7。这些多糖可能干扰RNA的提取与纯化，导致制备的样品不纯且细菌mRNA含量较低8。市面上的RNA提取试剂盒能够从浮游细菌培养物中获得高质量RNA，但在处理生物膜培养物时效果可能不佳9,10,11。目前有少数商业RNA提取试剂盒声称适用于生物膜样本，本方法中我们使用了其中一种。

在本文中，我们描述了在培养皿载片中培养P. aeruginosa生物膜并提取细菌mRNA以进行高通量测序的实验步骤12,13。利用从囊性纤维化（CF）患者痰液样本中分离的临床菌株，我们证明了这些方法适用于具有不同生长特性的菌株。与以往发表的研究相比，本实验方案提供了更为详细的描述，有助于更成功地研究细菌生物膜的基因表达11,14,15,16。

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方案

采集和处理人类受试者的痰液样本需经研究伦理委员会（REB）批准。本研究已获得病童医院的批准（REB#1000019444）。采集和储存人类受试者的痰液样本必须获得研究伦理委员会（REB）的批准。这些研究已获得病童医院REB#1000058579的批准。

1. 生物膜形成

  1. 培养 铜绿假单胞菌 从囊性纤维化（CF）患者痰液样本中分离的菌株，在Luria Broth（LB）琼脂平板上于37 °C培养获得 °C 培养箱中过夜培养。
    注意：正确的划线分离技术对于获得单个细菌菌落至关重要。在旋转培养皿的同时进行划线，可充分稀释细菌细胞，从而使其形成单个菌落。
    1. 使用接种环在新鲜LB平板的顶端以锯齿形模式划线接种细菌，直至大约 ¼ 平板的表面被覆盖。
    2. 将培养板旋转约60°取一个新的接种环，将其穿过划线区域并进入平板的第二个洁净区域，重复进行之字形划线。
    3. 用新的接种环在平板的第三个区域重复步骤 1.1.2。盖上盖子，并在放入培养箱时将平板倒置。
  2. 使用无菌接种环从琼脂平板（含单一细菌菌株）上挑取单个细菌菌落，接种至装有5 mL无菌LB培养基的培养管中。每次使用新的接种环，从同一平板上再接种另外两管各含5 mL LB培养基的培养管。
  3. 对不同的细菌菌株重复相同的接种程序。在37℃下过夜培养培养物。 °C，220 rpm 振荡培养。
    注意：每块含有单一细菌菌株的琼脂平板用于接种3个独立的培养管。这三个培养管代表一个菌株的3个生物学重复，作为独立样本处理。这不同于技术重复，后者指从单个培养管中重复3次提取RNA。
  4. 将过夜培养物按1:100比例稀释，通过转移50 µ将过夜培养物的 L 转移至含有 4.95 mL 新鲜 LB 培养基的新培养管中。
  5. 在37℃下将稀释后的培养物继续培养3小时 °C，220 rpm 振荡培养，或培养至 OD600 为0.1或更高。使用分光光度计在OD600.
  6. 在新的 1.7 mL 微离心管中，调节 OD600 至1.5 mL新鲜LB培养基中，使菌液浓度达到0.1（对数生长期早期）。
  7. 轻轻颠倒混匀。转移 300 µ将每种调整后的培养物各取 L 加入8孔板的4个孔中，使每张载片上含有2种不同的样本（图1).
  8. 将载玻片静置不动地放入37 °在37°C培养箱中孵育过夜，共24小时。为防止蒸发，将载玻片置于小型塑料托盘内湿润的纸巾上方。

2. 生物膜回收

注：每块载玻片包含八个独立的孔。一个样本由四个带有生物膜的孔组成，这些孔将被合并17。本提取方案适用于一个样本（4个孔），其中生物膜每次从两个孔中回收。RNA提取采用 commercially 提供的RNA提取试剂盒，该试剂盒包含珠磨破碎步骤和基于离心柱的纯化步骤，并进行了部分修改。请按照制造商的说明准备试剂。

  1. 在超净工作台中，使用移液器吸头缓慢移除4个孔中2个孔的培养基。将玻片倾斜45度° 从孔板底部角落以一定角度吸出培养基，以防止生物膜脱落。
  2. 保持载玻片倾斜，轻轻吹打300 μL磷酸盐缓冲液，将浮游细胞冲洗干净 µ将 RNase-free 水加入两个已清空的孔的底部角落。按照步骤 2.1 所述，轻轻吸出水。重复洗涤步骤，尽可能去除残留的水。
  3. 加入300 µL的RNA保护试剂（参见 材料表) 加入两个已去除内容物且底部带有生物膜的孔中。将腔室载玻片置于玻璃板上以防止孔破裂，然后用小型无核酸酶、无菌金属刮刀刮取这两个孔中的生物膜，使生物膜细菌重新悬浮。静置，直至从同一样本的另外两个未处理孔中回收生物膜。
    注意：添加RNA保护试剂可确保在处理同一样本剩余两个孔的同时，刮取孔中的生物膜样本在室温下保持稳定。该RNA保护试剂能够裂解细胞并灭活核酸酶及感染性因子，从而实现RNA的保存。
  4. 为获取样本剩余2个孔中的生物膜（提示：一个样本包含4个孔），以与步骤2.1相同的方式移除这2个新孔中的LB培养基。重复步骤2.2，用无RNase水冲洗这两个新孔，以去除浮游细胞。
  5. 返回到第2.3步结束时在保护试剂中刮取了生物膜的前两个孔，缓慢移液以混匀300 µ重悬生物膜的L 一 刮取孔内，尽量避免产生过多气泡。
    1. 将孔中的所有内容转移至 一 新洗涤并清空的孔中。混合后转移300 µ将第二次刮取的生物膜重悬液加入到另一个新洗涤并已排空的孔中。
      注意：不要向两个新洗涤过的含生物膜孔中添加新的RNA保护试剂，而是将之前已刮取并置于保护试剂中的生物膜转移至这两个 freshly washed wells 中。这样可使合并后的样品总体积足够小，以满足商用RNA提取试剂盒的上样量要求。参见 图1 示意图见图示。
  6. 按照步骤2.3的方法，将腔室载玻片置于玻璃板上，用小型无核酸酶、无菌金属刮刀刮取2个新孔中的生物膜，使生物膜细菌重新悬浮。
  7. 混合 全部 将2个新孔中重悬的生物膜合并至一个无RNase、低吸附的1.5 mL微量离心管中。测量体积，应为约500–600 μL µL total
    注意：此第二组新孔中合并的生物膜悬液将包含来自某一样本原始4孔的全部生物膜材料。

3. 总RNA提取与质量评估

注意：RNA 提取使用一种声称可作用于生物膜的商用 RNA 提取试剂盒进行。各组分尽可能列入材料表中。在可能的情况下，提供了每个纯化步骤背后机理的解释。

  1. 向离心管中加入足够的RNA保护试剂，使总体积达到750 µL。将全部体积转移至含有0.1 mm和0.5 mm珠子的2 mL珠磨裂解管中（参见材料表）。在珠磨仪中以最高速度研磨2½分钟。
    注意：0.1 mm和0.5 mm高密度珠子结合珠磨仪的高速混合可确保微生物细胞壁被充分均质化。
  2. 在16,000 x g条件下离心1分钟，使珠子沉淀。将上清液转移至新的微量离心管中，尽量避免转移任何珠子，以便于后续步骤3.3的操作。测量上清液体积。
  3. 加入等体积的RNA裂解缓冲液（约450 µL），充分混匀。取最多800 µL样品（避免转移珠子），转移至收集管中的硅胶柱中，在16,000 x g条件下离心30秒。保留穿流液，因为其中含有RNA，而DNA则结合在柱子上。
    注意：RNA裂解缓冲液含有硫氰酸胍和去污剂N-月桂酰肌氨酸钠，用于裂解细胞。硫氰酸胍是一种变性剂，可同时灭活核酸酶，并在硅胶（存在于离心柱中）存在下促进DNA与硅胶的结合18。由于不含乙醇，DNA可优先结合至硅胶离心柱，而RNA则不结合19。步骤3.3的目的是结合并去除基因组DNA。我们希望保留存在于穿流液中的RNA。
  4. 若仍有剩余样品，将柱子转移至新的收集管中，将剩余样品重新上样。在16,000 x g条件下离心30秒。保留含RNA的穿流液，并与第一次的穿流液合并。
  5. 测量合并后的穿流液体积，加入等体积的100%乙醇，充分混匀。取最多800 µL溶液转移至收集管中的新硅胶离心柱（第二个柱子），在16,000 x g条件下离心30秒。弃去穿流液。
    注意：向含有RNA的变性盐溶液中加入乙醇可增强RNA与硅胶离心柱的结合19。
  6. 对于体积> 800 µL的溶液，重复上样并离心，直至全部溶液通过柱子。每次离心后均弃去穿流液。
  7. 向柱子中加入400 µL洗涤缓冲液，在16,000 x g条件下离心30秒，以去除部分盐分。弃去穿流液。
  8. 根据制造商说明书配制DNase I反应混合液，并在柱上进行DNase处理，以去除任何残留的DNA。
  9. 用275 µL无RNase水重悬冻干的DNase I，配制成1 U/µL的溶液。通过轻柔颠倒混匀。
  10. 取5 µL稀释后的DNase I与75 µL提供的DNase消化缓冲液混合。轻柔颠倒混匀。
  11. 将80 µL配制好的溶液直接加至柱基质上。室温孵育20分钟。
  12. 向柱子中加入400 µL RNA预处理缓冲液，在16,000 x g条件下离心30秒。弃去穿流液。
  13. 向柱子中加入700 µL RNA洗涤缓冲液，重复离心。弃去穿流液。
  14. 向柱子中加入400 µL RNA洗涤缓冲液，并离心2分钟，以彻底去除任何残留缓冲液。
    注意：有两个不同的洗涤步骤用于去除柱子上的杂质。预处理缓冲液含有弱变性盐与乙醇的混合物，用于去除残留蛋白质。随后使用洗涤缓冲液进行乙醇洗涤以去除盐分。必须完全去除残留乙醇，以确保RNA能够高效洗脱19,20。
  15. 小心将柱子转移至新的低吸附微量离心管中。
  16. 向柱基质中直接加入50 µL无RNase水，孵育5分钟。在16,000 x g条件下离心1分钟，以洗脱RNA。
  17. 如需进一步纯化以去除PCR抑制物，将PCR抑制物过滤柱放入新的收集管中。加入600 µL提供的抑制物预处理溶液（参见材料表）。
  18. 在8,000 x g条件下离心3分钟以洗涤过滤柱。将洗涤后的过滤柱转移至新的低吸附微量离心管中。
  19. 将步骤3.13中洗脱的RNA转移至洗涤后的过滤柱中，在16,000 x g条件下离心3分钟。
    注意：RNA可立即使用，或于-80 °C保存。
  20. 使用高灵敏度荧光定量系统测定RNA浓度21。
    注意：此类系统可对溶液中微量RNA进行高灵敏度定量，且特异性针对目标RNA。
    1. 使用自动化电泳系统评估RNA质量，该系统可提供RIN值（RNA完整性数值），作为RNA质量的衡量指标22,23。

4. 核糖体RNA去除与高通量测序

  1. 将RNA样品提交至多伦多大学基因组进化与功能分析中心（CAGEF）（加拿大安大略省多伦多市）（https://www.cagef.utoronto.ca/），进行细菌rRNA去除及RNA链特异性文库构建（参见 材料表）。
    注意：细菌rRNA去除旨在清除5S、16S和23S rRNA24。
  2. 使用商业化的细菌rRNA去除试剂盒去除rRNA。按照试剂盒说明，输入10 ng至1 µg完整或部分降解的总RNA。
  3. 使用带有不同索引标签的RNA链特异性文库构建试剂盒，构建RNA测序文库。
  4. 将各个RNA文库按等摩尔量混合，并进行高通量测序，读长为100 bp的双端测序25。

5. 测序读长的质量评估

注意：通过免费的开源平台 Galaxy27 获取并使用其中提供的免费程序 FastQC26 来检查测序读段的质量。

  1. 前往 https://usegalaxy.org/。点击 登录或注册菜单，使用凭据登录或创建账户。
  2. 在页面左上方“工具”菜单下的上传数据链接中，上传 fastq.gz 测序文件。等待文件名出现在页面右侧“历史记录”面板下方。
  3. 在“工具”菜单中选择“FASTQ 质量控制”，以显示程序列表。选择 FastQC，该程序将填充屏幕的中间面板。
  4. 在来自您当前历史记录的短读长数据下，从下拉菜单中选择已上传的 fastq.gz 文件。
  5. 选择执行以运行程序。
  6. 在“历史记录”面板下查看结果（表 2）。
    注意：有关如何使用 Galaxy 的更详细说明，请访问支持页面 https://galaxyproject.org/support/。

6. 测序读段的比对

注意：以下列出的是 RNA-seq 数据进行接头修剪和读段比对的基本流程。使用 Trimmomatic28 对读段中的接头序列进行修剪。将修剪后的读段比对至从 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取的P. aeruginosa PAO1 参考基因组（NC_002516.2）29，比对工具为 BWA30 和 Samtools31。为简便起见，设一对读段文件名为 PA_1.fq 和 PA_2.fq；待修剪的接头序列文件名为 adapter.fa；PAO1 参考序列文件名为 PAO1.fasta。所有工具均为开源软件，需在 UNIX/LINUX 环境下运行。强烈建议您熟悉 UNIX/LINUX 的基本操作，以便执行这些命令。

  1. 在 UNIX/LINUX 中打开一个窗口。
  2. 安装 Java、Trimmomatic、BWA 和 Samtools。
  3. 进入 trimmomatic-0.39.jar 文件所在的文件夹。
  4. 通过输入以下命令，从测序读段中切除任何接头序列：
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    注意：仅去除接头序列，未对读段进行质量修剪32.
  5. 将 PAO1.fasta 参考文件移至同一文件夹中。
  6. 使用 BWA 命令对参考序列进行索引：
    Bwa index PA01.fasta
  7. 输入以下 4 条命令，将成对的测序读段比对到参考基因组。每条命令需在前一条命令完成后输入。
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    Samtools index PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. 输入以下命令以查看比对统计信息：
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    注意：3rd 统计报告中的这一行报告了比对到参考基因组的读段所占的比例。
  9. 使用以下 2 个命令计算平均测序深度和覆盖广度33分别：
    samtools depth -a PA_R1R2_sorted.bam | awk '{c++;s+=$3}END{print s/c}'
    samtools depth -a PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

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结果

该方法的总体概述见图1。我们此前曾使用8孔腔载玻片培养P. aeruginosa生物膜，并在不同时间点通过共聚焦显微镜观察其经抗生素处理后的变化12,13。本方法可用于直接从该系统中培养的生物膜提取总RNA，以研究处理后的基因表达变化。本方案已针对P. aeruginosa进行优化，但也可轻松适用于其他细菌种类。

从少量生物膜中提取足量且高质量的RNA用于rRNA去除和高通量测序具有挑战性。通过本方案，成功从17株不同的P. aeruginosa生物膜分离株中各取三份平行样本提取了总RNA，共计51个独立样本。提取RNA的产量高低情况如表1所示。RNA浓度范围为3.4 ng/µL（最低）至49.6 ng/µL（最高），平均浓度为14 ng/µL，中位数为13.7 ng/µL。当完整RNA浓度低于10 ng/µL时，被视为...

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讨论

已成功从17种不同的细菌生物膜样本中（每种三份）提取总RNA，共获得51个样本。将其中49个RNA文库混合后成功进行了测序。总体而言，尽管超过一半的样本被认为是丰度较低且质量次优，但该结果仍以96%的成功率验证了我们的质量标准34,35,36,37。

意义
本RNA提取方案的独特之处在于，详细阐述了如何从在腔室载玻片中生长的少量生物膜中提取RNA。在8孔腔室载玻片中培养生物膜是一种有效的系统，可用于通过共聚焦显微镜研究外源添加因子对生物膜的影响，或微生物相互作用对生物膜形成的影响12,13,42。为...

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披露

作者无任何披露事项。

致谢

作者贡献：P.W.、Y.Y. 和 V.W. 参与了研究的构思。K.G.、L.J.、A.M. 和 P.W. 优化了实验室方案。K.G. 的经费由加拿大生物人才组织（BioTalent Canada）提供的学生工作实习项目补贴资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA生物分子自动电泳仪
Agilent RNA 6000 pico试剂盒Agilent5067-1513高灵敏度RNA电泳芯片，用于生成RIN值
DNA/RNA裂解缓冲液Zymo ResearchD7001-1-50以硫氰酸胍和N-月桂酰肌氨酸为基础的裂解缓冲液，作为核酸纯化试剂盒的组成部分出售
DNA/RNA预处理缓冲液Zymo ResearchD7010-2-10用于DNA和RNA纯化的盐酸胍和乙醇缓冲液
DNA/RNA保护剂Zymo ResearchR1100-50DNA和RNA保存/保护试剂
DNA/RNA洗涤缓冲液Zymo ResearchD7010-3-6用于DNA和RNA纯化的盐和乙醇缓冲液
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RS高通量测序仪
MGIEasy RNA定向文库制备试剂盒MGI1000006386从总RNA制备适用于MGI高通量测序平台的文库
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001高能量、高通量细胞破碎仪
NEBNext rRNA去除试剂盒（细菌）New England BiolabsE7850X高效且特异性地去除细菌rRNA（5S、16S、23S）
Nunc Lab-Tek II腔室载玻片系统Thermo Fisher Scientific1545348孔腔室载玻片，带可拆卸小室
Qubit荧光计Thermo Fisher ScientificQ33238用于DNA、RNA和蛋白质的荧光定量仪
Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒Thermo Fisher ScientificQ32852高灵敏度荧光法定量RNA浓度
Spin-Away过滤柱Zymo ResearchC1006-50-F基于二氧化硅的离心柱，主要用于结合或去除基因组DNA
无菌接种环，1 µLSarstedt86.1567.050无菌、一次性接种环，用于微生物操作
ZR BashingBead裂解管Zymo ResearchS6003-502 mL管，内含0.1 mm和0.5 mm珠粒裂解基质，用于均质化生物样本
Zymo Spin IIICG纯化柱Zymo ResearchC1006-50-G基于二氧化硅的离心柱，用于DNA和RNA纯化
Zymo-Spin III-HRC过滤柱Zymo ResearchC1058-50去除多酚类化合物、腐殖酸/富里酸、单宁、黑色素等抑制物
Zymobiomics DNA/RNA小量提取试剂盒Zymo ResearchR2002DNA和RNA联合提取试剂盒
Zymobiomics HRC预处理溶液Zymo ResearchD4300-7-30与Zymo-Spin III-HRC过滤柱配合使用，以去除PCR抑制物

参考文献

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