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方法文章

一种可扩展的方法：在原代神经元培养中以单细胞和实时分辨率研究神经元存活

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⸱

DOI：

10.3791/62759

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2021年7月26日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单、高效且用途广泛的方法，可用于在细胞水平上实时或在固定样本中研究原代皮层神经元在细胞毒性应激条件下的存活情况。

摘要

神经元丢失是许多神经病理学疾病的核心环节，包括脑卒中、阿尔茨海默病和帕金森病。为研究细胞毒性应激条件下神经元存活的过程，已开发出多种方法。大多数方法基于生物化学手段，无法实现单细胞分辨率，或涉及复杂且昂贵的技术流程。本文介绍一种用途广泛、成本低廉且高效的实验范式，用于研究神经元存活。该方法利用稀疏荧光标记神经元，结合活细胞成像和自动化定量分析。为实现该目标，通过电穿孔使神经元表达荧光标记物，并与未电穿孔的神经元共培养，从而便于调控细胞密度并提高存活率。

通过电穿孔实现稀疏标记，可进行简单且稳健的自动化定量分析。此外，荧光标记可与目的基因的共表达相结合，用于研究特定的分子通路。本文介绍了一种作为神经毒性模型的脑卒中模型，即氧糖剥夺（OGD）检测，该实验在一种经济、可靠的自制缺氧舱中完成。最后，描述了两种不同的图像分析工作流程，分别使用 IN Cell Analyzer 2200 或开源软件 ImageJ 进行半自动化的数据处理。该工作流程可轻松适配于不同的毒性实验模型，并可扩展用于高通量筛选。综上所述，本方案提供了一种易于操作、成本低廉且高效的 体外 神经毒性模型，适用于在活体成像中检测特定基因和信号通路的作用，以及用于高通量药物筛选。

引言

研究神经元紊乱需要适用于遗传学、分子和细胞分析的实验模型。原代皮层神经元是研究神经元存活与毒性的强有力模型1,2,3,4。在适当条件下，原代神经元会逐步形成突触连接，并表现出成熟神经元的典型特征。因此，该模型在模拟神经元生理功能方面比永生化细胞系更可靠，且相较于动物模型更易于操作。然而，与细胞系相比，原代皮层神经元转染困难，且相对脆弱。此外，皮层神经元复杂的形态可能使高密度培养中的成像与分析变得复杂。相反，低密度原代神经元培养物更易于分析，但通常更为脆弱。

综合考虑以上因素，本文介绍了一种经济实惠、用途广泛且可扩展的 体外 用于模拟与研究神经元存活的工作流程（图1）。本方案的关键要点包括 i）该方法的 体外 使用荧光标记物对神经元进行电穿孔，以实现稀疏标记和活细胞成像；ii）在不同细胞毒性模型中的适用性；iii）半自动化或自动化分析。

电穿孔系统（参见材料表）提供了一种开放且低成本的操作方法，无需使用试剂盒和特定溶液4,5,6。此外，该方法可轻松调整，以获得最佳的转染效率和转染神经元的密度，并可通过将电穿孔细胞与非电穿孔细胞混合实现。与未处理（非电穿孔）神经元共培养，相较于低密度培养，能显著提高电穿孔细胞的存活率。同时，该方法可实现稀疏标记，并可调节电穿孔神经元的密度，保持基因表达水平的一致性。在存活率检测中，应将电穿孔神经元的比例控制在3-5%为宜。

稀疏标记本质上有利于图像分析的自动化，因为细胞彼此分离，易于区分。值得注意的是，该实验范式可通过在同一孔中同时共培养共电穿孔了不同胞质荧光标记物（例如青色荧光蛋白、红色荧光蛋白（RFP）、绿色荧光蛋白（GFP））的神经元，从而适应于多个目的基因的检测。与其它细胞毒性检测方法（例如碘化丙啶或乳酸脱氢酶检测）类似，本文所述的检测方法基于神经元死亡伴随细胞膜破裂这一事实。这会导致胞质蛋白通过扩散释放，从而引起GFP荧光的丧失。

一个 体外 以氧糖剥夺（OGD）模型为例的卒中模型被用作神经毒性的示例7,8,9该方案涉及将原代神经元暴露于一种类似于人工脑脊液但缺乏氧气和葡萄糖的盐缓冲液中。尽管此模型已被用作神经毒性应激的示例，但也可利用相同的实验流程测试其他细胞毒性条件。8,9最后，稀疏标记可轻松实现自动成像分析的开发。本文首先基于标准免疫荧光染色和ImageJ分析，在较小规模体系中建立了一套实验方案。随后，该工作流程被改进并扩大规模，采用细胞成像系统，可在中通量和高通量模式下对活细胞成像进行自动化分析。综上所述，本文介绍了一种灵活、经济且可扩展的方法，可用于在不同毒性实验模型中通过活细胞成像和自动化定量研究神经元存活。

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方案

所有涉及动物的实验操作均应由机构的生物伦理动物委员会监督，并遵守当地法规执行。本文所述操作程序已获得授权机构批准，符合西班牙及欧洲的法规要求。

1. 原代神经元培养

注意：所有步骤均在超净工作台内进行，使用无菌材料和溶液以维持无菌条件。

  1. 多聚-L-赖氨酸（PLL）包被
    1. 将盖玻片（CVs，15 mm）在70%乙醇中于旋转摇床中过夜（o/n）清洗。
      注意：旋转摇床的速度应足以轻柔移动盖玻片，但不可过快，以避免损伤或刮伤盖玻片。具体转速因摇床型号而异。盖玻片可在乙醇中长期保存（数月）。
    2. 移除乙醇，用去离子水清洗两次，每次10分钟。
    3. 将盖玻片置于100 mm培养皿中（每皿约13片），在室温（RT）下自然晾干。确保盖玻片彼此之间及与培养皿边缘不接触。
      注意：干燥后的盖玻片可在室温下长期保存（数月）。
    4. 用水配制5 mg/mL PLL储存液，分装后于-20 °C保存。使用时用1×PBS稀释至工作浓度0.1 mg/mL。
      注意：可尝试最高至1 mg/mL的PLL浓度。
    5. 加入足以覆盖盖玻片表面的最小体积PLL溶液（PLL最佳体积见表1）。以滴加方式加入PLL溶液，有助于液滴形成。
      注意：进行免疫荧光染色时需将神经元接种于盖玻片上。对于延时成像（例如IN Cell分析系统），细胞应直接接种于孔板底部而无需使用盖玻片，因为延时过程中盖玻片可能发生移动。在此情况下，应加入足以覆盖每个孔表面的最小体积PLL溶液。
表面PLL 体积 (mL)
15 mm 盖玻片0.2
13 mm 盖玻片0.18
96 孔板0.07
24 孔板0.3
6 孔板2
60 mm 培养皿4.5

表1：根据表面积确定的聚-L-赖氨酸最佳使用体积。

  1. 在 37 °C 下孵育至少 1 小时。
    注意：孵育时间可长达过夜（o/n）。
  2. 从 CVs 上去除 PLL。用去离子水清洗 CVs 两次，每次 10 分钟。让 CVs 在室温下自然干燥。
    注意：PLL 溶液可于 4 °C 保存并重复使用（最多 3 次）。
  3. 将干燥的 CVs 置于培养皿中，在 4 °C 下保存（最多 7–10 天），或将其放入含有铺板培养基的孔中（培养基成分见表 2，工作体积见表 3）。直接将铺板培养基加入 12 孔板的孔中（表 3）。
    注意：神经元对胎牛血清（FBS）的质量非常敏感。应测试不同批次的 FBS，以确定细胞状态更佳的批次。一旦确定优质批次的 FBS，建议大量获取并储存于 -80 °C。本方案可适用于其他类型的 CVs 和培养板（参见表 3中的不同工作体积）。
铺板培养基
MEM42.5mL
10% 马血清或胎牛血清*5mL
30% 葡萄糖（终浓度 0.6%）1mL
PS（青霉素，10000 U/mL；链霉素，10 mg/mL）；0.5mL
电穿孔培养基
Opti-MEM
神经元培养基
Neurobasal 培养基48.5mL
B-271mL
Glutamax 200 mM0.125mL
PS（青霉素，10000 U/mL；链霉素，10 mg/mL）；0.5mL
氧糖剥夺培养基（Tasca, et al. 2014）
CaCl21mM
KCl5mM
NaCl137mM
KH2PO40.4mM
Na2HPO40.3mM
MgCl20.5mM
MgSO40.4mM
HEPES25mM
NaHCO34mM

表2：所用不同培养基的成分。

孔板的表面积工作体积
96 孔板0.32cm20.1mL
24 孔板1.9cm20.5mL
12 孔板3.8cm21mL
6 孔板9.5cm22.5mL
60 mm 培养皿21.5cm26mL

表3：不同类型培养板的表面积及工作体积。

  1. 神经元培养物的制备
    1. 将铺板培养基、神经元培养基和电穿孔培养基（其成分见表2）置于细胞培养箱中（37 °C，5% CO2环境），瓶盖部分打开，预热并平衡至少2小时。将胰蛋白酶在室温下回温。将1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS）在37 °C水浴中预热。
    2. 设定电穿孔参数（见表4）。
电穿孔条件：打孔脉冲
时长电压 (V)间隔次数 (N)衰减率 (D. Rate)极性
2 ms17550210正极
电穿孔条件：转移脉冲
时长电压 (V)间隔次数 (N)衰减率 (D. Rate)极性
502050540正负交替

表4：NEPA21电穿孔仪的设置参数。

  1. 大脑解剖及收获 CD-1 小鼠 embryos 在交配后 E15
    1. 通过颈椎脱位法处死怀孕雌鼠，无需麻醉。用 70% 乙醇对腹部进行消毒；使用锋利的剪刀切开并打开腹腔。
    2. 取出子宫并置于含有冷 1x HBSS 的培养皿中。用普通镊子将其放在细胞培养罩内的冰上。
    3. 借助镊子和剪刀从子宫中取出一个胚胎，并用剪刀一次性剪断头部使其断头。
    4. 握住头部，将镊子（例如 Dumont 精细镊子）插入眼眶。
    5. 使用针头（30 G 针头注射器）作为刀片，切开前囟并穿透头部后部。
    6. 将尖头镊子垂直通过切口插入前囟，撬开前部的薄层皮肤。拉动镊子沿两半球之间的纵裂移动，避免损伤皮层。
    7. 以 45° 角使用小镊子从前向后方向将脑组织从头部取出。
    8. 在体视显微镜下，将脑组织转移至含有冰上预冷 1x HBSS 的 3.5 cm 培养皿中。
  2. 皮层解剖
    注意：神经元培养方案改编自 Dotti 和 Banker10 所描述的方法。
    1. 使用 Dumont 镊子（11 cm）固定丘脑，并用倾斜 45° 角的针头将每个半球的皮层与中脑分离。确保皮层不残留其他组织；使用尖头镊子去除软脑膜。
      注意：软脑膜是一层包裹大脑的薄而有弹性的膜，因其呈红色而易于识别。采用轻柔的之字形动作有助于去除软脑膜。必须确保完全去除软脑膜，因其对培养具有毒性。
    2. 将清洁后的皮层转移至另一个干净的、含有冰上预冷 1x HBSS 的 3.5 cm 培养皿中，并置于冰上。
  3. 组织分散
    1. 将每个皮层切成两半，并使用镊子或锋利的针头（30 G）帮助在下一步中增强胰蛋白酶的作用。
    2. 使用 P1000 移液器（移液器吸头前端切去 3–4 mm）将组织块转移至 15 mL 管中含 7 mL 室温胰蛋白酶-EDTA 缓冲液的溶液中。等待组织块沉降至移液器吸头底部后再释放。通过倾斜混匀。
    3. 在 37 °C 水浴中孵育 12 分钟。每 4–5 分钟倾斜混匀一次。
      注意：孵育时间可在 12 至 15 分钟之间调整。
    4. 让组织自然沉降，小心吸除胰蛋白酶溶液。用 8 mL 1x HBSS 洗涤组织两次，通过倾斜轻轻振荡。使用 P1000 移液器（使用未剪切的吸头）小心吸除 1x HBSS。
    5. 用 5 mL 铺板培养基洗涤组织一次，通过倾斜振荡。使用 P1000 移液器小心吸除铺板培养基。
    6. 加入 1.5 mL 铺板培养基。使用 P1000 移液器通过从管底吸取培养基并轻柔地沿管壁释放，机械性地吹打混悬液，最多吹打 8–12 次。
    7. 通过置于 50 mL 管上的无菌细胞筛网（70 µm）过滤。向管中加入 10 mL 或其他所需体积的铺板培养基。
    8. 取 5 µL 细胞悬液加入细胞计数板，再加入 5 µL 台盼蓝（0.4% w/v），进行细胞计数。
    9. 接种细胞（见第 1.6 节），将适量细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，以获得电穿孔所需的细胞数量（例如 106 个细胞）。在 250 × g 下离心 5 分钟。继续进行第 1.6 节操作。
  4. 细胞接种
    1. 将未离心的细胞悬液（来自步骤 1.5.7）以所需密度接种至每孔含有铺板培养基的孔中。
      注意：本方案中，在 12 孔板中每孔接种 100,000 至 200,000 个细胞。作为参考，每个实验条件至少接种 3 个 CV（独立培养孔），以考虑实验变异性。典型的实验设置可能包括每 CV 成像 4–5 个视野（例如使用 20x 物镜，每个视野宽度约为 ~1.3 mm2）。
    2. 在细胞培养罩内将培养板朝各个基本方向移动，使细胞均匀分布。
  5. 电穿孔
    注意：也可使用其他转染系统。本方案使用的 NEPA21 系统具有“开放系统”的优势""。用户可自行修改该方案，且无需使用特定试剂或专用于电穿孔的特殊比色皿。本方案改编自文献5。
    1. 从步骤 1.5.9 继续操作。在 15 mL 管中用 5 mL 电穿孔培养基重悬细胞沉淀。在 250 × g 下离心 5 分钟。
    2. 重复步骤 1.7.1。用电穿孔培养基重悬细胞，使每个电穿孔比色皿中的细胞浓度达到 106 个/mL。在比色皿中将细胞与所需量的 DNA 混合。
      注意：为表达 GFP，每百万细胞使用 3 µg 质粒。由于不同质粒间转染效率差异较大，建议测试每种质粒的最佳浓度。已测试的范围为每百万细胞 2–24 µg。可在同一比色皿中混合多种质粒以实现双重转染。在共转染情况下，目的基因的用量应高于 GFP（例如 3:1 为推荐比例，需进行测试），以确保大多数表达 GFP 的细胞同时表达目的基因。
    3. 将比色皿放入比色皿室（图 2）。按下开始按钮执行预设程序（电穿孔条件见表 4）。记录测量框中显示的电流和焦耳值。
      注意：用户可调整特定参数。例如，降低电压可能减少转染效率，但可提高神经元存活率。
    4. 将比色皿从室中取出。电穿孔后立即向比色皿中加入 500 µL 铺板培养基，并使用移液器将样品转移至 1.5 mL 离心管中。
      注意：加入培养基的速度越快，电穿孔后细胞存活率越高，有助于避免细胞损伤。
    5. 将所需数量的电穿孔细胞接种至各孔中。
      注意：在 12 孔板中每孔接种 20,000 至 100,000 个细胞。根据实验条件，仅有 5–10% 的电穿孔细胞可能存活。具体数量应由用户测试并优化。
    6. 在标准条件下（37 °C，5% CO2，饱和湿度）孵育 2–4 小时。
      注意：孵育结束后在显微镜下观察细胞。若培养状态良好，大多数细胞应已贴附于表面并开始长出可见的神经突起。
    7. 将铺板培养基更换为神经元培养基（体积和成分分别见表 1 和 表 2）。
  6. 细胞维持
    1. 换液时，在培养 7 天后移除一半培养基，并加入等体积的新鲜预平衡培养基。
    2. 在培养第 10 天，用不含谷氨酰胺补充剂的新鲜神经元培养基替换一半体积（见材料表）。自第 10 天起，每隔一天重复此步骤。
      ​注意：培养 10 天后，细胞可自行产生谷氨酸。

2. 缺氧室的构建

  1. 为此目的，使用任何带螺口盖或等效密封系统的密闭容器（图3A）。在塑料容器的壁上钻两个孔，并在每个孔中插入一根塑料管。用硅胶密封，确保容器完全密闭（图3）。
    ​注意：此处使用了一个圆柱形塑料容器（容量1升）并配以螺口盖来构建培养室。确保容器足够大，能够容纳实验所需的CVs。若需在同一空间内处理更多CVs，可将塑料平台叠放（图3A）。
  2. 为制备鼓泡室（见3.2节），使用标准机械钻头在烧瓶盖上钻一个孔，钻头直径应略小于塑料管外径，然后将塑料管穿过孔插入烧瓶中。用封口膜密封孔口，以维持密闭状态（图3B）。
  3. 使用前，用70%乙醇对容器和烧瓶进行消毒，并用紫外线照射一个循环。

3. 氧糖剥夺（OGD）

注意：氧糖剥夺（OGD）方案改编自 Tasca 等人7。

  1. 使用已预先添加抗生素的磷酸盐溶液（表2）配制OGD溶液。
    注意：每35 mm培养皿使用5 mL；每100 mm培养皿使用10 mL。
  2. 将OGD溶液加入鼓泡室（图3B）内，并将其置于已预热至37 °C的水浴中。将烧瓶连接至氮气源（N2，100%）。
    注意：由于OGD溶液以HEPES作为缓冲体系，因此无需CO2。若OGD溶液采用碳酸氢盐缓冲体系，则应使用5% CO2和95% N2混合气体对缺氧溶液和腔室进行饱和。
  3. 用轻柔通入的氮气对OGD溶液进行饱和，保持溶液轻微鼓泡状态20–30分钟。
  4. 立即将烧瓶转移至细胞培养超净台，向35 mm培养皿中加入5 mL无氧OGD溶液，或向100 mm培养皿中加入10 mL无氧OGD溶液。
  5. 将载有培养细胞的CV转移至含有OGD溶液的培养皿中。不盖皿盖，将培养皿移入缺氧室并牢固但轻柔地关闭。
    注意：步骤3.4和3.5必须尽快完成。将对照组CV（常氧条件下的神经元培养基）保留在培养箱内的多孔板中。或者，可将对照神经元暴露于补充葡萄糖（10 mM）的常氧OGD培养基中，以更特异性地评估缺氧与葡萄糖剥夺的效应。
  6. 将氮气系统连接至缺氧室，并检查管路是否通畅。以2–3 bar的压力（例如2–3分钟；1 bar = 750 mmHg）向腔室内通入N2数分钟（图3C）。
    注意：在多个时间点之间，务必再次对OGD溶液通氮气鼓泡15分钟。
  7. 将氮气压力降至1.3–1.5 bar，并关闭缺氧室的两个管路（图3C）。将腔室置于37 °C、5% CO2的培养箱中，孵育所需时间（例如60分钟）。
    注意：OGD持续时间可能需根据实验条件和研究目标进行调整。较短的孵育时间（例如30分钟）可模拟轻度缺氧；两小时的OGD通常对神经元具有极强的损伤性。建议在正式开展研究前，先测试45至90分钟的OGD时长。当然，OGD持续时间将影响细胞总体存活率以及恢复后神经元死亡的相对发生时间。若目标为实时分析神经元死亡，建议设定OGD条件，使细胞在恢复后数小时开始出现死亡，以便进行更有效的动态观察。
  8. 打开腔室，将CV转移回原始的多孔板中进行恢复。此后可选择两种后续方案：1）对于小规模实验，进入第4节进行免疫荧光染色与图像分析；2）对于高内涵筛选，进入第5节使用细胞分析仪（或等效平台）进行分析。
    ​注意：活细胞成像提供了更灵活的方法，因其允许对不同实验时间点进行实时监测。

4. 采用标准免疫荧光与ImageJ进行分析

注意：恢复时间可能因条件不同而有所差异，通常为 1 至 24 小时。

  1. 用 1× PBS 清洗神经元 10 分钟。
    注意：此步骤为可选步骤，因为有多种后续处理和图像分析方法。
  2. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定神经元 10 分钟，然后用 1× PBS 洗涤三次，每次 10 分钟。
    注意：多聚甲醛具有毒性，操作时应在化学通风橱中进行。
  3. 加入含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS，对神经元进行透化处理 10 分钟。用 1× PBS 快速洗涤细胞一次，再重复洗涤两次，每次 10 分钟。
  4. 向盖玻片（CVs）中加入 350 µL 封闭液（含 2% 牛血清白蛋白的 1× PBS），室温孵育至少 30 分钟。将一抗（AB）原液短暂离心（5 × g，30 秒），按所需稀释比例与封闭液混合，例如抗 GFP 抗体按 1:600 稀释。
    1. 将盖玻片转移至湿润 chamber（内含浸水滤纸以维持湿度、防止蒸发）中的 Parafilm 表面。根据盖玻片大小，小心地在每张盖玻片上加入 60 或 80 µL 一抗稀释液，确保细胞完全接触抗体。于 4 °C 过夜孵育。
      注意：抗体液滴应覆盖整个盖玻片表面形成完整液膜。加样时避免扰动细胞。也可在室温下孵育 2 小时以缩短时间。
  5. 在 Parafilm 上用 1× PBS 洗涤盖玻片 10 分钟，重复该洗涤步骤两次。
  6. 将二抗（如 Alexa 488，1:500）和 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:2,000）用封闭液稀释。根据盖玻片大小，在细胞上加入 60–80 µL 二抗溶液。室温避光孵育 1 小时。用 1× PBS 洗涤去除神经元上的二抗和 DAPI，每次 10 分钟，重复两次。
  7. 将盖玻片用封片剂（见材料表）封片，用于免疫荧光分析，干燥后于 4 °C 避光保存。
  8. 图像采集与分析。
    注意：使用倒置显微镜在 20× 下拍摄图像（图 4A，见材料表）。
    1. 使用开源软件 ImageJ 分析图像，并获取 GFP 通道的掩膜图像（图 4C）。
      注意：神经元的成像与分析方法多样，具体取决于设备条件和实验设计。以下流程仅为示例，旨在识别图像中表达 GFP 的单个神经元胞体。此处提供的具体参数值（如阈值和颗粒大小）需用户根据自身实验条件进行优化。此外，可添加其他滤镜或处理步骤。例如，在图像处理初期使用 ImageJ 的减去背景（Subtract Background）和去斑点（Despeckle）滤镜通常有助于图像去噪。针对特定实验条件优化分析流程需要具备图像分析经验以及定量图像分析的基本知识。由于本方案不涉及图像分析的深入指导，我们推荐以下资源：ImageJ 用户指南 https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/；示例与教程 https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm；MBF ImageJ 工具包 https://imagej.net/mbf/index.htm。
    2. 进行分割时，选择强度（Intensity）分割方式并设置必要参数以分离胞体（即神经元中最亮的区域）：菜单 | 图像 | 调整 | 阈值 | 设置最小阈值（例如 100）| 点击应用。
    3. 将步骤 4.8.2 中的阈值设置应用于所有图像，以生成神经元胞体的掩膜图像（即分割后的图像）（图 4E）。
    4. 为统计每张图像中存活细胞的数量并将结果导出至电子表格进行计算，请选择菜单 | 分析 | 分析颗粒，并输入必要的参数值（例如，大小：50–无穷像素；圆度：0.5–1.00）。注意，在 t = 0 h 时计数的细胞数为初始总细胞数，据此计算不同时间点的细胞存活率。
      注意：设置较低的尺寸阈值有助于排除小于胞体的微小结构（例如 60–80 µm2）。
    5. 使用 ImageJ 的记录宏（Record Macro）功能实现分析流程的自动化与重复：菜单 | 插件 | 宏 | 记录 | 点击创建以生成宏代码。

5. 使用 IN Cell Analyzer 2200 进行实时分析

  1. 将12孔板插入细胞分析仪中，连接CO2系统，并将温度设定为37 °C。
    ​注意：此步骤可在该平台上轻松放大，例如在接种于96孔板中的神经元中进行类似的实验。
  2. 选择20倍物镜，每孔随机选择5个视野（在此示例中覆盖孔面积的2.33%），并为每个荧光通道（本例中为异硫氰酸荧光素[FITC]）自动对焦。设置采集参数（每30分钟采集一次，持续16小时）。点击开始并等待。
    注意：成像视野的数量应由研究者确定，且应足够多以反映单个孔内的变异情况。
  3. 使用IN Cell Developer工具箱v1.9设置适当的分析工作流程。
  4. 分析神经元图像（FITC通道），生成神经元胞体的掩模（图4）。
    注意：目标是识别图像中单个神经元的胞体。该分析步骤与第4节中ImageJ的操作等效。有关工作流程和一般注意事项，请参见第4节。通过设定强度阈值来选择胞体，即神经元中最亮的区域。
    1. 进行分割时，选择强度分割并设置必要参数（本例中最小阈值为20005.40）。
    2. 进行后处理时，选择筛除选项，保留面积大于预设值的目标（此处为189像素（约80 µm2））。
    3. 选择求和参数，用于统计并累加每个时间点每个视野以及每孔所有视野中掩模识别出的神经元数量（存活神经元）。
    4. 将结果导出至电子表格。在t = 0 h时，将计数的细胞数视为初始总细胞数，计算不同时间点的细胞存活百分比。计算50%细胞死亡所需的时间，以便于不同条件间的比较。
      注意：分割和后处理步骤的参数需由用户根据不同的荧光通道及待识别结构进行调整。

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结果

本方案旨在建立一个 体外 卒中模型。获得适当的神经元密度至关重要，这将有助于识别单个电穿孔神经元并对其进行单独分析。神经元接种后的培养阶段同样关键。神经元在体外培养中的成熟过程是渐进的，其对生长因子的依赖性、神经突起的生长、细胞连接性以及电生理活性会因培养阶段的不同而存在显著差异。在接种后4-6天的特定条件下 体外尽管神经突已充分延伸，神经元仍处于高度未成熟状态，对生长因子有很强的依赖性，且电生理活性相对较低。在此阶段，氧糖剥夺（OGD）可能模拟更接近胚胎发育的条件。在第8至10天可观察到树突棘和清晰的突触簇。 体外11第14天 体外 在这些实验条件下，皮层神经元已发育成熟，并达到了连接性和电生理活性的完全复杂程度3在此，我们在第14天对皮层神经元施加氧糖剥夺（OGD）处理，以模拟成年大脑的条件。

经过60分钟的氧糖剥夺（OGD）后，将神经元置于IN Cell Analyzer 2200中进行孵育。对照组神经元同时成...

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讨论

本方案展示了一种模拟中风的有效方法 体外为实现这一目标，我们提出使用NEPA21电穿孔系统对皮层神经元进行稀疏标记5这是一个开放系统，与使用试剂盒或特定设备的其他系统相比，该系统可在最低的运行成本下实现方案的定制化。与低密度神经元培养相比，未分化的神经元与电穿孔神经元的混合培养具有更高的灵活性和稳健性。该方法可用于研究不同基因、表达载体和蛋白质的影响，且易于扩增。例如，我们曾采用类似方法研究皮层神经元表达的神经营养因子Nrg1在脑卒中过程中对细胞内信号通路的作用。4此外，可根据研究目的将电穿孔细胞以不同密度与未电穿孔细胞混合，从而获得稀疏且可调节数量的荧光细胞。

例如，建议在进行细胞形态学分析时使用较低的浓度，以便能够观察到孤立的单个神经元，尤其是在神经突显著延伸的后期阶段。通常情况下，应确保在任意一个成像视野中存在足够数量的荧光标记神经元，以实现一致的定量分析（例如，平均 n > 10），但数量不宜过多，以保证单个细胞仍可被清晰区分（例如，平均 n < ...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Carlos Dotti在神经元培养方面的专业知识分享。同时感谢来自费利佩王子研究中心（CIPF）细胞组学核心设施的Alicia Martínez-Romero，该设施得到了欧洲FEDERER基金的支持。本项目得到了西班牙经济与竞争力部对项目（SAF2017-89020-R）的资助，用于试剂、材料以及YDC和PF的薪资。PF还获得了RyC-2014-16410项目的资助。CGN和PF得到了巴伦西亚自治区卫生理事会以及AGM（ACIF/2019/015）的支持。Ángela Rodríguez Prieto得到了西班牙科学、创新与大学部PRE2018-083562项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 厘米培养皿FISHER SCIENTIFIC, S.L.1130-9283
3.5 厘米培养皿Sterilin
75 cm2 培养瓶Corning430641U
B-27Life Technologies17504-044
细胞培养板Corning incorporation Costar®3513
细胞培养箱Thermo Electron CorporationModel 371
70 µm 细胞筛Falcon352350
冷光源Schott223488KL 1500 LCD
盖玻片（15 mm）Marienfeld111530
CU500 比色皿腔室Nepa Gene
CU600 比色皿支架Nepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, S. L.D9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Dumont 精细镊子FST11254-20
Dumont 精细镊子FST11252-00
EC-002S NEPA 电穿孔比色皿，2 mm 间隙Nepa Gene
滤网筛Falcon352350
精细剪刀—尖头-钝头FST14028-10
精细剪刀— ToughCut rFST14058-09
GFP 鸡 IgY 抗体Aves LabsGFP-10101:600
葡萄糖Sigma68769-100ml
GlutaMAX-I 补充剂 200 mM 100 mLFisher Scientific35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
马血清Invitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
显微镜载玻片（多聚赖氨酸包被）VWR631-0107尺寸：25 × 75 × 1 mm
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich Quimica, S. L.81381-250G
黄色针头，30 号BD Microlance™ 3304000
NEPA21 电穿孔仪Nepa Gene
血细胞计数板（Neubauer 计数室）Blau Brand717805
Neurobasal 培养基ThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
Parafilm 封口膜Cole-ParmerPM996
多聚甲醛（PFA），95%Sigma-Aldrich Quimica, S. L.158127-500G使用浓度：4%
PEIPolysciences23966-1
表达 GFP 的质粒pCMV-GFP-ires-Cre，见于 Fazzari 等人，Nature，2010
多聚-L-赖氨酸SIGMAP2636
PS（青霉素-链霉素）ThermoFisher15140122
齿状镊FST11152-10
体视显微镜WORLD PRECISION INSTRUMENTS
注射器BD Plastipak 1ml303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.MDL number: MFCD00128254非离子型
胰蛋白酶-EDTAThermoFisher25300054
15 mL 离心管Fisher05-539-4
50 mL 离心管VWR21008-242
密封保鲜盒--带螺纹盖的密封保鲜盒，SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca。任何等效的密封保鲜盒均可在超市购买。
水浴锅SHELDON LABORATORY MODEL 12241641951

参考文献

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

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