一种可扩展的方法：在原代神经元培养中以单细胞和实时分辨率研究神经元存活

摘要

本文介绍了一种简单、高效且用途广泛的方法，可用于在细胞水平上实时或在固定样本中研究原代皮层神经元在细胞毒性应激条件下的存活情况。

摘要

神经元丢失是许多神经病理学疾病的核心环节，包括脑卒中、阿尔茨海默病和帕金森病。为研究细胞毒性应激条件下神经元存活的过程，已开发出多种方法。大多数方法基于生物化学手段，无法实现单细胞分辨率，或涉及复杂且昂贵的技术流程。本文介绍一种用途广泛、成本低廉且高效的实验范式，用于研究神经元存活。该方法利用稀疏荧光标记神经元，结合活细胞成像和自动化定量分析。为实现该目标，通过电穿孔使神经元表达荧光标记物，并与未电穿孔的神经元共培养，从而便于调控细胞密度并提高存活率。

通过电穿孔实现稀疏标记，可进行简单且稳健的自动化定量分析。此外，荧光标记可与目的基因的共表达相结合，用于研究特定的分子通路。本文介绍了一种作为神经毒性模型的脑卒中模型，即氧糖剥夺（OGD）检测，该实验在一种经济、可靠的自制缺氧舱中完成。最后，描述了两种不同的图像分析工作流程，分别使用 IN Cell Analyzer 2200 或开源软件 ImageJ 进行半自动化的数据处理。该工作流程可轻松适配于不同的毒性实验模型，并可扩展用于高通量筛选。综上所述，本方案提供了一种易于操作、成本低廉且高效的 体外 神经毒性模型，适用于在活体成像中检测特定基因和信号通路的作用，以及用于高通量药物筛选。

引言

研究神经元紊乱需要适用于遗传学、分子和细胞分析的实验模型。原代皮层神经元是研究神经元存活与毒性的强有力模型^1,2,3,4。在适当条件下，原代神经元会逐步形成突触连接，并表现出成熟神经元的典型特征。因此，该模型在模拟神经元生理功能方面比永生化细胞系更可靠，且相较于动物模型更易于操作。然而，与细胞系相比，原代皮层神经元转染困难，且相对脆弱。此外，皮层神经元复杂的形态可能使高密度培养中的成像与分析变得复杂。相反，低密度原代神经元培养物更易于分析，但通常更为脆弱。

综合考虑以上因素，本文介绍了一种经济实惠、用途广泛且可扩展的 体外 用于模拟与研究神经元存活的工作流程（图1）。本方案的关键要点包括 i）该方法的 体外 使用荧光标记物对神经元进行电穿孔，以实现稀疏标记和活细胞成像；ii）在不同细胞毒性模型中的适用性；iii）半自动化或自动化分析。

电穿孔系统（参见材料表）提供了一种开放且低成本的操作方法，无需使用试剂盒和特定溶液

方案

所有涉及动物的实验操作均应由机构的生物伦理动物委员会监督，并遵守当地法规执行。本文所述操作程序已获得授权机构批准，符合西班牙及欧洲的法规要求。

1. 原代神经元培养

注意：所有步骤均在超净工作台内进行，使用无菌材料和溶液以维持无菌条件。

1. 多聚-L-赖氨酸（PLL）包被
   1. 将盖玻片（CVs，15 mm）在70%乙醇中于旋转摇床中过夜（o/n）清洗。
      注意：旋转摇床的速度应足以轻柔移动盖玻片，但不可过快，以避免损伤或刮伤盖玻片。具体转速因摇床型号而异。盖玻片可在乙醇中长期保存（数月）。
   2. 移除乙醇，用去离子水清洗两次，每次10分钟。
   3. 将盖玻片置于100 mm培养皿中（每皿约13片），在室温（RT）下自然晾干。确保盖玻片彼此之间及与培养皿边缘不接触。
      注意：干燥后的盖玻片可在室温下长期保存（数月）。
   4. 用水配制5 mg/mL PLL储存液，分装后于-20 °C保存。使用时用1×PBS稀释至工作浓度0.1 mg/mL。
      注意：可尝试最高至1 mg/mL的PLL浓度。
   5. 加入足以覆盖盖玻片表面的最小体积PLL溶液（PLL最佳体积见表1）。以滴加方式加入PLL溶液，有助于液滴形成。
      注意：进行免疫荧光染色时需将....

结果

本方案旨在建立一个 体外 卒中模型。获得适当的神经元密度至关重要，这将有助于识别单个电穿孔神经元并对其进行单独分析。神经元接种后的培养阶段同样关键。神经元在体外培养中的成熟过程是渐进的，其对生长因子的依赖性、神经突起的生长、细胞连接性以及电生理活性会因培养阶段的不同而存在显著差异。在接种后4-6天的特定条件下 体外尽管神经突已充分延伸，神经元仍处于高度未成熟状态，对生长因子有很强的依赖性，且电生理活性相对较低。在此阶段，氧糖剥夺（OGD）可能模拟更接近胚胎发育的条件。在第8至10天可观察到树突棘和清晰的突触簇。 体外¹¹第14天 体外 在这些实验条件下，皮层神经元已发育成熟，并达到了连接性和电生理活性的完全复杂程度³在此，我们在第14天对皮层神经元施加氧糖剥夺（OGD）处理，以模拟成年大脑的条件。

经过60分钟的氧糖剥夺（OGD）后，将神经元置于IN Cell Analyzer 2200中进行孵育。对照组神经元同时成.......

讨论

本方案展示了一种模拟中风的有效方法 体外为实现这一目标，我们提出使用NEPA21电穿孔系统对皮层神经元进行稀疏标记⁵这是一个开放系统，与使用试剂盒或特定设备的其他系统相比，该系统可在最低的运行成本下实现方案的定制化。与低密度神经元培养相比，未分化的神经元与电穿孔神经元的混合培养具有更高的灵活性和稳健性。该方法可用于研究不同基因、表达载体和蛋白质的影响，且易于扩增。例如，我们曾采用类似方法研究皮层神经元表达的神经营养因子Nrg1在脑卒中过程中对细胞内信号通路的作用。⁴此外，可根据研究目的将电穿孔细胞以不同密度与未电穿孔细胞混合，从而获得稀疏且可调节数量的荧光细胞。

例如，建议在进行细胞形态学分析时使用较低的浓度，以便能够观察到孤立的单个神经元，尤其是在神经突显著延伸的后期阶段。通常情况下，应确保在任意一个成像视野中存在足够数量的荧光标记神经元，以实现一致的定量分析（例如，平均 n > 10），但数量不宜过多，以保证单个细胞仍可被清晰区分（例如，平均 n < .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 厘米培养皿	FISHER SCIENTIFIC, S.L.	1130-9283
3.5 厘米培养皿	Sterilin
75 cm2 培养瓶	Corning	430641U
B-27	Life Technologies	17504-044
细胞培养板	Corning incorporation Costar®	3513
细胞培养箱	Thermo Electron Corporation	Model 371
70 µm 细胞筛	Falcon	352350
冷光源	Schott	223488	KL 1500 LCD
盖玻片（15 mm）	Marienfeld	111530
CU500 比色皿腔室	Nepa Gene
CU600 比色皿支架	Nepa Gene
DAPI	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	D9542-10MG	1:2000
DMSO	Panreac	A3672
Dumont 精细镊子	FST	11254-20
Dumont 精细镊子	FST	11252-00
EC-002S NEPA 电穿孔比色皿，2 mm 间隙	Nepa Gene
滤网筛	Falcon	352350
精细剪刀—尖头-钝头	FST	14028-10
精细剪刀— ToughCut r	FST	14058-09
GFP 鸡 IgY 抗体	Aves Labs	GFP-1010	1:600
葡萄糖	Sigma	68769-100ml
GlutaMAX-I 补充剂 200 mM 100 mL	Fisher Scientific	35050-061
HBSS	Thermofisher	14175-095	https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 M	ThermoFisher	15630-080
马血清	Invitrogen	26050088
MEM	Thermofisher	11095080	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
显微镜载玻片（多聚赖氨酸包被）	VWR	631-0107	尺寸：25 × 75 × 1 mm
Mowiol 4-88	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	81381-250G
黄色针头，30 号	BD Microlance™ 3	304000
NEPA21 电穿孔仪	Nepa Gene
血细胞计数板（Neubauer 计数室）	Blau Brand	717805
Neurobasal 培养基	ThermoFisher	21103-49
Opti-MEM	Invitrogen	31985-062
Parafilm 封口膜	Cole-Parmer	PM996
多聚甲醛（PFA），95%	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	158127-500G	使用浓度：4%
PEI	Polysciences	23966-1
表达 GFP 的质粒			pCMV-GFP-ires-Cre，见于 Fazzari 等人，Nature，2010
多聚-L-赖氨酸	SIGMA	P2636
PS（青霉素-链霉素）	ThermoFisher	15140122
齿状镊	FST	11152-10
体视显微镜	WORLD PRECISION INSTRUMENTS
注射器	BD Plastipak 1ml	303176
Triton X-100	Sigma-Aldrich Quimica, S. L.	MDL number: MFCD00128254	非离子型
胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher	25300054
15 mL 离心管	Fisher	05-539-4
50 mL 离心管	VWR	21008-242
密封保鲜盒	-	-	带螺纹盖的密封保鲜盒，SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca。任何等效的密封保鲜盒均可在超市购买。
水浴锅	SHELDON LABORATORY MODEL 1224	1641951