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用于急性和慢性在体记录的碳纤维微电极阵列的构建与实施

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DOI：

10.3791/62760

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2021年8月5日

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1Department of Biology, Washington University in St. Louis, 2Department of Biology, Program in Neuroscience, Brandeis University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于在小鼠（Mus musculus）和雪貂（Mustela putorius furo）多个脑区进行急性和慢性体内电生理记录的碳纤维微电极阵列的构建方法。从购买原始碳纤维到微电极阵列植入的每一步均进行了详细说明，重点在于微电极阵列的制备过程。

摘要

多通道电极阵列能够揭示大脑的工作机制，有助于阐明单细胞和神经环路水平的神经活动过程。这些工具的开发对于理解复杂行为与认知功能，以及推动临床应用具有重要意义。然而，长期稳定且连续地密集记录细胞群体的电活动仍是一项挑战。许多常用的电极（如四极电极和硅基电极阵列）具有较大的横截面直径，插入时会造成组织损伤，并引发慢性组织反应，导致神经元死亡，从而阻碍稳定、连续神经信号的记录。此外，大多数导线束的通道间距较宽，难以同时记录小区域内密集分布的大量细胞。本实验方案所描述的碳纤维微电极阵列为解决上述问题提供了一种可行的方案。本研究提供了一种详细的碳纤维微电极阵列制备方法，可用于体内急性与慢性记录。in vivo。这些电极的物理特性使其非常适合在高细胞密度区域进行稳定、连续的长期记录，使研究人员能够在数月时间内对单个神经元单位进行可靠且明确的记录。

引言

电极和电极阵列是研究大脑在神经元水平如何处理信息的重要工具。尽管电生理记录技术已有两百多年的历史1，但目前仍无法在足够高的时空分辨率下同时测量整个神经回路的活动，以捕捉单个神经元的放电行为。虽然非侵入性方法（如脑电图2、正电子发射断层成像3和功能性磁共振成像4）能够实现全脑范围的测量，但它们无法达到解析神经回路活动所需的时空分辨率2,5。相比之下，光学成像方法（如使用电压敏感染料或基因编码的钙指示剂）可实现单细胞水平的空间分辨率，但仍存在时间分辨率低和选择性差等问题3,4,5,6。电生理记录是这些方法的一种有力替代方案。记录电极具有无与伦比的时间分辨率，使研究人员能够在脑部任意区域以毫秒级精度记录神经元放电信号7。此外，长期植入的多电极阵列（MEAs）可在数天至数月的时间内，对清醒动物进行大规模（数十至数百个细胞）的单细胞记录8,9。然而，高密度记录所用的硅探针体积较大，侵入性强，且长期植入的电极阵列常引发炎症反应、组织包裹和神经元死亡等问题10,11,12,13。

现有电极的局限性促使了近年来的技术创新，实现了稳定、高分辨率、长期的神经信号记录。传统的电极通常由金属导体（如钨或铂铱合金）制成，或基于硅材料或聚合物材料。虽然基于金属的微丝阵列能够实现长期稳定的记录，但其占据空间较大，单根导丝的直径范围为10–200 µm14。相比之下，基于硅的电极阵列可提供高空间分辨率的记录，但由于其结构相对刚性，通常难以在数月内持续保持信号稳定性，也无法长期稳定地记录同一神经元的活动15。近年来硅基阵列技术有所进展，已开发出可用于慢性记录的电极，但这些阵列无法用于较大动物的深部脑区记录，且仅适用于线性排列的记录9。聚合物阵列的进展提高了单个单元记录的柔韧性和稳定性，并有望在未来实现高密度记录，但目前可用性仍有限8,16,17。碳纤维电极则可利用现成材料实现高密度记录，本文将对此进行描述。

碳纤维记录微电极已使用数十年，最早的碳纤维电极由一根单碳纤维插入玻璃微移液管中构成。这些微电极用于单细胞胞外记录，尽管其信噪比与最佳的钨丝-玻璃微电极相当，但由于其柔韧性好、阻抗值较低且制造简单，因而具有显著优势18,19。近年来，由于碳纤维具备优异的生物传感性能，开发碳纤维电极阵列的研究进展迅速。除了更高的生物相容性和卓越的电导性外，碳纤维还具有一系列独特性质，包括耐高温、相对密度低、抗拉强度高、弯曲刚度低、检测灵敏度高以及横截面积小10,12。上述所有特性推动了碳纤维微电极阵列（CFEAs）的发展，使其能够实现长期、稳定且高通量的单神经元记录。目前，此类CFEAs已可通过手工制备20,21 （图1），所制得的微电极阵列可对单个神经元进行持续数月的稳定记录。本文介绍了一种易于实现的CFEAs构建方法，该方法已针对两个物种的急性与慢性单神经元记录进行了两种适应性改进。

方案

所有实验程序均经布兰迪斯大学或华盛顿大学动物护理与使用委员会批准。所示数据来自一只雌性雪貂和一只雄性小鼠。

1. 碳纤维和工具的制备

  1. 商用碳纤维的制备
    1. 从环氧树脂上浆的纤维束上裁剪出8 cm长的条状纤维。将这些条状纤维平行放置于坩埚中，在马弗炉中于400 °C下加热6小时，以去除商用纤维表面的环氧树脂。随后，将处理后的纤维储存于标准培养皿或锥形管中。
      注意：实验中使用了直径为7 µm的纤维。其他研究团队曾使用直径为4 µm的纤维20,21。
    2. 制备用于固定单根纤维的样品盒。使用3D打印机或激光切割机制作样品盒及其配套的样品盒支架（见图2）。
    3. 将纤维装载到样品盒上。首先，在样品盒两侧长边上贴上双面胶带，使胶带边缘与样品盒内侧边缘对齐。从焙烧后的纤维束中分离出单根纤维，并将其平行于样品盒的短边放置，纤维之间保持2–3 mm的间距。确保每个样品盒上装载20–30根纤维。用透明胶带覆盖双面胶带，将纤维固定到位。将装好纤维的样品盒放入样品盒支架中。
      注意：对于有经验的操作者，填充一个样品盒约需1小时；对于初学者，此过程可能需要1.5–3小时。每盒包含十个样品盒，而两个样品盒支架可同时放入派瑞琳沉积室中。
    4. 使用商用真空沉积设备对单根纤维进行派瑞琳C（parylene C）涂层。每个样品仅需一次沉积即可完成涂层。每次运行需称取2.3 g派瑞琳材料。沉积室可同时容纳两个样品盒支架。每次涂层过程耗时约2小时。
      注意：使用2.3 g派瑞琳C可获得约1 µm厚的涂层。涂层后的纤维可长期储存。
  2. 碳纤维操作工具的制备
    1. 将一小片柔性粘性薄膜包裹在30 G针头上，形成一个尖锐但具有柔性的粘性尖端。
      ​注意：用Parafilm薄膜包裹针尖并适度拉伸，可产生轻微的粘附效应，便于操作者拾取和移动单根纤维。

2. 设计与制备

  1. 根据待制作电极的规格，选择所需的最佳夹具设计。该设计应基于所需通道数量以及任何附加的设计要求。
    注：夹具指用于固定电极和电气连接的3D打印块。
  2. 使用计算机辅助设计（CAD）软件创建或修改夹具的具体设计。
  3. 使用高分辨率SLA 3D打印机，通过3D打印公司或机构内的创客实验室打印夹具。

3. 组装碳纤维微电极阵列（CFEA）

注意：此步骤对于有经验的操作者约需 2 小时，对于新手操作者约需 6 小时。所有 CFEA 组装步骤和光纤束合步骤均应在 10 倍体视显微镜下进行。应在空气流动最小的环境中完成 CFEA 的组装，因为气流可能干扰组装过程。

  1. 选择构建所需电极的适当夹具。
  2. 使用金属线剪刀，剪下两段直径为 0.003 英寸（76.2 µm）、长约 7 cm 的钨丝。
  3. 将每根金属丝穿过夹具连接端对应的通道（GND 和 REF）。穿入足够长度，使两端长度相等，然后将它们拧在一起以固定在夹具上。
    注意：对于 16 通道急性设计，请确保金属丝完全嵌入夹具的凹槽内。
    1. 涂抹紫外光固化牙科水泥以固定金属丝。注意不要将牙科水泥进入金属丝穿过的开放通道内。
      注意：操作人员在所有涉及紫外光的步骤中应佩戴防紫外线护目镜，以防止潜在的眼部损伤。许多紫外光固化笔自带观察滤光片。
    2. 使用紫外光固化笔对牙科水泥照射 20 秒进行固化。
    3. 用珠宝台钳夹紧夹具的一臂，将夹具固定在台钳上。调整夹具方向，使其一个侧面与地面平行。
    4. 将夹具和台钳置于显微镜下，确保连接端、基座和漏斗尖端均可见。调整夹具方向，使漏斗朝向远离操作者，而连接端朝向操作者。
    5. 准备好碳纤维操作工具和一支尖头 25 G 针头。
    6. 将装有涂覆聚对二甲苯-C（parylene-C）纤维的盒式载体放置在白纸上，胶带面朝上，使纤维不直接接触纸面。
    7. 使用 25 G 针头从盒式载体中切出单根碳纤维。操作时，将针头尖端沿纤维伸出的位置在载体表面滑动切割。
      1. 若使用半根纤维进行构建，先按上述方法切割纤维一端。将纤维拉直后，用针头在纸上将纤维从中部切断。为切割仍连接在载体上的另一半纤维，先用之前制作的碳纤维工具夹住已分离的自由端，再按上述方法用针头切断仍连接在载体上的部分。
      2. 若使用整根纤维进行构建，先按上述方法切割纤维一端。使用之前制作的碳纤维工具夹住刚切出的自由端，再用针头将纤维另一端从载体上切断。
    8. 使用之前制作的碳纤维工具夹取碳纤维，夹持时使一端伸出工具约 1 cm。
    9. 将带有碳纤维的工具用于操作，将纤维较短的一端从夹具中部基座的漏斗部件穿入。使用显微镜进行观察。
      1. 继续将纤维穿过夹具漏斗，直至大部分纤维长度已穿过（见图 3A）。
      2. 使用之前制作的碳纤维工具，将纤维后段穿入夹具上一个空闲通道。继续穿入，直至约有 5 mm 纤维从后端露出。如有需要，可剪裁至合适长度（见图 3B）。
        注意：切勿将纤维穿入已含有金属丝的通道中。
    10. 按照上述说明，将夹具一侧其余通道依次填入纤维。
      注意：向漏斗中穿入纤维时，应将一半纤维穿入漏斗右侧分隔区，另一半穿入左侧分隔区，即右侧通道对应右侧分隔，左侧通道对应左侧分隔。当纤维在漏斗内紧密接触时，纤维间会产生不利摩擦，导致已穿入的纤维被拉松或断裂。将纤维分为四个小束可缓解此问题，使纤维在后续步骤前保持较小束状。
    11. 使用普通打火机的火花轮，快速将火焰掠过连接端暴露的纤维。确保所有纤维末端的绝缘层均被去除（见图 3C）。
      注意：经火焰处理的纤维部分应比其余部分略细。
    12. 将经火焰处理的纤维重新穿入夹具，使受火焰作用的部分进入通道内部。确保无纤维从夹具后端伸出（见图 3D）。
      注意：使用碳纤维工具从基座内部夹持纤维，并推动经火焰处理的纤维穿过夹具。切勿触碰纤维经火焰处理的部分，因其更为脆弱。
    13. 在夹具基座内的纤维上涂抹紫外光固化牙科水泥。填满整个基座，覆盖所有通道开口及漏斗开口（见图 3E）。
      1. 使用紫外灯照射 20 秒固化牙科水泥。若未完全固化，再额外照射 20 秒。
        注意：确保牙科水泥不会流入通道内部。
    14. 将夹具从台钳中取出，翻转后重新按之前方式固定在台钳中。确保含纤维的一侧朝下。
    15. 按照上述完全相同的方法，将夹具空侧填满碳纤维。
    16. 当所有通道均填入纤维并用牙科水泥固定后，将夹具从台钳中取出，调整方向使漏斗朝下，并重新固定在台钳中，使连接端朝上。
    17. 准备好尖头 25 G 针头、1 mL 注射器、导电银漆、棉签、稀释剂、擦拭纸巾以及合适的前置放大器连接器。
      注意：确保导电银漆充分混合，呈均匀溶液状态。避免油漆干燥。
    18. 用 1 mL 注射器吸取 0.3 mL 银漆，然后安装尖头 25 G 针头。
    19. 小心将针头插入一个通道，直至被牙科水泥阻挡。一边缓慢推动注射器活塞，一边将针头退出通道，以填充银漆（见图 3E）。
    20. 擦拭针头上的多余油漆，然后继续填充下一个通道。
      1. 将所有通道均填充银漆。
        注意：由于油漆在最初几分钟内会在通道中逐渐凝固，可能需要多次重复填充操作。
    21. 将棉签蘸取适量稀释剂，清洁夹具底部表面残留的油漆。此过程可能需要多个棉签。
      注意：未蘸稀释剂的干棉签也可用于清洁夹具表面。
    22. 将前置放大器连接器对准引脚与通道位置，正确插入。确保连接器垂直竖立，并尽可能与夹具表面贴合（见图 3F）。
    23. 让夹具静置固化 24 小时。
    24. 沿前置放大器连接器与夹具接触的边缘涂抹紫外光固化牙科水泥，将连接器固定在夹具上。使用紫外灯照射 20 秒进行固化。

4. 光纤束封装

注意：执行此步骤大约需要 30 分钟。对于在具有较厚软脑膜层的动物模型中使用的电极，需完成此步骤。应加固光纤束以尽量减少弯曲。在小鼠操作中，此步骤可能并非必需。

  1. 使用水的表面张力将纤维束聚拢成单一束。将电极垂直固定在台钳上，用移液管从漏斗尖端向纤维束尖端滴加一滴水，使纤维束聚拢。
  2. 在漏斗尖端处的纤维束周围涂抹一层约1.5 mm厚的牙科水泥。用20秒的紫外光固化牙科水泥。
    注意：用于皮层记录时，无需进一步封装。若用于深部脑区，需在纤维束周围固定一个导管。
  3. 导管的制作及将纤维束插入导管
    1. 测量并截取所需长度的聚酰亚胺管，确保聚酰亚胺管长度使碳纤维尖端露出2 mm。再测量并截取一段比聚酰亚胺管短2 mm的30 G金属管。使用旋转工具去除金属管上的任何锋利边缘。将聚酰亚胺管插入金属管内。
    2. 将电极固定在台钳上，使碳纤维束朝上。将组装好的导管固定在显微操作器上，在显微镜下小心地将其套在纤维束上。使用额外一层牙科水泥将导管固定在已有的牙科水泥基座上。用20秒的紫外光固化牙科水泥。
      ​注意：此处可暂停制作流程。

5. 电极尖端制备

注意：每个芯片完成此步骤大约需要 30 分钟。

  1. 将电极剪切至所需长度。
    1. 为准备切割电极尖端，将便利贴叠成一个约1.5 mm高的平台。从平台边缘开始测量所需的电极长度，并标记该距离。该平台将作为切割的引导。
    2. 将电极缓慢放入盛有去离子水或蒸馏水的烧杯中，使漏斗状尖端首先完全浸入水中，并保持垂直于液面。将电极从水中取出，使单根碳纤维聚拢在一起。表面张力会使纤维束自然聚合。让电极在空气中干燥30分钟。
    3. 将#10手术刀片安装到刀柄上。将手术刀和电极放入-18 °C冰箱中冷冻至少5分钟。
    4. 将电极平放在引导平台表面（步骤5.1.1中制备），使纤维与平台表面齐平。使用滚动动作，用手术刀将纤维切割至所需长度。此步骤应迅速完成，以确保电极和手术刀仍处于冷冻状态（见图3G）。
  2. 注入正向电流以降低电极尖端的阻抗。
    1. 使用合适的适配器将电极连接至多电极阻抗测试仪（见材料表）。将电极尖端约2 mm浸入含有0.1 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）的微量离心管中。将接地导线插入微量离心管中。
    2. 以选定的幅度和持续时间注入电流。
      注：此步骤旨在降低CFEA尖端的阻抗值。在本研究中，电镀软件图形用户界面中输入以下参数：电流：0.100 µA；持续时间：10 s；暂停：1 s。可根据需要对每个通道重复此过程，直至电极阻抗达到目标值（见图4C）。
    3. 当阻抗值达到预期后，用去离子水或蒸馏水冲洗纤维以清洁表面。
  3. 在金电镀液中进行电镀。
    注：此步骤应在植入前短时间内完成（同一天）。
    警告：制备CFEA尖端所用的部分化学品具有腐蚀性，包括金电镀液。使用前请查阅安全数据表（SDS），并采取适当预防措施以确保安全操作。
    注：为增加纤维束的刚性，用户可通过将PEG8000溶于去离子水或蒸馏水中（浓度1 mg/mL）来配制电镀液。然后，取625 µL溶解的PEG8000与375 µL金电镀液混合，涡旋10秒以充分混匀。PEG8000将在纤维植入脑组织后溶解。
    1. 将电极束尖端约2 mm浸入含有电镀混合液的微量离心管中。将接地导线插入微量离心管中。
    2. 设置适当的电镀参数。在本研究中，电镀软件图形用户界面中输入以下参数：电流：-0.05 µA；持续时间：30 s；暂停：5 s。
    3. 用去离子水或蒸馏水彻底冲洗纤维。此时可根据需要再次测量阻抗值。

6. 脑内植入：小鼠（Mus musculus）的存活手术和雪貂（Mustela putorius furo）的非存活手术

注意：手术操作应遵循符合 IACUC 规定的标准流程。有关详细信息，请参见 Ma 等人22 的存活手术方案以及 Popovic 等人23 的非存活手术方案。对于啮齿类动物的存活手术，应遵循 ASC 指南中的无菌手术操作规范。这些规范包括将所有手术器械和材料在 135 °C 下高压灭菌 15 分钟，并使用 70% 乙醇处理立体定位仪及手术区域。手术过程中须佩戴无菌外科手套、一次性手术服和口罩。

  1. 生存手术，小鼠（Mus musculus）。
    1. 在诱导箱中使用2.5%异氟烷对小鼠进行麻醉，持续约1分钟，直至呼吸频率达到55-65次/分钟。随后通过鼻罩给予2.0%异氟烷以维持麻醉状态。在双眼涂抹兽用眼膏，防止角膜损伤。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否合适。
    2. 确认麻醉效果后，按照Ma等22所述的生存手术程序进行操作。监测呼吸频率，并维持在60次/分钟。使用温控加热垫将体温维持在37 °C。有关开颅、硬脑膜切开及电极植入前的颅骨准备步骤，请参见下文第6.3-6.5步。
    3. 手术完成后，将小鼠放回恢复笼中，笼内配备37 °C加热垫，并与其他动物隔离。
    4. 在手术伤口处涂抹抗生素软膏。持续监测动物状态，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位，并让其恢复2-5天。单独饲养，并持续观察感染或不适的迹象。在手术当天给予一次缓释型布托啡诺（72小时释放，0.5-1.0 mg/kg）作为镇痛剂。
  2. 非生存手术，雪貂（Mustela putorius furo）
    1. 首先通过肌肉注射给予氯胺酮（20 mg/kg）对雪貂进行初始麻醉，随后通过面罩通入1.0%-2.0%异氟烷与一氧化二氮和氧气按2:1比例混合的气体进行维持麻醉。通过脚趾夹捏测试确认麻醉深度是否合适。
    2. 确认麻醉效果后，按照Popovic等23所述的非生存手术程序进行操作。实施气管切开术，并使用1.0%-2.0%异氟烷与一氧化二氮和氧气按2:1比例混合的气体进行通气。在双眼涂抹兽用眼膏，防止角膜损伤。
    3. 使用温控加热垫将体温维持在37 °C。监测心率、呼气末CO2水平和呼吸频率。将呼吸频率保持在适当的生理范围内（3.5%-4.0%）。有关开颅、硬脑膜切开及电极植入前的颅骨准备步骤，请参见下文第6.3-6.5步。
    4. 持续监测动物的心电图（ECG），以确保麻醉充分；若ECG显示任何应激反应，应增加异氟烷浓度。
    5. 实验结束后，向雪貂注射1 mL戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液，并持续监测直至心率和呼气末CO2 测量值 为0。
  3. 颅骨准备
    1. 使用0.8 mm钻头，在预定植入位置钻取一个4 mm × 4 mm的开颅窗。对于小鼠，还需在对侧位置钻一个额外的孔，用于植入不锈钢接地螺钉。
      注意：在电极准备就绪前，不要进行硬脑膜切开。
    2. 建立接地/参考电极。在急性雪貂实验中，使用18号针头刺穿颅骨周围头部对侧的皮肤和肌肉层。将Ag/Cl参考电极的导线端插入针头尖端，然后将针头从肌肉/皮肤中抽出，使电极颗粒牢固地置于肌肉与颅骨之间。在小鼠中，将银质接地导线缠绕在不锈钢接地螺钉上，并用紫外光固化牙科水泥固定。
    3. 使用一小条标签胶带将电极固定在电极夹持器上，并将夹持器安装至显微操作器。通过鳄鱼夹将接地导线连接至接地源。将参考导线连接至嵌入动物肌肉中的参考电极。
  4. 硬脑膜切开与软脑膜穿刺
    1. 使用硬脑膜钩清除开颅窗区域的硬脑膜。
    2. 在软脑膜上制造一个小孔。可通过插入并撤出金属微电极实现（推荐用于雪貂）。或者，将CFEA垂直于脑表面下放，以避开任何血管结构。确定位置后，将电极抬起，用硬脑膜钩轻轻向上挑起脑表面，形成微小切口（推荐用于小鼠）。
  5. 电极植入
    1. 将电极尖端下放至同一位置，并以精细模式以约2 µm/s的速度驱动电极进入脑组织。使用显微镜观察，确保电极平稳进入且未发生弯曲。
      注意：若电极无法平稳进入，应将其从脑组织中提起并调整角度。若电极持续弯曲而无法顺利进入，应更换植入位置，并在新的入点处重复脑表面切口操作。
    2. 按照以下步骤进行慢性与急性电极植入。
      1. 慢性植入：使用紫外光固化牙科水泥将电极固定。
        1. 使用5-0外科缝线关闭切口，并制作头帽。
        2. 通过在植入部位周围添加更多牙科水泥来构建头帽结构。确保覆盖夹具的鼻部。
        3. 将皮肤向上拉并包裹头帽。使用5-0外科缝线在头帽后方缝合切口。
        4. 涂抹利多卡因乳膏和抗生素软膏。
        5. 停止麻醉，并遵循标准恢复程序。
      2. 急性植入：在将电极下放至目标深度后，至少等待30分钟再开始电生理记录，以使电极稳定就位。

结果

完成本方案后，即可实现稳定的单神经元放电活动记录。这些微电极阵列可根据研究人员的需求，在材料、通道数和前置放大器适配器方面进行定制。将纤维镀金可降低阻抗，使其适合记录使用（图4 和 图5）。若用户计划进行慢性记录，可在动物从手术中恢复后开始测量。已有研究表明，慢性记录可实现至少120天的稳定单神经元记录。一个代表性记录结果如 图6 所示，展示了自由活动的成年雄性小鼠后压部皮层中稳定的64通道电生理活动。若采用急性实验方案，则可在植入电极后不久（约30分钟）开始记录，以使电极在脑组织中充分稳定。图7 展示了从成年雌性雪貂初级视觉皮层获取的急性16通道CFEA记录的代表性示例。小鼠和雪貂的峰电位分选均使用峰电位分选软件完成（见材料表）。

漏斗连接器设计示意图，包含尺寸标注；包括横截面视图和带标签的组件。
图1：16通道和32通道碳纤维微电极阵列（CFEA）的结构示意图。（A）32通道（上）和16通道（下）CFEA的三种不同视角示意图。16通道CFEA具有用于操作的延长设计。32通道设计具有平坦端面，可将两个夹具组合形成64通道CFEA。两个示意图中均标有带尺寸的识别结构。连接器端指示连接器插入的位置，GND/REF通道指示接地导线插入的位置。漏斗基部指纤维穿过并被紫外光固化牙科水泥覆盖的位置，漏斗尖端指纤维从夹具中穿出的位置。漏斗尖端分为四个象限，以尽量减少纤维粘连并避免损伤。随后使用牙科水泥将纤维拉成单一束状。夹具采用SLA树脂3D打印机打印而成。示意图已放大以显示细节。（B）组装完成的CFEA。图中标注了可识别的结构。蓝色束状尖端代表碳纤维用于记录测量的区段。漏斗基部内部及连接器周围的灰色部分表示紫外光固化牙科水泥，用于固定漏斗基部中的碳纤维并将连接器固定在夹具上。紫色导线代表接地导线。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控通道设计示意图；用于流体分析的多层装置结构。
图 2：将原始碳纤维装入匣盒以进行聚对二甲苯 C 涂层。（A）将碳纤维装载到覆盖有两条双面胶带（蓝色）的筒夹上。每个匣盒装载约 25 根纤维。（B）将匣盒装入激光切割的支架（灰色）中，以准备进行聚对二甲苯 C 涂层。每个支架可容纳十个匣盒。请点击此处查看该图的放大版本。

光纤组件加工流程；分步示意图；切割、穿线、绝缘层去除、焊接。
图3：碳纤维微电极阵列（CFEA）束构建示意图。（A）将16根独立的涂覆碳纤维（黑色）穿入32通道3D打印夹具（灰色）中。（B）使用显微剪刀切割碳纤维尖端，保留与夹具基座高度相等的多余纤维，使其从基座端伸出。（C）用普通塑料打火机火花轮快速灼烧多余纤维部分，以去除聚对二氯苯（parylene C）绝缘层。右上角示意图显示了12根纤维中已有9根去除了聚对二氯苯涂层。（D）将纤维重新插入夹具，直至纤维末端与基座齐平。右上角示意图显示9根去除了绝缘层（灰色）的纤维尖端已插入夹具基座内部。随后将夹具翻转，重复步骤A-D，穿入另外16个通道。（E）向夹具内填充牙科水泥以固定纤维。将银浆注入夹具基座的每个孔中。（F）将公头连接器插入夹具基座。（G）将CFEA和手术刀置于-20 °C冰箱中冷冻。用电极阵列尖端切割至所需长度，得到32根长度一致的纤维。请点击此处查看该图的放大版本。

电极涂层过程示意图、SEM图像、阻抗数据图；电化学分析。
图4：尖端处理与电镀。（A）首先将电极尖端置于0.1 M PBS中，并对每个电极施加电流。随后将尖端冲洗并转移至镀金溶液中，在施加电流的条件下进行电镀。（B）制备好的碳纤维的扫描电镜（SEM）图像显示镀金溶液在尖端处富集。比例尺为4 µm。（C）168个通道在初始切割后（紫色；3.11 MΩ ± 0.42 MΩ，中位数 ± 标准误，n = 168根纤维）、正电流注入后（粉红色；1.23 MΩ ± 0.36 MΩ，中位数 ± 标准误，n = 168根纤维）以及电镀后（橙色；0.19 MΩ ± 0.15 MΩ，中位数 ± 标准误，n = 168根纤维）的阻抗值显示，每一步处理后阻抗均有所降低。请点击此处查看该图的放大版本。

用于材料科学分析的多孔结构的扫描电镜图像，显示微米级细节。
图 5：中等时长的金电镀在碳纤维束尖端形成小而圆润的沉积物。 图中所示的碳纤维尖端均来自不同的微电极阵列，反映了为降低阻抗或进行金镀层而施加不同持续时间电流的情况。图像还显示了聚对二甲苯C涂层，该涂层可绝缘碳纤维，防止除纤维尖端以外的区域获取信号。(A) 使用剃刀进行一次切割并冷冻后的碳纤维尖端的扫描电子显微镜图像。比例尺为 10 µm。(B) 与 A 相同，但随后注入正电流 10 秒。(C) 与 B 相同，但随后进行 5 秒金电镀。(D) 与 B 相同，但随后进行 15 秒金电镀。(E) 与 B 相同，但随后进行 30 秒金电镀。(F) 与 B 相同，但随后进行 120 秒金电镀。我们发现，在 -0.05 µA 电流下电镀 30 秒最有利于电生理记录。 请点击此处查看该图的放大版本。

来自植入电极的大鼠神经信号记录图和柱状图；电生理学分析。
图 6：使用碳纤维微电极阵列在自由活动小鼠的压后皮层中进行的长期细胞外记录显示出持续且稳定的神经活动。（A）同时记录了 11 条带通滤波的电压信号。后续记录的第一通道信号（第一行）在 B 中展示，以显示其随时间的耐用性。其余十行展示了记录质量的一致性，并显示阵列中存在强烈的神经活动。每条轨迹左侧的比例尺代表 200 µV 的电位。（B）来自与 A 图顶部通道相同纤维的带通滤波数据，扩展后显示在连续 120 天记录期间保持强烈的神经活动。（C）聚类分析显示在数月内均能稳定检测到单个神经元单位。轨迹表示在 120 天内持续可观察的代表性单个神经元单位的平均波形，这些波形从 B 图所示纤维在各个时间点提取。（D）将 C 图中的平均、未归一化的峰电位波形叠加，以展示其随时间的一致性。（E）碳纤维记录显示在数月内噪声基线保持稳定。B 图中噪声基线（去除峰电位活动后的信号）的标准差未显示噪声的渐进性变化。柱状图表示平均污染水平，误差线表示标准差。（F）植入碳纤维电极阵列（CFEA）和前置放大器的实验小鼠的按比例绘制示意图。（G）植入 11 个月后记录的原始电压信号（上图）显示出强烈的局部场电位（LFP）。带通滤波后的电压信号（下图）显示稳定的神经活动。（H）在 C 图纤维上记录的神经元的平均峰电位波形，叠加了前 1,000 次峰电位事件的波形。请点击此处查看该图的放大版本。

神经信号分析；波形图；电生理数据；多单位比较；频率响应。
图7：雪貂初级视皮层的碳纤维微电极阵列（CFEA）记录。（A）来自16通道CFEA记录的经峰电位分选的单个神经元波形。单个神经元的动作电位通常在多个通道上以略微不同的幅度显现。（B）所选神经元的方向调谐曲线。颜色对应于A中的记录单元。箭头表示刺激运动的方向。标尺表示反应速率。误差线表示平均反应及其标准误。水平虚线表示在呈现空白屏幕期间同一细胞的自发放电率。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了构建可用于急性与慢性实验的功能性CFEA所需的各个步骤。所述过程可根据研究人员的具体需求进行定制，使其成为一种经济且易于实现的长期单神经元监测方案。该方案证实了此类CFEA在麻醉动物中植入数分钟内即可记录到稳定的单单位神经活动，并可在清醒、自由活动的动物中持续记录长达四个月，展示了CFEA在研究神经反应短期与长期变化方面的潜力。

所述实验方案的各个步骤经过长期充分测试和优化，形成了一种高效、快速完成的操作流程，边际成本较低（<100.00美元），并具备在数月内稳定、密集地记录清晰单细胞信号的能力。构建过程可在一天内完成，所获得的电生理信号质量可与任何主流商用阵列相媲美。此外，CFEA的体积更小（16通道纤维束直径约为26 µm），相较于类似的商用阵列具有更小的占位空间，且其良好的生物相容性使其适用于长期植入13。需要特别强调的是，为制备出性能相当的功能性CFEA，必须严格遵循若干关键步骤和操作说明。

由于碳纤维非常脆弱，必须极其小心地操作。使用尖头镊子或其他工具操作时，可能导致纤维断裂。此外，应在空气流动有限的空间内制备碳纤维电极阵列（CFEA），以防止纤维被吹走。在对纤维后端进行火焰处理时，只需将打火机短暂地前后移动约1秒即可。在完成绝缘层去除后的步骤对于构建具有可用通道的电极至关重要。火焰处理后的纤维尖端应直接送入夹具中，避免任何额外接触。随后，在向漏斗状基底填充牙科水泥时，应仔细操作，确保水泥完全填充各个通道和基底凹槽，封闭开口但不填满整个通道。填充后，必须使用紫外光彻底固化牙科水泥，方可进行后续步骤。完成固化后，应向每个通道注入银漆，直至完全填满但不溢出。这是整个过程中变异性最大的步骤。过度填充可能导致通道间串扰，而填充不足则可能导致连接失败。若使用25 G针头无法顺利注入银漆，可能是因为溶液过于黏稠，此时可加入少量稀释剂以获得更易流动的溶液。当所有通道均被填满且插入头端连接器后，必须在用牙科水泥固定连接器之前，让阵列静置固化24小时。我们发现，若未执行此步骤，会导致有效连接的通道数量减少。同时，应使用足量的牙科水泥，以确保在与信号采集系统连接时连接器不会脱落。一旦发生脱落，可尝试通过重复向通道注入银漆进行重新连接，但用户应检测CFEA的阻抗值，以评估有效连接的通道数量。让牙科水泥过夜固化也有助于防止潜在的连接脱落问题。

测量电极的阻抗可准确估计已连接的通道数量。该操作可在将接地线、参考电极线以及碳纤维尖端浸入PBS溶液后进行。我们观察到，高阻抗（>15 MΩ）表明通道处于断开或未连接状态。在注入电流并进行电镀之前，已连接通道的阻抗值可能处于一定范围内，而该值在此过程中应显著降低。每根16通道电极上平均连接通道数（电流注入后阻抗<4 MΩ）为12.96 ± 2.74（均值 ± 标准差；N = 48根电极）。我们测试了多种电镀时间，发现30秒可使记录位点之间的信号隔离效果最佳（图5）。尽管已有充分研究证实PEDOT-pTS12,24,25,26 和PEDOT-TFB21是制备碳纤维记录位点的可靠选择，但我们发现采用金进行镀膜——一种已被证实且可靠的慢性植入电极电镀方法27,28——可提高植入的便利性，并防止电极尖端粘连。该方法最终实现的平均阻抗值低于0.2 MΩ，其性能可与使用PEDOT-TFB21和PEDOT-pTS26所达到的数值相媲美。

植入微电极阵列时，必须在显微镜下直观地观察碳纤维尖端的插入过程。成功的插入应清晰可见，纤维无弯曲现象。如果纤维出现屈曲，通常难以顺利进入脑组织。此时，应调整探针角度后再次尝试。该过程可重复进行，直至探针成功植入。当电极到达目标深度后，我们发现至少等待30分钟，有助于探针稳定，从而获得最佳的信号采集效果（急性记录）。

本文所述的碳纤维电极阵列（CFEAs）除了具有体积小和生物相容性好的优点外，还因其制备简便、成本低廉，成为商用阵列的一种坚固且可定制的替代方案。本方案中详述的CFEAs最主要的局限性在于其可扩展性。由于其制备过程依赖手工操作，因此扩大至包含数百个记录位点的设计可能并不现实。此外，基于纳米技术的微电极阵列制造技术的进步，将能够实现比本文所述方法更大规模的神经元群体记录。然而，本方案使希望在实验台上自行制备碳纤维电极的研究实验室能够便捷地获得CFEAs。在长达120天的慢性实验过程中，我们未观察到锋电位幅度出现稳定性下降或稳健性降低的现象，这一结果由代表性单通道记录所证实，该记录典型地反映了我们在该时间尺度上的观察结果（图6A-E）。此外，CFEAs表现出持续记录单个神经元活动的能力，在小鼠体内植入11个月后，仍可清晰分辨出四个单神经元单位（图6G,H）。同时，也可在急性记录中获得稳定的单神经元单位信号（图7），这使其在短期研究单个神经元活动方面优于许多其他商用电极。未来，开发此类柔性、生物相容且直径极小的探针将有助于研究复杂的神经过程。这些工具将在推动神经技术发展方面发挥重要作用，包括在需要连续且长期稳定性的脑机接口（BMIs）中的应用29。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢Greg Guitchounts在电极设计与构建方面提供的指导，感谢Tim Gardner向我们开放其实验室和设施。我们感谢Christos Michas在生物界面与技术核心设施中使用PDS时提供的协助，以及Neil Ritter、Jon Spyreas和David Landesman在设计早期16通道夹具版本过程中给予的帮助。我们感谢Tim Cavanaugh在哈佛大学纳米系统中心协助完成扫描电子显微镜成像工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#10 手术刀片Fisher Scientific14-840-15制作工具
16通道CFEA夹具Realize Inc.CFMA组件
16通道Omnetics连接器OmneticsA79014-001CFMA组件
25 G针头Fisher Scientific14-840-84制作工具 - 尖头型
30 G针头Fisher Scientific14-841-03制作工具
31 G不锈钢304皮下注射圆形管Small Parts IncB000FMYN38用于导管
32通道CFEA夹具Realize Inc.CFMA组件
32通道Omnetics连接器OmneticsA79022-001CFMA组件
6英寸棉签Fisher Scientific22-363-156制作工具
丙酮Fisher ScientificA16P4制作工具
AutoCad 3D打印软件Autodesk计算机辅助设计工具 / 3D建模软件
Autodesk Fusion 360Autodesk计算机辅助设计工具 / 3D建模软件
BD一次性注射器Fisher Scientific14-823-301 mL
碳纤维Good Fellow USAC 0057257 μm环氧涂层
包埋盒及包埋盒架用于纤维涂层
透明胶带Scotch用于未处理纤维的涂层
去离子水电镀组件
双面胶带Scotch用于未处理纤维的涂层
可流动牙科复合材料PentronFlow-It ALCCFMA组件 / 紫外光固化牙科水泥
镀金溶液Sifco ASC535510.0–20.0%甘油，1.0–5.0%乙二胺，1.0–5.0%乙酸（乙二胺四乙酸）二钾盐，5.0–10.0%丁酸，巯基单金(1+)钠盐，1.0–5.0%偏亚硫酸氢钾，55.0–82.0%水
珠宝夹钳AmazonB00GRABH9K制作工具
JRClust雪貂神经元峰电位分选软件
打火机BICLCP62DC制作工具
显微操作器ScientificaPS-7000C用于导管
显微剪刀Fisher Scientific08-953-1B制作工具
MountainSort小鼠神经元峰电位分选软件
NanoZ 16通道适配器Multi-channel systemsADPT-nanoZ-NN-16电镀组件
NanoZ 32通道适配器White MatterNZA-OMN-32 rev A电镀组件
NanoZ多电极阻抗测试仪White Matter电镀组件
Parafilm封口膜Fisher Stockroom13-374-10半透明、柔韧且具有粘性的薄膜
聚对二甲苯'C'二聚体Specialty Coating Systems980130-C-01LBE用于未处理纤维的涂层
聚乙二醇8000Fisher Scientific25322-68-3电镀组件
磷酸盐缓冲液电镀组件
聚酰亚胺管MicroLumenBRAUNI001用于导管
旋转工具Dremel300124用于导管
手术刀柄Fine Science Tools10003-12制作工具
导电银涂层MG Chemicals842AR Super ShieldCFMA组件
放大倍数范围为6.7:1的体视显微镜MoticSMZ-168制作工具
便利贴Post-it制作工具
擦拭纸巾Kimtech Science34155制作工具
钨丝A-M Systems797550CFMA组件
紫外光固化棒Woodpecker制作工具
真空沉积室Specialty Coating SystemsLabcoter 2 (PDS 2010)

参考文献

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用于急性和慢性在体记录的碳纤维微电极阵列的构建与实施
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