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方法文章

用于研究癌细胞肺转移的永久性窗口

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DOI：

10.3791/62761

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2021年7月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Integrated Imaging Program, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Cente, 5Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。

摘要

转移是导致约90%癌症相关死亡的原因，其过程涉及癌细胞从原发肿瘤系统性扩散至骨、脑和肺等继发部位。尽管该过程已被广泛研究，但其分子机制仍不甚清楚。虽然常用的成像手段（包括计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI））能够提供不同程度的宏观可视化效果，但均缺乏检测单个肿瘤细胞动态行为所需的时间和空间分辨率。为解决这一问题，已有多种技术被用于常见转移部位的活体成像。在这些部位中，肺因其结构脆弱且在维持生命中起关键作用，成为活体成像最难触及的器官之一。尽管此前已有若干方法实现完整肺组织的单细胞活体成像，但均涉及高度侵入性和终末性操作，限制了成像时间最长仅为6至12小时。本文介绍一种改进的技术，用于永久植入一种微创胸腔光学窗口，以实现肺部高分辨率成像（WHRIL）。结合改进的微尺度图谱绘制方法，这一创新性光学窗口可在多个成像时段内，实现对完整肺组织长达数周的连续单细胞分辨率活体成像。由于成像数据采集时间前所未有地延长，WHRIL有望加速揭示肺转移进展及其他多种肺内生物学过程的动态机制。

引言

负责约90%的死亡病例，转移是癌症相关死亡的主要原因1. 在临床观察到的主要转移部位（骨、肝、肺、脑）中2，肺部一直被证明是特别具有挑战性的 体内 通过活体显微成像技术进行成像存在困难，这是因为肺是一个处于持续运动中的 delicate 器官。肺部的连续运动，加之胸腔内心脏运动的叠加，构成了高精度成像的重大障碍。因此，由于肺部相对难以通过高分辨率活体光学成像手段进行观察，肺内肿瘤的生长过程常常被视为一种隐匿性过程3.

在临床环境中，成像技术（如计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI））能够对肺等完整重要器官内部进行可视化观察4。然而，尽管这些成像方式可提供器官整体结构的优良图像（通常甚至能在临床症状出现之前揭示病理变化），但其分辨率不足以检测在转移早期阶段扩散的单个肿瘤细胞。因此，当上述成像手段能够提示肺部发生转移时，转移灶通常已经形成并处于增殖状态。由于肿瘤微环境在癌症进展和转移灶形成过程中发挥着关键作用5,6，人们对在活体（in vivo）条件下研究转移定植的最初阶段极为关注。这种研究兴趣还因以下两点而进一步增强：一是人们日益认识到癌细胞在原发性肿瘤被发现之前就已开始扩散7,8；二是越来越多的证据表明，这些细胞以单细胞形式长期处于休眠状态，可在体内存活数年甚至数十年，之后才发展为肉眼可见的转移灶9。

以往对肺部进行单细胞分辨率成像时，必须采用离体（ex vivo）或组织外植的制备方法10,11,12,13，这限制了分析仅能获取单一时间点的数据。尽管这些制备方法确实能提供有用的信息，但无法揭示肿瘤细胞在与完整循环系统相连的器官内的动态行为。

成像技术的最新进展使得在长达12小时的时间内以单细胞分辨率对完整肺组织进行活体可视化成为可能14,15,16。这一成果是在小鼠模型中实现的，所采用的方案包括机械通气、胸廓切除以及真空辅助的肺固定。然而，尽管该技术首次实现了对生理状态下完整肺组织的单细胞分辨率成像，但其具有高度侵入性且为终末性操作，因而无法在初次手术后进行进一步的成像观察。因此，这一局限性阻碍了该技术在研究持续时间超过12小时的转移过程（如肿瘤细胞休眠及重新启动生长）中的应用14,15,16。此外，由于真空诱导的压力梯度可能改变血流分布，因此对此成像方法所观察到的细胞行为模式需谨慎解读。

为了克服这些局限性，近期开发了一种用于肺部高分辨率成像的微创窗口（WHRIL），可在数天至数周的较长时间内实现连续成像，且无需机械通气17。该技术通过构建一个具有密闭胸腔的“透明肋骨框架”，以维持肺部正常功能。该操作耐受性良好，小鼠可在术后恢复，其基础活动和生理功能无明显改变。为了在每次成像过程中可靠地定位完全相同的肺部区域，研究人员将一种称为微定位图谱（microcartography）的技术应用于该窗口18。通过该窗口，能够捕捉到细胞到达肺血管床、穿越内皮层、进行细胞分裂并最终生长形成微转移灶的全过程图像。

本研究详细介绍了一种改进的WHRIL植入手术方案，该方案在简化手术操作的同时，提高了实验的可重复性和质量。尽管该方案最初设计用于研究转移过程中涉及的动态机制，但也可应用于肺部生物学和病理学多种过程的探究。

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方案

本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 窗口钝化

  1. 用1%（w/v）的酶活性洗涤剂溶液冲洗光学窗口框架（补充图2）。
  2. 在玻璃瓶内，将光学窗口框架浸入5%（w/v）氢氧化钠溶液中，在70 °C下处理30分钟。
  3. 取出并用去离子水清洗窗口框架。
  4. 在新的玻璃瓶内，将光学窗口框架浸入7%（w/v）柠檬酸溶液中，在55 °C下处理10分钟。
  5. 再次取出并用去离子水清洗窗口框架。
  6. 重复步骤1.2；然后取出并用去离子水清洗窗口框架。

2. 手术准备

  1. 在通风橱或层流柜中进行手术。为避免手术区域受到污染，应分别设置独立且分隔的准备区、手术区和恢复区。
  2. 手术前，将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。若计划进行后续操作，可使用热珠灭菌器对器械重新灭菌。本手术操作采用仅使用尖端（tips-only）的技术。  
  3. 打开加热手术珠和热珠灭菌器的电源。
  4. 在麻醉舱中使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉。
  5. 为去除毛发，将脱毛膏充分涂抹于左上胸部切口部位。不超过20秒后，用湿润的纸巾用力擦去毛发和脱毛膏。必要时重复操作，直至彻底清除手术部位的所有毛发。
  6. 使用2-0丝线缝合线，在22 G导管末端打结，留出2英寸长的线尾（见图1A）。

3. 肺窗手术

  1. 使用抗菌肥皂洗手。
  2. 每次新手术前，更换新的无菌手套。
  3. 为防止小鼠角膜干燥和眼睛损伤，将眼用软膏涂抹于双眼。
  4. 将10 µL（0.1 mg/kg）的丁丙诺啡与90 µL无菌PBS混合稀释，然后皮下注射，以确保术前镇痛。
  5. 用丝线绑扎的22 G导管对小鼠进行插管15使用气囊导管，通过挤压气囊并观察双侧胸部是否同步隆起，以确认插管成功。
  6. 用2-0丝线在小鼠吻部绑扎固定插管导管（参见 图1B).
  7. 将小鼠置于加热的手术台上，使其呈右侧卧位，以暴露左侧胸腔。
  8. 将呼吸机连接至气管插管导管。
  9. 确保呼吸机提供可控且稳定的通气，随后将异氟烷浓度降至3%。在手术开始时以及手术过程中定期通过脚趾夹捏试验评估麻醉深度。
  10. 用纸胶带将小鼠的前肢向头侧、后肢向尾侧固定在加热的手术台上。再用一条胶带沿小鼠背部纵向贴附，以充分暴露手术区域（参见 图1C).
  11. 在生物安全柜内打开所有外科器械，以保持无菌状态。
  12. 通过大量涂抹消毒剂对小鼠皮肤手术部位进行消毒。
  13. 使用镊子提起皮肤，在胸骨左侧约 7 mm、肋缘下约 7 mm 处做一个直径约 10 mm 的环形切口（图1D).
  14. 仔细辨认任何主要血管。若需切断血管，应使用电凝笔在血管两端进行电凝止血。
  15. 切除覆盖在肋骨上的软组织。
  16. 提升 6th 或 7th 用镊子夹住肋骨。使用钝头显微解剖剪的一侧刀片，将圆头一侧朝向肺部，小心刺穿第6肋间肌。th 和 7th 肋骨以进入胸腔空间（图1E).
  17. 使用压缩空气罐对缺损处进行轻柔排气，使肺组织塌陷并与胸壁分离。以短促脉冲方式喷射压缩空气，以防止医源性肺损伤。
  18. 将活检打孔器置于切割工具上方（补充图1）并小心地将切割工具的底座穿过肋间切口（图1F).
  19. 将切割工具的底部与胸壁平行放置。通过肋骨框架打一个5 mm的圆形孔图1G).
    注意：确保暴露的肺组织呈粉红色，无损伤迹象。
  20. 使用5-0丝线，在距离孔洞约1 mm处围绕其周围做一荷包缝合，缝合时与肋骨交叉穿插图1H).
  21. 将窗框放置到位，使圆形缺损的边缘与窗框的凹槽对齐（参见 图1I).
  22. 用5-0丝线紧密结扎，牢固固定植入的窗口。
  23. 将100 µL的氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂装入1 mL注射器中。
  24. 用压缩空气以稳定而轻柔的气流吹干肺组织，持续约10–20秒（图1J).
  25. 用镊子夹住窗框的外缘，轻轻提起，以确保肺组织与窗框底面分离。
  26. 沿光学窗口框架的底面均匀涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂图1K).
  27. 增加呼吸机的呼气末正压（PEEP）以扩张肺部。
  28. 保持10-20秒，施加轻柔但稳固的压力，将光学窗框固定在肺组织上（图1L).
  29. 在矩形盖玻片上滴加一滴5 mm的剩余氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂。
  30. 使用真空镊子夹取5 mm盖玻片。将盖玻片底面浸入粘合剂中，然后在矩形盖玻片侧边反复刮擦三次以去除多余粘合剂，仅保留极薄一层（图1M).
  31. 将盖玻片小心地置于光学窗口框架中央凹槽内，并使其倾斜悬于肺组织上方。短暂夹闭呼吸机以产生正压，使肺过度膨胀。通过旋转动作，将盖玻片调整至与肺组织平行，使肺表面与盖玻片底面直接贴合。保持轻柔压力，使氰基丙烯酸酯粘合剂固化（约25秒）。
  32. 使用镊子将盖玻片从真空拾取头分离图1N).
  33. 使用5-0丝线缝合，再次制作荷包缝合，这一次 <从皮肤切口边缘向周围延伸1 mm。在用锁结扎紧之前，将多余的皮肤塞入窗框外缘下方。
  34. 为确保盖玻片与窗框之间的气密性密封，需在金属-玻璃界面处滴加少量液态氰基丙烯酸酯（参见 图1O).
  35. 将无菌针头连接至1 mL胰岛素注射器。将针头插入剑突下方，朝向左肩方向推进，穿过膈肌进入胸腔。轻柔回抽注射器，以清除胸腔内任何残留的空气（参见 图1P).
  36. 移除小鼠身上的胶带。
  37. 关闭异氟烷。
  38. 继续用100%氧气通气，直至小鼠表现出即将苏醒的迹象。
  39. 小心剪断小鼠吻部周围的2-0丝线缝合线，并拔除气管插管。
  40. 将小鼠转移至清洁的笼子中，并监测直至完全恢复。若出现呼吸困难症状，实施安乐死。
  41. 通过皮下注射将10 µL（0.1 mg/kg）丁丙诺啡溶于90 µL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中，以提供术后镇痛。

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结果

本方案所述手术步骤已总结并配图说明 图1简而言之，手术前，小鼠接受麻醉，并去除左侧胸壁的毛发。小鼠经气管插管并进行机械通气，以确保在打开胸腔后维持存活。切除覆盖肋骨的软组织，于第6肋骨区域制造一个小型圆形缺损，跨越该肋骨。th 和 7th 肋骨。将光学窗口框架插入缺损处，并将其底面（通光孔径外侧）粘附于肺组织。随后使用缝线和粘合剂固定窗口框架，重新封闭胸腔，使小鼠在拔管后能够恢复正常呼吸。成功植入后，肺组织将与光学窗口（作为胸壁的一部分）紧密贴合，胸腔内压力梯度得以维持。这使得小鼠能够舒适存活，允许根据实验方案进行每日成像（最长可达2周）。随后可通过该窗口进行活体成像，方法与此前报道的其他窗口类似。15,19,20.

为了可视化多种细胞类型、生物结构或细胞功能状态，本实验方案可应用于多种小鼠，这...

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讨论

在肺等远端转移部位，高分辨率光学成像可揭示肿瘤细胞转移的复杂动态过程。通过实现 体内 单个癌细胞及其与宿主组织相互作用的可视化研究中，高分辨率活体成像技术已被证实对于理解转移机制具有重要作用。

本文介绍了一种改进的外科手术方案，用于永久性胸腔植入一种光学窗口，旨在通过高分辨率多光子显微镜对小鼠肺部进行连续成像。采用该方案构建的光学窗口具有良好的生物耐受性，且因其能够有效重新封闭胸腔，可维持自发呼吸所必需的胸腔内压力梯度（与此前报道的所有其他用于小鼠肺部成像的窗口不同14,15,16,36,37）。这使得小鼠可在麻醉后苏醒，自主呼吸，并在透明肋骨窗存在的情况下舒适存活数周之久。

利用该窗口...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作获得了以下资助：CA216248、CA013330、蒙特菲奥里医学中心露丝·L·柯施坦因T32培训基金CA200561、METAvivor早期职业奖、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合成像项目，以及简·A·和迈尔斯·P·登普西的资助。我们感谢爱因斯坦医学院分析影像中心（AIF）在成像方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% (w/v) 酶活性清洁剂溶液Alconox IncN/A 浓缩型阴离子清洁剂，含蛋白酶，适用于手工和超声波清洗
2 µm 荧光微球InvitrogenF8827
5 mm 盖玻片Electron Microscopy Sciences72296-05
5% (w/v) 氢氧化钠溶液Sigma-AldrichS8045
5% 异氟烷Henry Schein, Inc29405
5-0 编织丝线，带 RB-1 切割针Ethicon, Inc.774B
7% (w/v) 柠檬酸溶液Sigma-Aldrich251275
8 mm 不锈钢窗框N/AN/A定制，补充图2
9 cm 2-0 丝线结扎线Ethicon, Inc.LA55G
5 mm 一次性活检打孔器Integra 33-35-SH
钝头显微解剖剪RobozRS-5980
黄铜窗工具支架N/AN/A定制，补充图3
丁丙诺啡Hospira0409-2012-32
电凝笔Braintree ScientificGEM 5917
葡萄糖酸氯己定 Becton, Dickinson and Company260100ChloraPrep 单根棉签，1.75 mL
压缩空气罐FalconDPSJB-12
氰基丙烯酸酯粘合剂Henkel AdhesivesLOC1363589
光纤照明器O.C. White CompanyFL3000
微珠灭菌器CellPoint ScientificGER 5287-120VGerminator 500
Graefe 镊子RobozRS-5135
红外加热灯Braintree ScientificHL-1
胰岛素注射器Becton Dickinson329424
异氟烷蒸发器SurgiVetVCT302
Jacobson 持针器（带锁）Kalson SurgicalT1-140
长棉签涂抹棒Medline IndustriesMDS202055
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
新霉素/多粘菌素B/杆菌肽Johnson & Johnson501373005抗生素软膏
眼科软膏Dechra Veterinary Products17033-211-38
纸质胶带Fisher ScientificS68702
小鼠呼吸机Kent ScientificPS-02PhysioSuite
矩形盖玻片Corning2980-225
啮齿类动物插管支架Braintree ScientificRIS 100
小动物肺膨胀球囊Harvard Apparatus72-9083
不锈钢切割工具N/AN/A定制，补充图1
磺胺甲噁唑和甲氧苄啶口服抗生素Hi-Tech Pharmacal Co.50383-823-16
带加热功能的小动物多功能手术平台Kent ScientificSURGI-M02加热手术平台
气管导管Exelint International2674622 G 导管
真空拾取系统金属探针Ted Pella, Inc.528-112

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