本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。
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摘要
摘要
转移是导致约90%癌症相关死亡的原因，其过程涉及癌细胞从原发肿瘤系统性扩散至骨、脑和肺等继发部位。尽管该过程已被广泛研究，但其分子机制仍不甚清楚。虽然常用的成像手段（包括计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI））能够提供不同程度的宏观可视化效果，但均缺乏检测单个肿瘤细胞动态行为所需的时间和空间分辨率。为解决这一问题，已有多种技术被用于常见转移部位的活体成像。在这些部位中，肺因其结构脆弱且在维持生命中起关键作用，成为活体成像最难触及的器官之一。尽管此前已有若干方法实现完整肺组织的单细胞活体成像，但均涉及高度侵入性和终末性操作，限制了成像时间最长仅为6至12小时。本文介绍一种改进的技术，用于永久植入一种微创胸腔光学窗口，以实现肺部高分辨率成像（WHRIL）。结合改进的微尺度图谱绘制方法，这一创新性光学窗口可在多个成像时段内，实现对完整肺组织长达数周的连续单细胞分辨率活体成像。由于成像数据采集时间前所未有地延长，WHRIL有望加速揭示肺转移进展及其他多种肺内生物学过程的动态机制。
引言
负责约90%的死亡病例，转移是癌症相关死亡的主要原因1. 在临床观察到的主要转移部位（骨、肝、肺、脑）中2，肺部一直被证明是特别具有挑战性的 体内 通过活体显微成像技术进行成像存在困难，这是因为肺是一个处于持续运动中的 delicate 器官。肺部的连续运动，加之胸腔内心脏运动的叠加，构成了高精度成像的重大障碍。因此，由于肺部相对难以通过高分辨率活体光学成像手段进行观察，肺内肿瘤的生长过程常常被视为一种隐匿性过程3.
在临床环境中，成像技术（如计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI））能够对肺等完整重要器官内部进行可视化观察4。然而，尽管这些成像方式可提供器官整体结构的优良图像（通常甚至能在临床症状出现之前揭示病理变化），但其分辨率不足以检测在转移早期阶段扩散的单个肿瘤细胞。因此，当上述成像手段能够提示肺部发生转移时，转移灶通常已经形成并处于增殖状态。由于肿瘤微环境在癌症进展和转移灶形成过程中发挥着关键作用5,6，人们对在活体（in vivo）条件下研究转移定植的最初阶段极为关注。这种研究兴趣....
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方案
本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 窗口钝化
- 用1%（w/v）的酶活性洗涤剂溶液冲洗光学窗口框架（补充图2）。
- 在玻璃瓶内，将光学窗口框架浸入5%（w/v）氢氧化钠溶液中，在70 °C下处理30分钟。
- 取出并用去离子水清洗窗口框架。
- 在新的玻璃瓶内，将光学窗口框架浸入7%（w/v）柠檬酸溶液中，在55 °C下处理10分钟。
- 再次取出并用去离子水清洗窗口框架。
- 重复步骤1.2；然后取出并用去离子水清洗窗口框架。
2. 手术准备
- 在通风橱或层流柜中进行手术。为避免手术区域受到污染，应分别设置独立且分隔的准备区、手术区和恢复区。
- 手术前，将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。若计划进行后续操作，可使用热珠灭菌器对器械重新灭菌。本手术操作采用仅使用尖端（tips-only）的技术。
- 打开加热手术珠和热珠灭菌器的电源。
- 在麻醉舱中使用5%异氟烷对小鼠进行麻醉。
- 为去除毛发，将脱毛膏充分涂抹于左上胸部切口部位。不超过20秒后，用湿润的纸巾用力擦去....
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结果
本方案所述手术步骤已总结并配图说明 图1简而言之，手术前，小鼠接受麻醉，并去除左侧胸壁的毛发。小鼠经气管插管并进行机械通气，以确保在打开胸腔后维持存活。切除覆盖肋骨的软组织，于第6肋骨区域制造一个小型圆形缺损，跨越该肋骨。th 和 7th 肋骨。将光学窗口框架插入缺损处，并将其底面（通光孔径外侧）粘附于肺组织。随后使用缝线和粘合剂固定窗口框架，重新封闭胸腔，使小鼠在拔管后能够恢复正常呼吸。成功植入后，肺组织将与光学窗口（作为胸壁的一部分）紧密贴合，胸腔内压力梯度得以维持。这使得小鼠能够舒适存活，允许根据实验方案进行每日成像（最长可达2周）。随后可通过该窗口进行活体成像，方法与此前报道的其他窗口类似。15,19,20.
为了可视化多种细胞类型、生物结构或细胞功能状态，本实验方案可应用于多种小鼠，这.......
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讨论
在肺等远端转移部位，高分辨率光学成像可揭示肿瘤细胞转移的复杂动态过程。通过实现 体内 单个癌细胞及其与宿主组织相互作用的可视化研究中，高分辨率活体成像技术已被证实对于理解转移机制具有重要作用。
本文介绍了一种改进的外科手术方案，用于永久性胸腔植入一种光学窗口，旨在通过高分辨率多光子显微镜对小鼠肺部进行连续成像。采用该方案构建的光学窗口具有良好的生物耐受性，且因其能够有效重新封闭胸腔，可维持自发呼吸所必需的胸腔内压力梯度（与此前报道的所有其他用于小鼠肺部成像的窗口不同14,15,16,36,37）。这使得小鼠可在麻醉后苏醒，自主呼吸，并在透明肋骨窗存在的情况下舒适存活数周之久。
利用该窗口.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了以下资助：CA216248、CA013330、蒙特菲奥里医学中心露丝·L·柯施坦因T32培训基金CA200561、METAvivor早期职业奖、格鲁斯-利珀生物光子学中心及其综合成像项目，以及简·A·和迈尔斯·P·登普西的资助。我们感谢爱因斯坦医学院分析影像中心（AIF）在成像方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1% (w/v) 酶活性清洁剂溶液 | Alconox Inc | N/A | 浓缩型阴离子清洁剂，含蛋白酶，适用于手工和超声波清洗 |
| 2 µm 荧光微球 | Invitrogen | F8827 | |
| 5 mm 盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5% (w/v) 氢氧化钠溶液 | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% 异氟烷 | Henry Schein, Inc | 29405 | |
| 5-0 编织丝线，带 RB-1 切割针 | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 7% (w/v) 柠檬酸溶液 | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| 8 mm 不锈钢窗框 | N/A | N/A | 定制，补充图2 |
| 9 cm 2-0 丝线结扎线 | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 mm 一次性活检打孔器 | Integra | 33-35-SH | |
| 钝头显微解剖剪 | Roboz | RS-5980 | |
| 黄铜窗工具支架 | N/A | N/A | 定制，补充图3 |
| 丁丙诺啡 | Hospira | 0409-2012-32 | |
| 电凝笔 | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| 葡萄糖酸氯己定 | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep 单根棉签，1.75 mL |
| 压缩空气罐 | Falcon | DPSJB-12 | |
| 氰基丙烯酸酯粘合剂 | Henkel Adhesives | LOC1363589 | |
| 光纤照明器 | O.C. White Company | FL3000 | |
| 微珠灭菌器 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Germinator 500 |
| Graefe 镊子 | Roboz | RS-5135 | |
| 红外加热灯 | Braintree Scientific | HL-1 | |
| 胰岛素注射器 | Becton Dickinson | 329424 | |
| 异氟烷蒸发器 | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson 持针器（带锁） | Kalson Surgical | T1-140 | |
| 长棉签涂抹棒 | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| 新霉素/多粘菌素B/杆菌肽 | Johnson & Johnson | 501373005 | 抗生素软膏 |
| 眼科软膏 | Dechra Veterinary Products | 17033-211-38 | |
| 纸质胶带 | Fisher Scientific | S68702 | |
| 小鼠呼吸机 | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| 矩形盖玻片 | Corning | 2980-225 | |
| 啮齿类动物插管支架 | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| 小动物肺膨胀球囊 | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| 不锈钢切割工具 | N/A | N/A | 定制，补充图1 |
| 磺胺甲噁唑和甲氧苄啶口服抗生素 | Hi-Tech Pharmacal Co. | 50383-823-16 | |
| 带加热功能的小动物多功能手术平台 | Kent Scientific | SURGI-M02 | 加热手术平台 |
| 气管导管 | Exelint International | 26746 | 22 G 导管 |
| 真空拾取系统金属探针 | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
参考文献
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., ....
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重印与许可
