对现有的多电极阵列或膜片钳设备进行改造可实现 离体 使视网膜电图更广泛可及。改进的记录与维持方法 离体 光反应有助于研究健康视网膜、眼病动物模型以及人类供体视网膜中光感受器和ON-双极细胞的功能。
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摘要
摘要
视网膜神经元光反应的测量对于研究健康视网膜的生理功能、确定视网膜疾病的病理变化以及评估治疗干预效果至关重要。ex vivo 视网膜电图（ERG）可通过添加特异性药理学试剂，独立于系统性影响，量化离体视网膜中各类细胞的贡献，并评估组织内在的变化。视网膜光反应可使用一种专用的ex vivo ERG标本夹持装置和记录系统进行测量，该装置由现有的膜片钳或微电极阵列设备改装而成。特别是ON-双极细胞以及光感受器的研究，长期以来受到ex vivo ERG记录过程中光反应随时间缓慢但持续衰退的限制。提高灌流速度并调节灌流液温度可改善ex vivo视网膜功能，最大限度地提升反应幅度和稳定性。ex vivo ERG技术能够独特地研究视网膜中特定神经元细胞类型。此外，为最大化反应幅度和稳定性的技术改进，使得对大型动物以及人类供体眼球视网膜样本的光反应研究成为可能，从而使ex vivo ERG成为研究视网膜功能的技术体系中一项重要的补充手段。
引言
视网膜电图通过光刺激来测量视网膜功能1。它在研究视网膜生理学和病理生理学以及评估视网膜疾病治疗效果方面具有重要作用。体内视网膜电图被广泛用于完整生物体中视网膜功能的评估，但存在显著局限性2,3。其中，在体内视网膜电图中对单个视网膜细胞类型的定量分析受到限制，因为它记录的是所有视网膜细胞对光刺激所产生的电位变化总和，因而导致不同细胞反应相互叠加4。此外，该方法难以向视网膜直接施加药物，易受全身性因素影响，且信噪比较低。这些缺点在离体视网膜电图中得以消除，后者用于研究分离视网膜的功能2,3,5,6。离体视网膜电图可通过添加药理学抑制剂记录到来自特定视网膜细胞类型的强而稳定的反应，并可方便地评估治疗药物——药物可直接加入灌流液中。同时，该方法排除了全身效应的干扰，并消除了生理噪声（如心跳或呼吸）。
在离体（ex vivo）视网膜电....
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方案
所有使用小鼠的实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物的护理和使用指南》进行，并经犹他大学机构动物研究委员会批准。本视频演示所用猪眼来自屠宰场（Sustainable Swine Resources, Johnsonville）的死后获取。人眼供体来自脑死亡或心脏死亡后经亲属同意用于科研的捐献者，获取机构为犹他州狮子眼科库、圣地亚哥眼科库或Lifesharing，这些机构均获得美国食品药品监督管理局（FDA）、器官获取组织协会（AOPO）以及美国眼库协会的全面认证。在犹他大学（IRB编号：00106658）和ScrippsHealth IRB（IRB编号：16-6781）中，使用人眼供体的研究被认定为豁免研究。
1. 建立离体视网膜电图（ex vivo ERG）系统
- 将多电极阵列系统进行转换时，连接 离体 ERG 标本架 通过 将头端连接至差分放大器，差分放大器插入多电极阵列系统接口板的模拟输入端。使用多电极阵列系统的记录软件来记录并存储输入数据 离体 ERG。设置 增益 差分放大器的 100 并根据数字化仪的规格额外增加10倍电压放大。将低通滤波器设置为100 Hz。
- 要改装膜片钳装置，需连接 离体 ERG 样品架 通过
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结果
离体 视网膜电图（ERG）能够记录到可重复且稳定的感光细胞和ON-双极细胞的光反应，例如来自小鼠视网膜的反应（图2A-C）。在眼球摘除后最多5小时内的死亡后延迟条件下，仍可记录到人供体视网膜的感光细胞反应（图2D）；而对于ON-双极细胞反应，则需在摘除后<20分钟内完成摘除操作方可记录（图2E）。获得强反应的重要参数包括精细的解剖技术、高灌注速率以及接近生理状态的灌注温度（哺乳动物视网膜为35–38 °C）。在这些条件下，两类细胞的反应幅度和动力学在时间上相对稳定，但在视网膜安装到样品支架上约40–45分钟后逐渐缓慢下降（图3）。
与光感受器相比，ON-双极细胞的功能更容易受到干扰，例如在解剖和安装过程中对视网膜的损伤，或温度和/或灌注速度的下降。虽然样本槽中温.......
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讨论
最初由Holmgren于1865年开发，用于测量两栖动物视网膜的视网膜光反应10，技术限制最初阻碍了视网膜电图（ERG）的广泛应用。然而，Ragnar Granit 等人的开创性研究确定了 ERG 的细胞来源，并测量了光感受器和ON-双极细胞的反应 离体11,12,13此后，经过改进的方法使得其应用更加广泛 离体 ERG 记录14,15，尽管反应幅度，尤其是来自ON双极细胞的反应幅度，仍然相对较小16为了克服这些局限性，目前视网膜功能更多地通过 体内 ERG，尽管存在实验限制且记录波形的解释更为复杂。尽管 离体 ERG 尽管尽可能地模拟生理条件，但它仍是在人工环境中测量视.......
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披露
所有作者均无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家眼科研究所基金项目 EY02665 和 EY031706、国际视网膜研究基金会对 Vinberg 博士的资助、美国国立卫生研究院核心基金（EY014800）以及防盲研究基金会（纽约，纽约州）向眼科系提供的无限制资助支持。 & 视觉科学系，犹他大学。Frans Vinberg 博士还获得了防盲研究基金会/哈里·詹姆斯与卡罗尔·弗里职业发展奖，Silke Becker 博士获得了ARVO EyeFind基金资助。我们感谢斯克里普斯研究所的Anne Hanneken博士提供用于图2E记录实验的人眼供体样本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2 mm 套筒 | WPI | 2026-10 | 制备电极所需材料 |
| Ag/AgCl 电极 | World Precision Instruments | EP1 | 制备电极所需材料 |
| Ames 培养基 | Sigma Aldrich | A1420 | 灌流培养基 |
| 氯化钡 | Sigma Aldrich | B0750 | 钾通道阻滞剂 |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | 广谱谷氨酸能拮抗剂 |
| OcuScience 离体 ERG 适配器 | OcuScience | n/a | 离体 ERG 标本固定装置 |
| 螺纹鲁尔接头 | McMaster-Carr | 51525K222 或 51525K223 | 制备电极所需材料 |
参考文献
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 ....
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