方法文章

自动化高通量细菌黏附宿主细胞检测方法

DOI：

10.3791/62764

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2021年9月17日

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1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

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摘要

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基于表型黏附，利用高通量荧光标记成像结合自动化统计分析方法检测宿主与细菌病原体之间的相互作用，可实现对细菌与宿主细胞潜在相互作用的快速评估。

摘要

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鉴定新出现的细菌病原体对人类健康和安全至关重要。细菌对宿主细胞的黏附是细菌感染的关键步骤，也是潜在威胁的重要标志。因此，检测细菌对宿主细胞的黏附能力可作为细菌威胁评估的一个组成部分。目前用于定量细菌黏附宿主细胞的标准方法是将细菌与宿主细胞共孵育，收集黏附的细菌，将收获的细胞接种于固体培养基上，随后计数形成的菌落形成单位（CFU）。此外，也可采用基于免疫荧光显微镜的方法来评估细菌对宿主细胞的黏附。然而，传统实施这些方法的策略耗时且效率低下。本文介绍了一种近期开发的基于自动荧光显微镜成像的方法。结合高通量图像处理与统计分析，该方法能够快速定量黏附于宿主细胞的细菌。为验证本实验方案，测试了两种细菌：革兰氏阴性菌Pseudomonas aeruginosa和革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes，并设置了相应的阴性对照。结果表明，该方法能够快速、准确地定量黏附细菌，并显著减少实验工作量和时间。

引言

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细菌黏附是指细菌附着于其他细胞或表面的过程。细菌病原体成功建立感染需要黏附于宿主细胞、在组织中定植，而在某些情况下还需要侵入宿主细胞1,2,3。新发传染病构成了重大的公共卫生威胁，近期的COVID-19大流行即为明证4,5,6。尤为重要的是，使用基于基因组的方法可能难以快速识别新出现或新发的病原体，特别是在病原体经过改造以逃避检测，或缺乏可识别其致病性的基因组特征的情况下。因此，采用能够直接评估致病性特征（如细菌对宿主细胞的黏附能力）的方法来鉴定潜在病原体，在病原体识别中可发挥关键作用。

数十年来，细菌对宿主细胞的黏附已被用于评估细菌致病机制1,7。显微成像8,9以及通过感染后平板培养计数细菌菌落形成单位（CFU）10....

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方案

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1. A549 细胞培养

  1. 在添加10%胎牛血清（FBS）的F-12K培养基中培养A549细胞系，并于37 °C、5% CO2条件下孵育。
  2. 每3–4天更换一次培养基，并在细胞融合度达到85%–95%时进行传代。
  3. 简而言之，用1 ×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，除非另有说明）冲洗细胞，随后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶–0.53 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（覆盖细胞层），在37 °C处理约2分钟。
  4. 加入额外的6 mL完全生长培养基（F-12K培养基 + 10% FBS）以终止蛋白酶活性。然后以1:3–1:8的传代比例将细胞接种至无菌聚苯乙烯T-75组织培养瓶中，终体积为12 mL。
  5. 在进行黏附实验前一天，将约1 × 104个A549细胞（细胞浓度：约1 × 105个细胞/mL）接种至96孔板的每孔中。

2. 细菌生长与染色

  1. 所有细菌实验均须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。
  2. 接种所有细菌培养物，包括 P. aeruginosa (PAO1) 大肠杆菌大肠杆菌, 单核细胞增生李斯特菌， 和 枯草芽孢杆菌， 等等， 从冻存的甘油菌种中接种，在....

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结果

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为了建立基于荧光成像的细菌黏附实验， P. aeruginosa 菌株PAO1及其不粘附性对应突变株 E. coli 用于测试该方案的有效性，因为已有文献报道这些细菌对 A549 细胞具有黏附性14,20,22首先，GFP标记的 P. aeruginosa （PAO1）和GFP标记的 E. coli 分别与人永生化上皮细胞系 A549 在不同感染复数（MOI）下共孵育。结果显示，PAO1 以剂量依赖的方式黏附于 A549 细胞图1A,B）；与此同时，接近零的黏附性 E. coli 也得到了验证（图1A,B每个MOI下采集并分析了50张图像。通过双因素方差分析（Two-way AN.......

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讨论

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本方案描述了一种用于定量细菌与宿主细胞黏附的自动化方法。与传统方法相比，该方法具有多项显著优势。首先，该方法能够精确定量与单个宿主细胞结合的微生物病原体细胞数量。重要的是，该定量过程无需繁琐的细菌收集、系列稀释、在固体培养基上涂布以及菌落形成单位（CFU）的测定10,11,12。因此，该技术显著减少了定量细菌黏附所需的总体工作量。应当认识到，当用于大规模筛选实验以检测黏附表型时，例如分别鉴定调控该过程的细菌或宿主突变体文库或CRISPR文库中的基因，该方法的优势将被进一步放大。其次，利用荧光显微镜直接评估宿主细胞与细菌细胞之间的相互作用，可提供有助于阐明细菌致病机制的信息，包括宿主或细菌细胞的存活率、形态或动态行为的变化。最后，对分析过程中采集的图像进行自动化统计分析，不仅能够整体量化细菌与宿主细胞的平均结合水平，还可实现对动态的、单细胞水平的宿主-病原体相互作用的评估。

尽管这些方法具有上述优势.......

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披露

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所有作者均无利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Biotek公司Kaite Zlotkowski博士提供的技术支持。同时感谢麦克马斯特大学Lori Burrows博士慷慨赠送铜绿假单胞菌菌株。本研究工作由美国国防部通过合同编号W911NF1920013资助PdF；美国国防高级研究计划局（DARPA）和美国内政部通过合同编号140D6319C0029资助PdF。本文件所载信息的内容不一定反映政府的立场或政策，不应推断出官方认可。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x PBSVWR45001-130
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）Thermo Fisher62248宿主细胞染色染料
96孔板Corning3882半面积孔，平底透明
A549细胞ATCC CCL 185哺乳动物细胞系
BactoView Live RedBiotium40101细菌染色染料
离心机Eppendorf5810R
CFSE细胞分裂示踪剂BioLegend423801
Cytation 5 BioTekCytation 5 细胞成像多功能微孔板检测仪
E. coli实验室菌种 
EGM bulletKitLonzaCC-3124HUVEC细胞培养基
EHECNIST菌种库
F-12k培养基ATCC 302004A549细胞培养基
胎牛血清Corning35-016-CV
HUVEC实验室菌种 
L. monocytogenesNIST菌种库
OD600 DiluPhotometerIMPLEN
P. aeruginosaDr. Lori Burrows 实验室菌种
P. aeruginosa ΔpilADr. Lori Burrows 实验室菌种
S. agalactiaeNIST菌种库
S. aureusBEINR-46543
S. aureus ΔsaeRBEINR-48164
S. rubidaeaNIST菌种库
普通大豆肉汤GrowcellsMBPE-4040

参考文献

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  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).

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重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

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勘误

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

标签

A549

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