自动化高通量细菌黏附宿主细胞检测方法

摘要

基于表型黏附，利用高通量荧光标记成像结合自动化统计分析方法检测宿主与细菌病原体之间的相互作用，可实现对细菌与宿主细胞潜在相互作用的快速评估。

摘要

鉴定新出现的细菌病原体对人类健康和安全至关重要。细菌对宿主细胞的黏附是细菌感染的关键步骤，也是潜在威胁的重要标志。因此，检测细菌对宿主细胞的黏附能力可作为细菌威胁评估的一个组成部分。目前用于定量细菌黏附宿主细胞的标准方法是将细菌与宿主细胞共孵育，收集黏附的细菌，将收获的细胞接种于固体培养基上，随后计数形成的菌落形成单位（CFU）。此外，也可采用基于免疫荧光显微镜的方法来评估细菌对宿主细胞的黏附。然而，传统实施这些方法的策略耗时且效率低下。本文介绍了一种近期开发的基于自动荧光显微镜成像的方法。结合高通量图像处理与统计分析，该方法能够快速定量黏附于宿主细胞的细菌。为验证本实验方案，测试了两种细菌：革兰氏阴性菌Pseudomonas aeruginosa和革兰氏阳性菌Listeria monocytogenes，并设置了相应的阴性对照。结果表明，该方法能够快速、准确地定量黏附细菌，并显著减少实验工作量和时间。

引言

细菌黏附是指细菌附着于其他细胞或表面的过程。细菌病原体成功建立感染需要黏附于宿主细胞、在组织中定植，而在某些情况下还需要侵入宿主细胞^1,2,3。新发传染病构成了重大的公共卫生威胁，近期的COVID-19大流行即为明证^4,5,6。尤为重要的是，使用基于基因组的方法可能难以快速识别新出现或新发的病原体，特别是在病原体经过改造以逃避检测，或缺乏可识别其致病性的基因组特征的情况下。因此，采用能够直接评估致病性特征（如细菌对宿主细胞的黏附能力）的方法来鉴定潜在病原体，在病原体识别中可发挥关键作用。

数十年来，细菌对宿主细胞的黏附已被用于评估细菌致病机制^1,7。显微成像^8,9以及通过感染后平板培养计数细菌菌落形成单位（CFU）^10,11,12,13是两种成熟的实验室方法，用于检测微生物对宿主细胞的黏附和/或感染¹⁴。鉴于细菌细胞的尺寸在微米级别，对黏附细菌细胞的计数通常需要采用先进的高倍显微技术以及高分辨率成像方法，包括电子显微镜、扩张显微镜（ExM）^15,16和三维成像¹⁷。另一种方法是将结合或内化于宿主细胞的细菌收集后进行系列稀释，接种于固体琼脂平板，通过计数形成的CFU来定量细菌数量^10,12,13。该方法耗时费力，且包含大量人工操作步骤，难以建立适用于高通量分析的标准化或自动化流程^18,19。因此，开发新的宿主细胞黏附评估方法将有助于克服当前该领域的技术局限。

本文介绍了一种结合自动化高通量显微镜技术、高通量图像处理与统计分析的方法。为验证该方法的有效性，研究中开展了多种细菌病原体的实验，包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），这是一种机会性革兰氏阴性细菌病原体，可感染人类、动物和植物^14,20，常在宿主防御功能受损的患者呼吸道中定植。本方法优化了先前研究中描述的显微成像流程^14,20。通过使用荧光标记的宿主细胞和细菌，简化了成像检测过程，能够快速追踪二者之间的接近程度，从而显著减少了为区分细菌而获取高分辨率图像所需的显微镜工作量。此外，利用自动化的图像统计分析对宿主细胞和细菌进行计数，取代了传统的细菌菌落形成单位（CFU）平板实验，以估算每个宿主细胞上黏附的细菌数量比例。为验证该方法的适用性，还测试了多种细菌菌株和不同类型的宿主细胞，包括单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae），以及人脐静脉内皮细胞（HUVECs），实验结果支持该方法具有广泛的适用性和高效性。

方案

1. A549 细胞培养

1. 在添加10%胎牛血清（FBS）的F-12K培养基中培养A549细胞系，并于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
2. 每3–4天更换一次培养基，并在细胞融合度达到85%–95%时进行传代。
3. 简而言之，用1 ×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，除非另有说明）冲洗细胞，随后加入1 mL 0.25%胰蛋白酶–0.53 mM乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（覆盖细胞层），在37 °C处理约2分钟。
4. 加入额外的6 mL完全生长培养基（F-12K培养基 + 10% FBS）以终止蛋白酶活性。然后以1:3–1:8的传代比例将细胞接种至无菌聚苯乙烯T-75组织培养瓶中，终体积为12 mL。
5. 在进行黏附实验前一天，将约1 × 10⁴个A549细胞（细胞浓度：约1 × 10⁵个细胞/mL）接种至96孔板的每孔中。

2. 细菌生长与染色

1. 所有细菌实验均须在生物安全二级实验室的生物安全柜中进行。
2. 接种所有细菌培养物，包括 P. aeruginosa (PAO1) 大肠杆菌大肠杆菌, 单核细胞增生李斯特菌， 和 枯草芽孢杆菌， 等等， 从冻存的甘油菌种中接种，在3 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中，于37 °C、250 rpm振荡培养过夜。
3. 第二天，用1:100的稀释比例将过夜培养物接种至子培养物中，在TSB（1 mL）中培养3小时至对数生长期，于600 nm处测定OD值（OD₆₀₀) 以确认。 确保 OD₆₀₀ 在0.4-0.6范围内.
4. 在进行细菌-宿主黏附实验之前，将细菌悬液在TSB琼脂平板上进行系列稀释，于37 °C过夜培养，然后根据菌落数量确定细菌的CFU。对于 P. aeruginosa，一个OD₆₀₀ 1.0 对应于 2 × 10⁸ 可存活细菌细胞/mL，以及 单核细胞增生李斯特菌，一个OD₆₀₀ 1.0 对应于 9 × 10⁸ 可存活的细菌细胞/mL
5. 在指数生长期通过13,000 x g离心收集细菌培养物 g 室温（RT）孵育2分钟，然后用1x PBS（1 mL）洗涤一次。将菌体沉淀重悬于1 mL的1x PBS中，通过测定OD值确定浓度₆₀₀ 细菌悬液。例如， P. aeruginosa OD值₆₀₀ 0.5 表示浓度为 1 × 10⁸ 细菌细胞/mL
6. 在室温下，将细菌悬液与绿色或红色荧光染料避光孵育30分钟，同时轻轻旋转染色。具体操作为：向1 mL细菌悬液中加入2 μL 500倍浓缩的染料原液，使染料终浓度为1倍稀释。为去除未结合的染料，将染色后的细菌在13,000 x g 2分钟，然后将沉淀重悬于1 mL的1×PBS中，重复三次。
   注意：如果实验中使用了荧光标记（GFP、RFP、mCherry等）的细菌，则跳过此细菌染色步骤。GFP标记 P. aeruginosa 红色荧光染料染色的 L. monocytogenes 在本方案中使用了。
7. 通过在13,000 x g条件下离心收集染色的细菌细胞或GFP标记的细菌 g 2 分钟后，用新鲜的 F-12K 培养基（1 mL）重悬，并测定 OD₆₀₀ 每种培养物的后续稀释需根据感染复数（MOI）和宿主细胞浓度调整至所需浓度。本实验使用的终体积为500 μL。
   注意：例如，若使用台盼蓝染色法计数的宿主细胞浓度为 1 x 10⁵ 细胞/mL，当感染复数（MOI）为100时，所需细菌细胞浓度为1 × 10⁷ 细胞/mL。浓度 P. aeruginosa 在0.5 OD时₆₀₀ 是 1 × 10⁸/mL。为获得所需浓度，需稀释 P. aeruginosa 将培养物稀释10倍，取50 μL重悬的培养物加入450 μL新鲜F-12K培养基中。

3. 细菌黏附与宿主细胞染色

1. 首先，用预热的1×PBS将接种了A549细胞的单层细胞洗涤三次。每次洗涤时，向每个孔中加入100 μL 1×PBS，轻轻吹打3次，弃去1×PBS；或加入后静置10秒，随后用真空泵吸除1×PBS。为测定细菌结合动力学，向细胞中加入100 µL含不同感染复数（MOI）（0、1、10和100）的细菌悬液。在200 × g 条件下离心10分钟沉淀细菌，并将感染后的A549细胞在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育1小时。
   注意：本实验中，每种条件均设置技术重复三孔。
2. 按照上述方法，用预热的1×PBS将单层细胞洗涤五次，以去除未结合的细菌。向96孔板的每个孔中加入100 µL 4%多聚甲醛（溶于1×PBS中）以固定细胞。将板置于冰上静置15分钟，随后用1×PBS洗涤三次，去除固定液。
3. 为染色细胞核，加入50 ng/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育10分钟。孵育结束后，用1×PBS洗涤三次。向感染的A549细胞中加入100 µL 1×PBS，防止干燥。立即进行下一步操作，或在避光条件下于4 °C保存最多2天。

4. 自动荧光成像、处理与分析

1. 为保证数据完整性，随机并手动选取每个孔中的五个位置，在20倍放大倍数下拍摄图像。分别在DAPI和GFP通道下拍摄A549细胞和细菌的荧光图像。使用PE-Cy5通道拍摄经红色荧光染料标记的细菌。
2. 为获得更佳分辨率，对所有图像进行背景平整化和去卷积处理。设置参数为采用直径68 µm的滚动球进行平滑处理，并根据物镜自动测量图像去卷积的点扩散函数（PSF）。
3. 为计数所有符合条件的细胞和细菌，测量宿主细胞和细菌的荧光强度，并将宿主细胞和细菌中最弱的荧光强度设为细胞计数的阈值。将距离宿主细胞15 µm范围内的所有细菌计为黏附细菌，因为A549细胞的直径为10.59–14.93 µm²¹。
   注意：成像系统的默认设置会特异性地计数直径在5–100 µm范围内的宿主细胞，以及大小在0.2–5 µm（宽度和长度）范围内的细菌。
4. 根据上述手动图像处理结果，将图像平滑、去卷积、物体尺寸、距离和荧光强度等参数应用于其余自动采集的图像。完成自动分析后，考虑关键读数，如总宿主细胞数、细胞大小和形态、总细菌数以及每个宿主细胞的平均细菌数（这是最重要的指标），以确定细菌黏附水平。
5. 数据导出与统计分析
   1. 将所有图像的分析结果导出至电子表格（例如“xlsx”格式）。自动化系统生成两组结果：1）每张图像中平均黏附细菌数；2）每个单个宿主细胞的相关信息数据，如单个细胞上的黏附细菌数、宿主细胞大小，以及宿主细胞和细菌的平均荧光强度，均来自对应图像。
   2. 计算所有图像中黏附细菌数的平均值和标准差，以表示相对于阴性对照的细菌黏附水平。E. coli 和 B. subtilis 在本方法中分别作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌黏附实验的阴性对照。对三次独立实验的数据进行双因素方差分析（two-way ANOVA），以检验不同处理组间数据点的显著性差异。

结果

为了建立基于荧光成像的细菌黏附实验， P. aeruginosa 菌株PAO1及其不粘附性对应突变株 E. coli 用于测试该方案的有效性，因为已有文献报道这些细菌对 A549 细胞具有黏附性^14,20,22首先，GFP标记的 P. aeruginosa （PAO1）和GFP标记的 E. coli 分别与人永生化上皮细胞系 A549 在不同感染复数（MOI）下共孵育。结果显示，PAO1 以剂量依赖的方式黏附于 A549 细胞图1A,B）；与此同时，接近零的黏附性 E. coli 也得到了验证（图1A,B每个MOI下采集并分析了50张图像。通过双因素方差分析（Two-way AN...

讨论

本方案描述了一种用于定量细菌与宿主细胞黏附的自动化方法。与传统方法相比，该方法具有多项显著优势。首先，该方法能够精确定量与单个宿主细胞结合的微生物病原体细胞数量。重要的是，该定量过程无需繁琐的细菌收集、系列稀释、在固体培养基上涂布以及菌落形成单位（CFU）的测定^10,11,12。因此，该技术显著减少了定量细菌黏附所需的总体工作量。应当认识到，当用于大规模筛选实验以检测黏附表型时，例如分别鉴定调控该过程的细菌或宿主突变体文库或CRISPR文库中的基因，该方法的优势将被进一步放大。其次，利用荧光显微镜直接评估宿主细胞与细菌细胞之间的相互作用，可提供有助于阐明细菌致病机制的信息，包括宿主或细菌细胞的存活率、形态或动态行为的变化。最后，对分析过程中采集的图像进行自动化统计分析，不仅能够整体量化细菌与宿主细胞的平均结合水平，还可实现对动态的、单细胞水平的宿主-病原体相互作用的评估。

尽管这些方法具有上述优势...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo Fisher	62248	宿主细胞染色染料
96孔板	Corning	3882	半面积孔，平底透明
A549细胞	ATCC	CCL 185	哺乳动物细胞系
BactoView Live Red	Biotium	40101	细菌染色染料
离心机	Eppendorf	5810R
CFSE细胞分裂示踪剂	BioLegend	423801
Cytation 5	BioTek	Cytation 5	细胞成像多功能微孔板检测仪
E. coli			实验室菌种
EGM bulletKit	Lonza	CC-3124	HUVEC细胞培养基
EHEC			NIST菌种库
F-12k培养基	ATCC	302004	A549细胞培养基
胎牛血清	Corning	35-016-CV
HUVEC			实验室菌种
L. monocytogenes			NIST菌种库
OD600 DiluPhotometer	IMPLEN
P. aeruginosa			Dr. Lori Burrows 实验室菌种
P. aeruginosa ΔpilA			Dr. Lori Burrows 实验室菌种
S. agalactiae			NIST菌种库
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			NIST菌种库
普通大豆肉汤	Growcells	MBPE-4040