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方法文章

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

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⸱

DOI：

10.3791/62765

⸱

2022年2月7日

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。

摘要

利用电子对生物样品进行成像，以通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）实现高分辨率结构解析，需要将目标生物分子包埋在一层薄薄的玻璃态冰中。尽管近年来多项技术进步已推动单颗粒cryoEM成为结构生物学的前沿手段，但样品玻璃化制备方法往往仍是实现高分辨率成像的限速步骤。尽管近期已有大量研究致力于克服样品玻璃化过程中常遇到的困难，包括开发新型样品支撑膜和创新的玻璃化设备，但由于成本低廉且操作简便，传统的手动操作冷冻装置在cryoEM领域仍被广泛使用。本文提供了使用标准剪刀式手动 blot-and-plunge 装置制备适用于单颗粒cryoEM高分辨率成像的生物样品的详细方法。此外，还描述了常见问题及当标准制备方法未能获得合适样品时的故障排查建议。

引言

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种强大的结构生物学技术，可用于解析动态生物样品的近原子分辨率结构1,2,3,4。事实上，近年来直接电子探测器技术4,5,6,7,8,9,10、电子源性能的提升4,11,12,13,14以及电磁透镜稳定性的改进15，结合数据采集16,17和分析软件包的持续发展18,19，使得研究人员如今能够常规地以3 Å或更高的分辨率解析性质良好的样品结构4,11,13,14,20,21,22,23。尽管成像和数据处理能力已显著提升，冷冻电镜载网制备仍是实现高分辨率结构解析的最大障碍，常常成为电镜工作流程中的主要瓶颈24,25,26,27。

冷冻电镜（CryoEM）依赖于对生物样品在水溶液中成像，这些样品被快速冷冻形成一层薄的"玻璃态"冰——这一过程称为玻璃化，可保持生物分子的天然生化状态。用于冷冻电镜的生物样品玻璃化技术已有40多年历史28,29,30，许多为此开发的技术和设备均基于最初详述的“ blot-and-plunge”（吸滤-投入）法31,32,33,34,35，即先将少量样品（例如1–5 µL）施加到专用的电镜载网，再通过载网与滤纸的物理接触去除多余液体。该过程的时间通常需针对每种样品经验性地确定，因为冷冻样品的关键因素之一是玻璃态冰层的厚度：若冰层过厚，电子束散射增加将显著降低成像质量；而冰层过薄则可能限制蛋白质的取向，和/或使颗粒无法进入载网微孔的中心区域36。单颗粒冷冻电镜对理想冰层厚度的依赖，催生了多种可用于冷冻样品的技术与设备，包括机器人系统37,38、微流控技术42以及超声或喷雾装置27,39,40,41,42,43,44。近年来，一些最受欢迎的样品制备设备依赖于机器人系统，通过自动化的 blot-and-plunge 技术实现样品冷冻45。尽管这些设备旨在可重复地生成适合成像的冰层厚度，但其价格通常过高，单个实验室难以负担购买与运行成本，因此一般仅在冷冻电镜平台中以小时计费的方式提供使用。近年来，原始的手动 blot-and-plunge 技术重新受到更广泛的关注与应用3,47,48,49,50,51,52。事实上，手动操作的 blot-and-plunge 装置能够以远低于机器人设备的成本制备出高质量的冷冻电镜载网。 此外，手动吸滤还为使用者提供了更高的操作控制灵活性，研究人员可根据不同样品和具体研究问题，调整吸滤方式（例如载网背面吸滤、正面吸滤等）以及吸滤时间。

本文详细介绍了如何使用传统的手动 blot-and-plunge 玻璃化冷冻装置，并结合定制设计的杜瓦平台，高效冷冻生物样品53。文中提供了最佳操作实践，包括冷冻剂的准备、载网操作、样品施加与 blotting 步骤，以及常见问题和克服这些困难的建议。同时讨论了如何提高不同载网制备之间冰层厚度的可重复性，以及如何根据生物样品类型调整样品 blotting 方法。由于本文所述手动冷冻装置在采购和运行上的成本较低，全球各地的实验室均能以经济高效且可重复的方式为冷冻电镜（cryoEM）制备生物样品。

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方案

1. 准备手动冷冻环境

注意：预计操作时间：5-30 分钟

  1. 在4 °C 冷室，其中可放置加湿器以维持接近 100% 相对湿度（RH）的环境（图1A).
    警告：请查阅所在机构的环境健康与安全指南，以确定手动冷冻装置的安全使用位置及推荐操作规程。
  2. 在制备载网前，开启冷室内的加湿器，确保冷室的相对湿度 ≥ 95 %。
    注意：在低湿度条件下制备载网可能导致薄膜脱水、缓冲液成分因蒸发而改变，以及载网间重复性的降低46不建议将载网冷冻在 <80 % RH
  3. 确保冷室的温度为 4 °C.
  4. 将手动冲压装置放置在远离强气流的位置（例如远离空调出风口），因为强气流可能导致载网附近产生湍流和/或在冷表面形成明显的冰层积累。

2. 准备冷冻载样材料和配件

注意：预计操作时间：1-5 分钟

  1. 使用干净的剪刀将滤纸剪成宽1-1.5 cm、长约9 cm的条状。避免触碰滤纸中心区域，并丢弃较小的边角料。务必确保滤纸条干燥、洁净且无污染物。将滤纸条分开后放入一个100 mm的培养皿中。
  2. 将一块22×22 mm的方形玻璃盖玻片放入另一个60 mm的玻璃培养皿中。此装有盖玻片的玻璃培养皿将用于储存、转移和辉光放电处理载网。
    注意：建议使用压缩空气除尘罐清除载片表面可见的碎屑。也可使用防静电枪去除积聚的静电。
  3. 组装并标记载网储存盒。
  4. 准备4至6把洁净干燥的夹持镊子，并将其放置于手动冷冻装置附近。在冷冻前目视检查每把镊子，确保其无损坏且无污染物。

3. 准备冷冻剂杜瓦瓶和手动冲压装置

注意：预计操作时间：5-15 分钟

  1. 将平台底座安装在冷冻浸入式杜瓦瓶的底部。将乙烷容器杜瓦瓶置于平台底座上方，放入黄铜乙烷容器，然后安装旋转式载网储存平台。
    1. 向浸入式杜瓦瓶中加入液氮（LN2）后，平台底座的高度将无法再进行调节。请确保载网底座已正确安装并保持水平，以避免因冷冻夹持器高度不当而导致载网和/或镊子损坏。
  2. 在冷冻前，检查手动夹持器及所有辅助设备，确保其正常工作，以减少样品和/或载网的损失。
  3. 每次冷冻操作前，更换手动夹持臂上用于固定镊子的胶带。实验室内高湿度环境可能使胶带粘性下降，降低其固定镊子的能力，从而增加镊子损坏和/或载网丢失的风险。
  4. 调节靠近手动夹持器的灯具，确保有足够光线以观察样品的毛细吸液过程，并便于清晰观察载网转移过程，防止载网损坏和/或丢失（参见步骤3.7）。使用位于夹持器正后方的环形灯以观察液体流动情况，并在杜瓦瓶附近使用带柔性臂的任务灯照亮已冷冻的载网。
  5. 调节脚踏板张力，确保浸入臂在抬起位置时能牢固固定，并在踩下脚踏板时完全释放。在加样前进行数次“空载”测试，以确认夹持器工作正常。
    注意：脚踏板张力调节不当会导致浸入臂过早释放（即张力设置过低），造成载网丢失；或导致载网未能完全浸入乙烷容器中（即张力设置过高）。
  6. 将浸入式杜瓦瓶放置在手动夹持器底部正下方的夹持臂下方，并将其固定。使用附带的胶带将一对镊子固定在夹持臂上。在握住手动夹持臂的同时，踩下脚踏板，小心地降低浸入臂，并调节其行程，确保载网能准确进入乙烷容器的中部位置。
  7. 利用浸入臂顶部的限位块来确定脚踏板完全踩下时浸入臂的最终位置（图1B）。调节浸入臂上限位块的高度，以调整载网在乙烷容器中的位置（图1C）。
    注意：浸入臂高度设置不当可能导致载网和/或镊子损坏（例如浸入臂高度设置过低），或导致玻璃化效果不佳（例如浸入臂高度设置过高）。
  8. 将杜瓦瓶置于低温室外部，随后进行液态乙烷的制备（步骤4）。

4. 准备冷冻剂

注意：预计操作时间：10-30 分钟

  1. 检查乙烷罐、减压阀、管路和乙烷 dispensing 尖端是否有任何损坏迹象。如发现损坏，必须立即报告并修复后方可继续操作。
    警告：压缩乙烷及乙烷:丙烷混合气体具有可燃性，若操作或处理不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。如不确定如何操作或处理压缩气体钢瓶，请咨询专业人员。处理可燃性压缩气体时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。此外，液化乙烷是一种强效冷冻剂，若处理不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。处理冷冻剂时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。
  2. 获取足量液氮2 在适量的液氮中2 液氮杜瓦瓶（例如，用于载网制备和储存时，3-4 L 为常规容量）。
    警告：液氮（LN₂）2 是一种冷冻剂，若操作不当，可能对生命造成严重威胁和/或导致伤害。
    1. 确保使用所有个人防护装备，以最大限度地降低受伤风险。液氮（LN₂）的蒸气2 是一种窒息性气体，应在通风良好的区域操作。如果不确定如何操作或处理低温容器和低温液体，请咨询专家。处理低温液体时，请参照所在机构的环境健康与安全指南。在冷室中无法使用液氮的情况下，建议在低温且通风良好的环境中进行 plunge freezing（浸入式冷冻）。
  3. 在冷室外，通过倒入液氮来预冷冷冻铜杯2 直接注入铜制乙烷容器中，直至液氮液面达到乙烷容器顶部（即平台略上方）。补充液氮至满2 根据需要在乙烷容器外部操作。当液氮（LN）2 停止剧烈冒泡（约5分钟）。
    1. 加入液氮2 直接将液氮导入铜制乙烷容器，以在冷凝乙烷气体前充分冷却该容器。若未能充分冷却铜制乙烷容器，将显著延长乙烷冷凝所需时间。
    2. 一旦杜瓦瓶达到液氮（LN₂）2 温度，避免过满填充液氮罐，以免液氮溢出2 溢入乙烷容器中。
  4. 乙烷以压缩气体形式提供，使用前需液化。乙烷气罐需配备高纯度双级减压阀以控制气体流量。将管路连接至减压阀出口阀，并在末端连接一个14号规格的扁平金属 dispensing tip 用于释放乙烷。
  5. 打开乙烷主气罐阀门之前，确保压力调节旋钮和出口阀门均已完全关闭。完全打开主气罐阀门，然后将出口阀门打开至约50%。缓慢旋转压力调节旋钮，直至观察到气体缓慢流出。使用出口阀门精细调节气体流量。
    警告：打开阀门或调节气体流量时，务必使金属分配尖端朝向远离自身的方向。
  6. 缓慢开启气体流，将乙烷气体管路的尖端插入盛有去离子水的小烧杯中，以此评估气体流速。调节气体流速，直至达到所需的流速 适度地 扰动水体。
    1. 调节气体流速以确保乙烷适当冷凝——流速过慢会导致乙烷气体在 dispensing tip 处固化，流速过快则会引起剧烈冒泡并阻碍冷冻。
  7. 在将乙烷气体管路的尖端插入黄铜乙烷容器之前，使用精密擦拭纸清洁并擦干 dispensing tip，以去除任何水分。
  8. 以平稳而迅速的动作，将气体释放管口置于黄铜乙烷容器底部，开始让释放管口在乙烷容器底部缓慢地做环形移动。固态乙烷会立即形成，但随着更多乙烷气体的加入或冷凝，将迅速液化。
    1. 继续在乙烷容器底部移动金属乙烷输送尖端，以使固态乙烷液化。将乙烷容器填充至 ¾ 充满液态乙烷（液面距顶部2-3圈螺纹处）。通过小心地将金属乙烷分配尖端从黄铜乙烷容器中取出，并关闭出口阀门，以停止乙烷气体流动。
  9. 用液氮加满冷冻样品杯2 从液氮罐侧壁轻轻倾倒，以避免液氮（LN）飞溅2 除了黄铜乙烷容器外，继续添加液氮，直至液面刚好接触黄铜乙烷容器。将泡沫盖置于冷冻浸入式杜瓦瓶上，以促进乙烷固化。
    1. LN2 必须直接接触黄铜乙烷容器，以促进乙烷的固化。大约5分钟后，黄铜容器内的乙烷将完全冻结成固体。添加更多液氮2 直到其刚好接触乙烷容器，然后进行下一步操作。
  10. 如果乙烷未完全冻结成固体，则表明黄铜乙烷容器的温度不足以进行后续步骤。需添加更多液氮（LN₂）2 直到其刚刚接触乙烷容器，再等待5分钟。确保黄铜容器内的乙烷完全冻结成固体。
  11. 打开气体出口阀，使乙烷气体流速与步骤4.6中确定的流速相近。将金属乙烷 dispensing tip 垂直插入固体乙烷中，并持续以环形运动移动乙烷 dispensing tip，以熔化固体乙烷。
    1. 继续加入乙烷，直至其液面与黄铜乙烷容器顶部齐平。缓慢将移液枪尖端从乙烷容器中取出，并关闭乙烷气罐出口阀门。用盖子盖住杜瓦瓶，静置约1至4分钟，使乙烷在黄铜乙烷容器边缘周围固化。
      注意：理想的乙烷容器在黄铜乙烷容器边缘应具有2–3 mm均匀的固态乙烷环，中心区域为液态乙烷图1D 和 图2).
    2. 确保乙烷处于尽可能低的温度，但不得凝固，以保证生物样本的充分玻璃化。若未能正确制备液态乙烷，可能导致样本玻璃化不充分、冰晶积累和/或样本丢失，进而影响成像样本的质量。
    3. 如果在2-3分钟后仍未形成完整的乙烷环，则添加更多液氮2 转移到杜瓦瓶中，并覆盖保存2-5分钟。
    4. 如果乙烷凝固过快，可使用一把干净的大型镊子轻轻加热乙烷容器和/或固体乙烷，以防止乙烷完全固化。待乙烷与液氮2 保持稳定后，关闭所有乙烷罐阀门，并将冷冻用杜瓦瓶移至手动冲压装置处。将冷冻用杜瓦瓶牢固固定在手动冲压装置上。
      警告：转移液氮罐时需格外小心，因为液氮（LN2 可能会溢入乙烷容器并使液态乙烷凝固。如有需要，可使用一套干净的镊子熔化容器中部的固态乙烷。
  12. 用一对空镊子测试乙烷杜瓦瓶的位置，确保镊子尖端位于乙烷容器的中心，并且在液态乙烷内部，载网和镊子尖端有足够的空间（图1D).
    1. 如果固态乙烷环过厚而不便于网格操作，则使用一对室温的洁净镊子熔化固态乙烷，以在乙烷容器中心创造更大的冷冻区域。

5. 准备电镜载网

注意：预计操作时间：1-5 分钟

  1. 将网格存储盒添加至杜瓦瓶中，拧开网格存储盒的盖子，并确保每个盖子能够自由旋转至新的网格槽位。
  2. 小心地将网格从网格存储盒转移至方形玻璃盖玻片边缘，使约30–40%的网格悬于载玻片边缘之外。确保网格的支撑膜面朝上。不使用时应始终将网格盖好。将网格置于方形玻璃盖玻片边缘有助于操作，并减少转移过程中弯曲或损坏网格的风险。
    注意：通常一次准备4–6个网格。
  3. 使用辉光放电器或等离子清洗仪使网格具有亲水性。
    注意：请参考辉光放电器/等离子清洗仪制造商提供的网格清洗推荐指南。
    1. 等离子清洗后应在10分钟内使用网格，因为超过此时间后网格会逐渐失去亲水性，且网格间的重复性将下降。

6. 通过冷冻固定制备冷冻电镜样品

注意：预计操作时间：>10 分钟（每张载网约 1–3 分钟）

  1. 使用干净且干燥的夹持镊子夹取一块已清洁的载网，将塑料夹具向下滑动以固定载网，并轻轻敲击镊子，确保载网已牢固固定。
    1. 操作载网时应仅接触其外圈，以避免损坏载网的金属箔层。
  2. 将 1 至 5 µL 样品滴加到载网的制备面（例如正面或金属箔面）上。
    注意：最佳加样体积和 blotting 时间取决于具体样品，需针对每种样品进行优化；体积较大或黏度较高的样品需要更长的 blotting 时间。
  3. 用胶带缠绕镊子手柄，将镊子-载网-样品组件固定在手动 plunge 装置的臂上。
    1. 进行传统正面 blotting 时，应使样品面朝向操作者；若需进行背面 blotting，则应使样品面背向操作者。
  4. 用双手的拇指和食指分别夹住一块干净、干燥并裁剪好的 blotting 纸。
    1. 仅可从 blotting 纸边缘处操作，切勿触碰其中心区域，以免手部或手套上的油脂及其他污染物影响载网质量。
  5. 将双手 resting 在 plunge 用杜瓦瓶边缘，以建立稳定的操作位置。将 blotting 纸平行放置于载网表面附近，距离约 1 cm。
    1. 使用 blotting 纸的中部区域，以确保液体在载网表面具有充分的流动性，并实现均匀的吸液效果。
  6. 轻轻滑动并旋转双侧的拇指与无名指向彼此靠近，使 blotting 纸向载网方向弯曲，从而开始 blotting 操作。在整个 blotting 过程中，保持 blotting 纸与载网表面的接触。
    1. 确保 blotting 纸直接接触载网表面，并在整个载网表面维持一致的接触。
    2. 轻微弯曲 blotting 纸可减少载网的弯曲或表面损伤，并在载网上形成更均匀的冰层（图 3A）。
  7. 观察液体前沿的移动情况，当其停止向 blotting 纸内扩散时，开始计时 4 至 6 秒。
    注意：计时可在 blotting 纸接触载网表面时开始，但可能导致载网间重复性降低。总 blotting 时间取决于载网类型、金属箔类型、样品浓度及样品性质（例如可溶性蛋白、膜蛋白或纤维状蛋白）。对于黏度较高的样品，需要更长的 blotting 时间（例如 5 至 7 秒）。
    1. 重要提示：建立一种可靠且一致的计时方法，可显著提高冷冻过程的重复性。
  8. 将左右手的拇指与食指向相反方向移动，以“弹开”的动作迅速将 blotting 纸从载网表面移开。立即踩下脚踏开关，释放 plunge 臂，使载网迅速浸入液态乙烷中。
    1. 应尽可能同时完成移除 blotting 纸和踩下脚踏开关的操作，以获得最佳冷冻效果。从移除 blotting 纸到 plunge 之间的延迟越长，薄膜蒸发越多，载网间的重复性越差。
  9. 用一只手稳定夹持镊子，小心地将缠绕在镊子和手动 plunge 装置臂上的胶带解开。
    1. 操作过程中应始终与镊子保持接触，防止镊子-载网组件移动，避免因载网碰撞固态乙烷而导致损伤。
  10. 当夹持镊子从手动 plunge 装置臂上完全释放后，用一只手将镊子 resting 在 plunge 用杜瓦瓶顶部，确保载网仍处于液态乙烷中。小心地将塑料夹具从载网处滑开，以便转移载网。持续对镊子施加压力以固定载网。
    1. 以一个快速连贯的动作，迅速将载网从乙烷容器转移至液氮（LN2）储存罐中。小心地将载网放入载网储存盒内。
      注意：部分乙烷可能在载网表面凝固。略微张开镊子可破碎乙烷，使载网顺利落入储存盒中。
  11. 用一块精细擦拭纸包裹镊子尖端，防止结霜。将镊子放置一旁，直至其恢复至室温。
    1. 建议准备 4 至 6 把镊子以方便使用。每把镊子用于一次样品冷冻后需待其回温，方可再次使用。
  12. 对每一块载网重复步骤 6.1–6.11。
  13. 完成所有冷冻操作后，牢固关闭载网盒，并将其转移至适当的储存位置。
  14. 小心处理废弃的液态乙烷和液氮（LN2），并将所有材料存放于干燥处。

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结果

成功执行此处所述的 blot-and-plunge 操作方案后，将形成一层薄而均匀的玻璃态冰，无任何六方冰、污染物以及不可用冰的大范围梯度，这些特征可在电子显微镜下观察到（图3）。若 blotting 纸与载网表面接触不一致、过早移除 blotting 纸，或在与载网接触过程中移动 blotting 纸，均会降低玻璃态冰的质量，并导致电镜载网上冰层厚度不均（图4）

冷冻电子显微镜设备装置，包括冷冻浸入装置、湿度计和镊子。
图1：样品浸入室及所需设备。A） 本文所...

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讨论

用于单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）成像的生物样品玻璃化冷冻，仍是成功进行结构解析的关键步骤。本方案所述的手动 blot-and-plunge 方法是一种经济、可靠且稳健的技术，可快速将生物样品冷冻在适于 cryoEM 成像的薄层玻璃态冰中。通过本文稿所述方法，研究人员将能够组装和操作手动冷冻装置，制备适用于生物样品快速冷冻的冷冻剂，并手动对载有生物样品的电镜载网进行 blot-and-plunge 操作。尽管该方法具有较强的稳健性，但在关键步骤中仍需谨慎操作，以获得适用于高分辨率成像的最佳冰层厚度和质量。下文列出了若干关键步骤，并提供了相应的故障排除建议。

必须正确放置手动冲压臂，以确保在冲入后载网位于黄铜容器内液态乙烷的中心位置。若冲压臂的高度或位置不当，或未正确固定镊子，均可能导致夹紧镊子、电镜载网甚至手动冲压装置的损坏。如上所述，我们在制备生物样品前总会至少进行一次试运行，以确认成功冲入后电镜载网能够准确位于黄铜乙烷容器的中心（图1C）。此外，每次载网冷冻后，我们还会对冲压杜瓦瓶的位置进行微调，以优化载网在乙烷...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

感谢Herzik实验室成员对本文稿及视频内容进行的深入思考和反馈。M.A.H.Jr. 的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）R35 GM138206项目资助，并获得Searle学者项目支持。H.P.M.N. 受分子生物物理学培训项目（NIH T32 GM008326）资助。我们还要感谢斯克里普斯研究所的Bill Anderson、Charles Bowman以及Gabriel Lander博士在视频中所示手动冲压器的设计、组装和测试过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4 槽网格储存盒Ted Pella160-40
14 号平头金属移液头AmazonB07M7YWWLT
22x22 mm 方形玻璃盖玻片SigmaC9802-1PAK
用于储存网格的 60 mm 玻璃培养皿Fisher08-747A
用于储存 Whatman 滤纸的 100 mm 玻璃培养皿Fisher08-747D
用于储存 Whatman 滤纸的 150 mm 玻璃培养皿Fisher08-747F
250 mL 烧杯Fisher02-555-25B
蓝色泡沫聚苯乙烯杜瓦瓶Spear LabFD-500
黄铜乙烷容器Lasco17-4075
夹持镊子Ted Pella38825
精密任务擦拭纸Fisher06-666
带控制阀的双级调节器AirgasY12N245D580-AG
杜瓦瓶网格底座UCSD
乙烷平台UCSD
乙烷丙烷气罐PraxairET PR50ZU-G高压气罐中含乙烷（50%）: 丙烷（50%）
乙烷气罐PraxairUN1035乙烷（100%）
带柔性臂的工作台灯AmscopeLED-11CR
网格（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 目）Electron Microscopy SciencesQ325AR1.3
加湿器Target719438
湿度计ThermoProB01H1R0K68
实验服UCSD
液氮杜瓦瓶WorthingtonLD4
液氮手套Fisher19-059-925
手动冲压装置支架（黑色支架 + 脚踏板）UCSD
Mark 5（浸入式平台）UCSD
腈类手套VWR82026-424
P20 移液器Eppendorf13-690-029
PCR 管EppendorfE0030124286
移液器吸头ibis scientific63300005
环形灯AmazonB07HMR4H8G
护目镜UCSD
剪刀AmazonFiskars 01-004761J
螺丝刀Ironside354711
胶带Fisher15-901-10R
用于转移网格盒的镊子AmazonLTS-3
Tygon 软管Fisher14-171-130
Whatman 吸水滤纸Fisher1001-090

参考文献

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