生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

摘要

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。

摘要

利用电子对生物样品进行成像，以通过单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）实现高分辨率结构解析，需要将目标生物分子包埋在一层薄薄的玻璃态冰中。尽管近年来多项技术进步已推动单颗粒cryoEM成为结构生物学的前沿手段，但样品玻璃化制备方法往往仍是实现高分辨率成像的限速步骤。尽管近期已有大量研究致力于克服样品玻璃化过程中常遇到的困难，包括开发新型样品支撑膜和创新的玻璃化设备，但由于成本低廉且操作简便，传统的手动操作冷冻装置在cryoEM领域仍被广泛使用。本文提供了使用标准剪刀式手动 blot-and-plunge 装置制备适用于单颗粒cryoEM高分辨率成像的生物样品的详细方法。此外，还描述了常见问题及当标准制备方法未能获得合适样品时的故障排查建议。

引言

单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）是一种强大的结构生物学技术，可用于解析动态生物样品的近原子分辨率结构^1,2,3,4。事实上，近年来直接电子探测器技术^{4,5,6,7,8,9,10}、电子源性能的提升^{4,11,12,13,14}以及电磁透镜稳定性的改进¹⁵

方案

1. 准备手动冷冻环境

注意：预计操作时间：5-30 分钟

1. 在4 °C 冷室，其中可放置加湿器以维持接近 100% 相对湿度（RH）的环境（图1A).
   警告：请查阅所在机构的环境健康与安全指南，以确定手动冷冻装置的安全使用位置及推荐操作规程。
2. 在制备载网前，开启冷室内的加湿器，确保冷室的相对湿度 ≥ 95 %。
   注意：在低湿度条件下制备载网可能导致薄膜脱水、缓冲液成分因蒸发而改变，以及载网间重复性的降低⁴⁶不建议将载网冷冻在 <80 % RH
3. 确保冷室的温度为 4 °C.
4. 将手动冲压装置放置在远离强气流的位置（例如远离空调出风口），因为强气流可能导致载网附近产生湍流和/或在冷表面形成明显的冰层积累。

2. 准备冷冻载样材料和配件

注意：预计操作时间：1-5 分钟

1. 使用干净的剪刀将滤纸剪成宽1-1.5 cm、长约9 cm的条状。避免触碰滤纸中心区域，并丢弃较小的边角料。务必确保滤纸条干燥、洁净且无污染物。将滤纸条分开后放入一个100 mm的培养皿中。
2. 将一块22×22....

结果

成功执行此处所述的 blot-and-plunge 操作方案后，将形成一层薄而均匀的玻璃态冰，无任何六方冰、污染物以及不可用冰的大范围梯度，这些特征可在电子显微镜下观察到（图3）。若 blotting 纸与载网表面接触不一致、过早移除 blotting 纸，或在与载网接触过程中移动 blotting 纸，均会降低玻璃态冰的质量，并导致电镜载网上冰层厚度不均（图4）

图1：样品浸入室及所需设备。A） 本文所.......

讨论

用于单颗粒冷冻电子显微镜（cryoEM）成像的生物样品玻璃化冷冻，仍是成功进行结构解析的关键步骤。本方案所述的手动 blot-and-plunge 方法是一种经济、可靠且稳健的技术，可快速将生物样品冷冻在适于 cryoEM 成像的薄层玻璃态冰中。通过本文稿所述方法，研究人员将能够组装和操作手动冷冻装置，制备适用于生物样品快速冷冻的冷冻剂，并手动对载有生物样品的电镜载网进行 blot-and-plunge 操作。尽管该方法具有较强的稳健性，但在关键步骤中仍需谨慎操作，以获得适用于高分辨率成像的最佳冰层厚度和质量。下文列出了若干关键步骤，并提供了相应的故障排除建议。

必须正确放置手动冲压臂，以确保在冲入后载网位于黄铜容器内液态乙烷的中心位置。若冲压臂的高度或位置不当，或未正确固定镊子，均可能导致夹紧镊子、电镜载网甚至手动冲压装置的损坏。如上所述，我们在制备生物样品前总会至少进行一次试运行，以确认成功冲入后电镜载网能够准确位于黄铜乙烷容器的中心（图1C）。此外，每次载网冷冻后，我们还会对冲压杜瓦瓶的位置进行微调，以优化载网在乙烷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4 槽网格储存盒	Ted Pella	160-40
14 号平头金属移液头	Amazon	B07M7YWWLT
22x22 mm 方形玻璃盖玻片	Sigma	C9802-1PAK
用于储存网格的 60 mm 玻璃培养皿	Fisher	08-747A
用于储存 Whatman 滤纸的 100 mm 玻璃培养皿	Fisher	08-747D
用于储存 Whatman 滤纸的 150 mm 玻璃培养皿	Fisher	08-747F
250 mL 烧杯	Fisher	02-555-25B
蓝色泡沫聚苯乙烯杜瓦瓶	Spear Lab	FD-500
黄铜乙烷容器	Lasco	17-4075
夹持镊子	Ted Pella	38825
精密任务擦拭纸	Fisher	06-666
带控制阀的双级调节器	Airgas	Y12N245D580-AG
杜瓦瓶网格底座	UCSD
乙烷平台	UCSD
乙烷丙烷气罐	Praxair	ET PR50ZU-G	高压气罐中含乙烷（50%）: 丙烷（50%）
乙烷气罐	Praxair	UN1035	乙烷（100%）
带柔性臂的工作台灯	Amscope	LED-11CR
网格（UltrAufoil R 1.2/1.3 300 目）	Electron Microscopy Sciences	Q325AR1.3
加湿器	Target	719438
湿度计	ThermoPro	B01H1R0K68
实验服	UCSD
液氮杜瓦瓶	Worthington	LD4
液氮手套	Fisher	19-059-925
手动冲压装置支架（黑色支架 + 脚踏板）	UCSD
Mark 5（浸入式平台）	UCSD
腈类手套	VWR	82026-424
P20 移液器	Eppendorf	13-690-029
PCR 管	Eppendorf	E0030124286
移液器吸头	ibis scientific	63300005
环形灯	Amazon	B07HMR4H8G
护目镜	UCSD
剪刀	Amazon	Fiskars 01-004761J
螺丝刀	Ironside	354711
胶带	Fisher	15-901-10R
用于转移网格盒的镊子	Amazon	LTS-3
Tygon 软管	Fisher	14-171-130
Whatman 吸水滤纸	Fisher	1001-090