重组Ca2+-ATP酶N域中色氨酸残基的化学修饰用于研究色氨酸-ANS荧光共振能量转移

摘要

ANS 结合到 Ca²⁺-ATP酶的重组N结构域。在295 nm波长激发下，荧光光谱呈现出类似FRET的模式。NBS介导的Trp化学修饰会淬灭N结构域的荧光，从而导致Trp残基与ANS之间无法发生能量转移（FRET）。

摘要

肌浆网/内质网钙泵²⁺-ATP酶（SERCA）是一种P型ATP酶，已在其多种构象状态下获得晶体结构。然而，仍可通过分离的重组结构域获取详细的功能信息。经基因工程改造（Trp552Leu和Tyr587Trp）的重组核苷酸结合结构域（N-结构域）在配体结合时表现出荧光猝灭现象。一种外源性荧光探针，即8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS），通过与Arg、His、Ala、Leu和Phe残基的静电和疏水相互作用结合于核苷酸结合位点。当激发波长（λ）为370 nm时，荧光强度的增加可作为ANS结合的证据。然而，当激发波长为295 nm时，荧光强度的增加似乎与N-结构域本征荧光的猝灭相偶联。荧光光谱呈现出类似 Förster 共振能量转移（FRET）的模式，提示存在Trp-ANS FRET对，这可能得益于Tyr587Trp与ANS之间较短的距离（约20 Å）。本研究描述了一种通过Trp化学修饰（及荧光猝灭）介导的Trp-ANS FRET对分析方法 NN-溴代琥珀酰亚胺（NBS）。在化学修饰的N端结构域中，当激发波长为295 nm时，ANS荧光增强，这与在370 nm激发时的结果相似。因此，通过NBS介导的Trp残基化学修饰可用于检测Trp与ANS之间不存在荧光共振能量转移（FRET）的情况。在缺乏Trp荧光的情况下，不应观察到ANS荧光的增强。利用NBS对蛋白质中Trp残基进行化学修饰，可能有助于研究靠近结合态ANS的Trp残基之间的FRET。该检测方法在使用其他荧光探针时也可能具有应用价值。

引言

荧光共振能量转移（FRET）已成为研究蛋白质结构与功能中分子结合或相互作用后确定分子结构间距离的标准技术^1,2,3,4。在P型ATP酶的研究中，FRET已被用于探究肌质网/内质网Ca²⁺-ATP酶（SERCA）的结构与功能^2,5,6,7,8，例如，已通过FRET分析整个蛋白在催化循环过程中的结构波动⁷。

FRET 供体种类多样，从小分子荧光（外源性）分子到荧光蛋白均有应用^9,10。色氨酸（Trp）残基因其荧光特性，可用于识别蛋白质氨基酸序列中的结构变化^11,<....

方案

1. ANS 与 SERCA N 结构域相互作用的确定（in silico）

1. 使用首选的蛋白质建模软件通过分子建模生成蛋白质（SERCA N-结构域）的三维（3D）结构⁵⁰。
2. 使用首选的分子结构分析软件识别构成核苷酸结合位点的氨基酸残基⁵¹，并确定其中是否存在 Arg 和 Lys 残基³⁵；这些残基对 ANS 的结合以及荧光强度（量子产率）的增强至关重要。
3. 进行分子对接（使用首选的对接软件）^52,53,54，以确定 ATP、异硫氰酸荧光素（FITC）（其与 Lys515 形成共价键，标记核苷酸结合位点）以及 ANS 与核苷酸结合位点内氨基酸残基之间的相互作用（图 1）。
4. 使用首选软件中的测量工具计算 Trp 残基与结合态 ANS 之间的分子距离（Å）。
5. 对 ANS-N-结构域复合物进行分子动力学模拟，以确定相互作用的稳定性^52,

结果

分子对接显示，ANS通过静电作用以及疏水相互作用结合到N结构域的核苷酸结合位点（图1）。Trp残基与结合在核苷酸结合位点的ANS之间的分子距离（20 Å）支持FRET的发生（图1）。通过亲和层析获得了高纯度的（经设计/改造的）重组N结构域（图2），适用于荧光实验。ANS-N结构域复合物的荧光光谱在λ=295 nm激发时呈现出类似FRET的模式（图3A）。利用NBS对Trp残基进行化学修饰导致N结构域的本征荧光被淬灭（图3B）。在经NBS化学修饰的N结构域中，实验结果表明，在λ=295 nm激发时，ANS荧光增强（图3C），这与未修饰的N结构域中观察到的结果相似（图3A）。因此，如先前研究所提示的，在λ=295 nm处对ANS.......

讨论

当在波长（λ）295 nm 处激发时，ANS-N 结构域复合物的荧光光谱呈现出类似 Förster 共振能量转移（FRET）的模式，而色氨酸残基与 ANS 之间的分子距离（20 Å）似乎支持 FRET 的发生（图 1）。通过 N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）对色氨酸进行化学修饰后，N 结构域的荧光减弱（图 3B，光谱 f）；因此，能量转移无法进行。当在波长（λ）295 nm 处激发时，ANS 的荧光光谱与未经修饰的 N 结构域相似（图 3A 和 C）。

因此，当 ANS 结合到 ATP 结合位点时，在波长（λ）为 295 nm 处对 ANS 的直接激发是 ANS 荧光的主要来源（图 3C），这与先前其他作者提出的机制一致²⁸。因此，在 N 结构域-ANS 复合物中，色氨.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺	Bio-Rad	1610107	SDS-PAGE
过硫酸铵	Bio-Rad	1610700	SDS-PAGE
8-苯胺基-1-萘磺酸	Sigma-Aldrich	A1028	荧光探针
双丙烯酰胺	Bio-Rad	1610125	SDS-PAGE
N-溴代琥珀酰亚胺	Sigma-Aldrich	B81255	化学修饰
N,N-二甲基甲酰胺	J.T. Baker	9213-12	储备液配制
异硫氰酸荧光素	Sigma-Aldrich	F7250	化学荧光标记
荧光比色皿	Hellma	Z801291	荧光检测
荧光分光光度计	Shimadzu	RF 5301PC	荧光检测
HisTrap™ FF	GE Healtcare	11-0004-59	蛋白质纯化
IPTG，无二噁烷	American Bionalytical	AB00841-00010	蛋白质表达
咪唑	Sigma-Aldrich	I5513-25G	蛋白质纯化
LB培养基	Fisher Scientific	10000713	细胞培养
Pipetman L P10L	Gilson	FA10002M	荧光检测
Pipetman L P100L	Gilson	FA10004M	荧光检测
Pipetman L P200L	Gilson	FA10005M	荧光检测
Pipetman L P1000L	Gilson	FA10006M	荧光检测
Pipetman L P5000L	Gilson	FA10007	荧光检测
Precision plus 标准蛋白	Bio-Rad	1610374	SDS-PAGE
十二烷基硫酸钠	Bio-Rad	1610302	SDS-PAGE
磷酸氢二钠	J.T. Baker	3828-19	缓冲液配制
磷酸二氢钠	J.T. Baker	3818-01	缓冲液配制
0.2 µm 注射式滤器	Millipore	GVWP04700	溶液过滤
TEMED	Bio-Rad	1610801	SDS-PAGE
Tris	Bio-Rad	1610719	SDS-PAGE