一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

摘要

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。

摘要

肠道组织的结构促进了宿主与肠道微生物群之间密切且互惠的相互作用。这些相互对话对于维持局部和全身的稳态至关重要；肠道微生物群组成的变化（即菌群失调）与多种人类疾病相关。研究宿主-微生物群相互作用的方法在保留生理组织结构（如使用体内动物模型）与实验因素的可控程度（如简单的体外细胞培养系统）之间存在固有的权衡。为解决这一权衡问题，Yissachar 等人近期开发了一种肠道类器官培养系统。该系统既保留了天然结肠组织的结构和细胞机制，又实现了严格的实验控制，便于开展难以在体内直接进行的实验。该系统非常适合研究肠道各组分（如上皮、免疫和神经元件）对管腔扰动（包括厌氧或需氧微生物、来自小鼠或人类的完整微生物群样本、药物和代谢物）的短期反应。本文详细描述了一种利用定制肠道培养装置对多个肠道片段进行类器官培养的优化方案。通过组织切片或整体组织片段的免疫荧光染色、荧光原位杂交（FISH）或延时成像，可直观观察宿主对管腔扰动的反应。该系统支持多种检测手段，包括高通量测序、流式细胞术以及多种细胞和生化检测。总体而言，这一三维类器官培养系统可支持大块完整肠道组织的培养，在局部肠道环境中对宿主-微生物群相互作用进行高分辨率分析和可视化方面具有广泛的应用前景。

引言

肠道是一个高度复杂的器官，包含多种细胞类型（上皮细胞、免疫细胞、神经元等），这些细胞以特定结构排列，使细胞之间以及细胞与管腔内容物（微生物群、食物等）能够相互作用和交流。¹目前，可用于分析宿主-微生物群相互作用的研究工具包包括 体外 细胞培养和 体内 动物模型². 在体 动物模型提供了生理性的组织构建³ 但实验控制较差，且对实验条件的调控能力有限。 体外 另一方面，培养系统可使用原代细胞或细胞系，并可添加微生物⁴，可对实验参数进行精确控制，但缺乏细胞复杂性和组织结构。现代 体外 检测方法使得能够深入利用健康与病理状态的人体组织样本，例如源自小鼠或人类的上皮类器官^5,6以及模拟黏膜微环境的样本⁷另一个例子是“肠道芯片”检测，该检测包含人结肠上皮细胞系（Caco2）、细胞外基质和微流控通道，用以模拟肠道的生理条件⁸。然而，尽管其先进与创新程度 体外 无论样本如何，它们都无法维持正常的组织结构或原始的细胞组成。

方案

本方案遵循动物福利伦理委员会批准的动物护理指南。

1. 实验准备

1. 肠道类器官培养装置的制备（3天）
   1. 使用3D打印机打印可重复使用的塑料模具，用于器官培养装置（该装置包含6个孔，24个大小孔洞）以及装置盖（3D文件已附）。
      注意：这些塑料模具可用于制备多种装置。
   2. 插入平头针头（22 G） &将18号针头（#38; 18 G）置于装置模具内的适当位置，然后浇注约20 g的聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物（基础剂与催化剂质量比为1:10），用于制作一套装置及其盖子。
   3. 将模具放入真空室中抽真空30分钟，以去除PDMS混合物中的气泡。
   4. 在55 °C下过夜孵育模具，以完成PDMS聚合。
   5. 当PDMS固化后，从模具中拔出针头，并小心地将培养装置和盖子从塑料模具中取出。
   6. 使用手术刀去除微孔边缘的PDMS残留物。将PDMS装置及其盖板用无毒硅胶粘合剂固定在盖玻片（75 mm × 50 mm显微载玻片）上，并静置过夜固化（将胶水涂于装置的光滑面）。
   7. 插入12根22 G针头用于管腔，12根18 G针头用于外室。使用硅胶固定所有针头，并静置过夜使其固化。在盖子上插入两根18 G针头，以确保肠道器官培养装置内外空气流通顺畅。
   8. 使用装有水的注射器检查所有针头是否泄漏。通过向孔中注水检查孔是否....

结果

肠道类器官培养系统维持组织活力 离体 组织活力的评估贯穿整个培养过程。结肠组织碎片在肠道器官培养系统中孵育，并在培养2/12/24小时后固定。通过E-cadherin和细胞角蛋白-18抗体的免疫荧光染色验证肠上皮细胞（IEC）层的完整性。同时，检测结肠上皮中充满黏液的杯状细胞以及管腔内的黏液分泌情况，并通过Ki-67染色标记结肠隐窝中增殖的IEC细胞以评估其增殖活性。图2）。这些结果及其他研究结果⁹ 表明肠道培养系统可维持肠道功能与结构 离体.

肠道定植分段丝状细菌（SFB）可触发宿主快速的转录反应。本研究采用两种不同的免疫调节性肠道微生物定植，以探究肠道内初始事件的发生。主要使用的微生物为分段丝状细菌（SFB），该菌此前已被证实可诱导小肠中Th17细胞的分化。¹³无SFB的SPF小鼠处死后，解剖获取小肠（SI）片段（回肠），并连接至肠道器官培养系统。由于SFB难以培养 体外.......

讨论

本文描述了一种优化的实验方案 离体 Yissachar 等人近期开发的肠道器官培养技术（已发表）⁹ 以及未发表数据）。肠道类器官培养系统可支持完整肠段的多重培养，同时维持管腔内液体流动。该系统可完全控制管腔内外环境（包括刺激剂量、暴露时间和流速），并保持肠道组织的原始结构及其细胞复杂性⁹.

方案中的关键步骤包括以下内容。（1）组织解剖应尽可能快速且轻柔地进行，以最大限度减少组织损伤（组织损伤可能导致细胞死亡以及管腔内容物通过受损部位泄漏）。（2）通过将输入端口连接至近端结肠、输出端口连接至结肠远端，以在装置中维持组织的正确方向。（3）将肠道连接至装置后，需确认组织完整，且与管腔内端口的连接处无泄漏。这可确保细菌刺激局限于管腔内，避免污染外部环境，外部环境应尽可能保持无菌状态。（4）组织应取自12–14日龄的小鼠。在更年幼的小鼠中，结肠更小且更脆弱，需采用不同的操作和培养条件（数据未显示）。而年长小鼠的组织显著更大，会影响组织存活率和培养持续时间。（5）为降低肠道反应的变.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
18号钝针	Mcmaster	75165a754
22号钝针	Mcmaster	75165a758
通用密封胶 100%硅酮	DAP	688
立方真空干燥器 VDC-21+ 2层搁板		AAAD4021
1 mm厚玻璃载片	Corning	2947-75X50
迷你培养箱 im-10		AAH24315K
MPC 301E 真空泵		VI-412711
塑料快旋式管接头插头	Mcmaster	51525k121
塑料快旋式管接头插座	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Dow		聚二甲基硅氧烷，PDMS
管路	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE，Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 材料：z-ultrat	Zortrax
培养基
B27添加剂（50倍浓度），无血清	Thermo Fisher Scientific	17504044
HEPES缓冲液（1 M）	Thermo Fisher Scientific	15630056
含酚红的Iscove改良Dulbecco培养基（1倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	12440061
Knock-Out血清替代物	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2添加剂（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	A1370701
非必需氨基酸（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	11140035
手术工具
大剪刀	Aseltech	11-00-10
尖头镊子	F.S.T	11297-10
编织丝线手术缝合线	SMI	8010G
直剪刀	F.S.T	14091-09
细镊子	F.S.T	11051-10
器官系统
0.1 µm 滤膜	Life Gene
0.22 µm 滤膜	Life Gene
5 mL 鲁尔锁注射器	B-D	309649
Greenough体视显微镜	ZEISS	Stemi 305
循环式精密空气加热器 "CUBE"		CUBE-2-LIS
注射泵	new era pump systems inc	nep-ne-1600-em