本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。
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本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）因其携带源自细胞来源（如血小板裂解物，PL）的内容物，被广泛应用于各类研究，以验证其作为无细胞治疗手段的潜力。作为治疗剂使用时，EVs 预期可进入靶细胞并引发相应的生物学反应。本研究探讨了源自血小板裂解物的 EVs 作为骨关节炎（OA）无细胞治疗策略的可行性。为此，建立了一种标记 EVs 并检测其在软骨组织外植体中摄取情况的方法。源自 PL 的 EVs 使用脂溶性染料 PKH26 进行标记，经柱层析纯化洗涤两次后，用于后续实验 体外 炎症驱动的 在通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行颗粒定量后，建立OA模型并持续观察5小时。每小时将软骨组织块固定、石蜡包埋，并切成6 µm厚的切片，置于载玻片上，随后在共聚焦显微镜下观察。该方法可用于验证此期间内EVs是否进入靶细胞（软骨细胞），并分析其直接作用。
引言
骨关节炎（OA）是一种关节退行性疾病，表现为关节软骨细胞外基质进行性且不可逆的炎症与破坏1。尽管多种类型的关节炎已有多种治疗方法2,3,4，但这些方法常受限于副作用和疗效有限。利用自体软骨细胞移植的组织工程技术已常规应用于早期OA软骨损伤的再生治疗4。基于细胞的治疗策略主要受限于表型稳定的软骨细胞或软骨祖细胞数量有限，难以有效修复软骨3。因此，开发新的治疗策略以阻止疾病进展并促进大面积软骨损伤的再生具有重要意义。
不同作者已提出将细胞外囊泡（EVs）作为骨关节炎（OA）的治疗方法5,6。EVs 是由大多数细胞类型分泌的膜性结构，参与细胞间信号传导，并已被证明可介导干细胞的治疗作用7,8,9，因此近年来在再生医学领域引起了广泛关注
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方案
注意：软骨组织外植体来自 IdISBa 生物样本库（IB 1995/12 BIO），该项目已获得 CEI-IB（IB 3656118 PI）的伦理批准，并遵循机构指南获取。
1. 柱层析柱的制备
- 按照制造商的说明或以下步骤平衡层析柱：
- 取下层析柱帽，对层析柱进行平衡，并通过洗脱去除保存缓冲液。
- 用 2.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤层析柱 3 次。每次洗涤时，等待层析柱完全吸收全部体积。
注意：切勿让层析柱变干。 - 最后一次洗涤后，用帽盖住层析柱，直至进行样品制备。
2. 细胞外囊泡标记
注意：本实验所用的细胞外囊泡（EV）标记方案，采用的是先前通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离得到的PL-EV样本，分离条件如前所述21,22。然而，本方案适用于任何来源的EV样本。
- 使用浓缩管浓缩EV样本和对照样本（PBS）。
- 根据EV样本的起始体积，将样本置于15 mL或500 µL的浓缩管中。按照制造商的说明进行离心，直至获得几乎干燥的样本。
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结果
EV标记及摄取监测的示意图见图1。表1中通过NTA检测到的颗粒浓度和EV大小显示，由于使用柱子标记后进行了两次纯化步骤，EV浓度在过程中有所下降。然而，所获得的量仍处于用于治疗时所需颗粒数的最佳范围内。该颗粒浓度用于计算用于处理骨关节炎软骨外植体的PKH-PL-EV及对照的体积。
在软骨外植体经EVs处理或对照组处理后，分别固定不同时间：0、1、2、3、4和5 h。随后对各组样本进行石蜡包埋、切片，并用含DAPI的封片剂进行封片，以备共聚焦显微镜观察。每个时间点各组的代表性图像见图2，显示EVs随时间推移进入组织并最终到达软骨细胞并进入其中的过程。
如图所示 图2，经标记的EVs在孵育1小时后已定位于软骨细胞（DAPI染色显示为蓝色）周围（PKH26染料显示为红色）。对照组中可见少量背景荧光，该组未添加EVs，但其余.......
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讨论
细胞外囊泡（EV）成像有助于理解EV的特性，例如其释放和摄取机制。通过成像可监测EV在体内的生物分布，并表征其作为药物载体的药代动力学特性。然而，由于EV体积微小，对其进行成像和追踪可能具有挑战性，尽管目前已开发出多种成像设备和标记技术，以帮助研究人员在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下监测EV23,24,25。
通过光学显微镜追踪细胞外囊泡（EVs）存在两种可能的方法：生物发光成像和荧光成像。这两种方法均用于在可见光光谱范围（390–700 nm）内检测EVs。生物发光是一种化学发光，由荧光素酶催化其底物氧化后产生。尽管该信号的检测需要超灵敏的电荷耦合器件（CCD）相机，但由于无需外部光源激发，其信噪比较高26。
荧光成像利用蛋白质或有机.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）资助，并由欧洲社会基金（ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助（项目编号：MS16/00124；CP16/00124）；由“人才提升”项目（TALENT PLUS）中的“青年计划”（PROGRAMA JUNIOR）资助（项目编号：JUNIOR01/18），该计划由巴利阿里群岛可持续旅游税提供资金；由巴利阿里政府研究厅（Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear）资助（项目编号：FPI/2046/2017）；由FUTURMed框架下的FOLIUM博士后项目（FOLIUM 17/01）资助，该项目50%资金来自巴利阿里群岛可持续旅游税，50%来自欧洲社会基金（ESF）；以及由巴利阿里群岛血液与组织库基金会教学与研究委员会（Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears）资助（项目编号：CDI21/03）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 1.5 mL 离心管 | SPL生命科学 | PLC60015 | |
| 1 mL 注射器 BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-丙醇（异丙醇） | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | 用超纯水配制至20% |
| 96孔培养板 | SPL生命科学 | PLC30096 | |
| 无水乙醇 Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | 用于使用 Milli-Q 水配制 96% 和 75% 乙醇 |
| 3 mm 带推杆活检穿刺针 | Scandidact | MTP-33-32 | |
| 牛血清 白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7030 | 用PBS配制为5% |
| 软骨外植体 | IdISBa 生物样本库 | ||
| 15 mL Nanosep 100 kD Omega 浓缩管 | 帕尔 | MCP100C41 | |
| 500 离心管浓缩法 µL Nanosep 100 kD Omega | 帕尔 | OD003C33 | |
| 盖玻片 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX 培养基 | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| 包埋的石蜡组织块 | IdISBa 生物样本库 | 按服务收费 | |
| Exo-Spin mini-HD 柱 | 细胞导向系统 | EX05 | |
| Feather S35 微切片刀片 | 羽毛 | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm 注射器滤器 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| 含DAPI的Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| 人肿瘤素M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | 配制储备液，使其终浓度为 0.1 µ克/µL 用 PBS-0.1% BSA 稀释 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | 用 PBS 配制成 4% 溶液，4 ℃ 保存 °C |
| 青霉素-链霉素溶液 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记） | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 和 Dliuent C 包含在内 |
| 柠檬酸钠二水合物 | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D系统 | 210-TA-005 | 配制储备液，使其终浓度为 0.01 µ克/µL 用 PBS-0.1% BSA 稀释 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用 Milli-Q 水配制 0.1% Triton-0.1% 柠檬酸钠溶液 |
| 二甲苯 | Scharlab | XI0050005P | |
| <强>仪器设备 | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 转子 |
| NanoSight NS300 | 马尔文 | NS300 | 嵌入式激光装置 λ= 532 nm 和相机 sCMOS |
| Shandon Finesse 325 手动切片机 | 赛默飞世尔科技™ | A78100101 | |
| TCS-SPE 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | 5200000271 |
参考文献
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
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重印与许可
