本文介绍了一种用于标记血小板裂解物来源的细胞外囊泡的实验方案，以监测其在骨关节炎模型——软骨组织外植体中的迁移和摄取情况。
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）因其携带源自细胞来源（如血小板裂解物，PL）的内容物，被广泛应用于各类研究，以验证其作为无细胞治疗手段的潜力。作为治疗剂使用时，EVs 预期可进入靶细胞并引发相应的生物学反应。本研究探讨了源自血小板裂解物的 EVs 作为骨关节炎（OA）无细胞治疗策略的可行性。为此，建立了一种标记 EVs 并检测其在软骨组织外植体中摄取情况的方法。源自 PL 的 EVs 使用脂溶性染料 PKH26 进行标记，经柱层析纯化洗涤两次后，用于后续实验 体外 炎症驱动的 在通过纳米颗粒追踪分析（NTA）进行颗粒定量后，建立OA模型并持续观察5小时。每小时将软骨组织块固定、石蜡包埋，并切成6 µm厚的切片，置于载玻片上，随后在共聚焦显微镜下观察。该方法可用于验证此期间内EVs是否进入靶细胞（软骨细胞），并分析其直接作用。
引言
骨关节炎（OA）是一种关节退行性疾病，表现为关节软骨细胞外基质进行性且不可逆的炎症与破坏1。尽管多种类型的关节炎已有多种治疗方法2,3,4，但这些方法常受限于副作用和疗效有限。利用自体软骨细胞移植的组织工程技术已常规应用于早期OA软骨损伤的再生治疗4。基于细胞的治疗策略主要受限于表型稳定的软骨细胞或软骨祖细胞数量有限，难以有效修复软骨3。因此，开发新的治疗策略以阻止疾病进展并促进大面积软骨损伤的再生具有重要意义。
不同作者已提出将细胞外囊泡（EVs）作为骨关节炎（OA）的治疗方法5,6。EVs 是由大多数细胞类型分泌的膜性结构，参与细胞间信号传导，并已被证明可介导干细胞的治疗作用7,8,9，因此近年来在再生医学领域引起了广泛关注10。来源于间充质基质细胞（MSCs）的EVs是目前针对OA研究最主要的治疗性EVs，尽管也有使用其他关节相关细胞作为EV来源的报道，例如软骨祖细胞或免疫细胞11,12。
血小板浓缩物（如血小板裂解物，PLs）因其含有的细胞外囊泡（EV）成分可能对促进不同类型的损伤修复具有作用，已被用于改善角膜溃疡13,14,15或肌腱组织再生16等疾病的愈合过程17。一些针对关节相关疾病的研究将血小板来源的细胞外囊泡（PL-EVs）作为治疗手段，以缓解骨关节炎症状。PL-EVs可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖和细胞迁移18，促进骨关节炎软骨细胞中软骨生成标志物的表达19，或在经PL-EVs治疗的骨关节炎兔模型中表现出更高的软骨生成蛋白水平和更少的组织异常18。
EVs 含有可释放至靶细胞的蛋白质、脂质和核酸，介导细胞间通讯，这是与其治疗应用相关的主要特性20。EVs 的作用取决于其到达细胞并随后释放所携带的物质。这种效应可通过细胞发生的变化间接验证，例如代谢活性或基因表达的改变。然而，这些方法无法直观显示 EVs 如何到达细胞并发挥功能。因此，本文介绍了一种标记来源于 PL 的 EVs 的方法，用于治疗炎症诱导的骨关节炎软骨组织外植体。采用共聚焦显微镜对 EVs 被软骨组织外植体中软骨细胞摄取及后续转运的过程进行监测，时间跨度为 5 小时。
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方案
注意：软骨组织外植体来自 IdISBa 生物样本库（IB 1995/12 BIO），该项目已获得 CEI-IB（IB 3656118 PI）的伦理批准，并遵循机构指南获取。
1. 柱层析柱的制备
- 按照制造商的说明或以下步骤平衡层析柱：
- 取下层析柱帽，对层析柱进行平衡，并通过洗脱去除保存缓冲液。
- 用 2.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤层析柱 3 次。每次洗涤时，等待层析柱完全吸收全部体积。
注意：切勿让层析柱变干。 - 最后一次洗涤后，用帽盖住层析柱，直至进行样品制备。
2. 细胞外囊泡标记
注意：本实验所用的细胞外囊泡（EV）标记方案，采用的是先前通过尺寸排阻色谱法（SEC）分离得到的PL-EV样本，分离条件如前所述21,22。然而，本方案适用于任何来源的EV样本。
- 使用浓缩管浓缩EV样本和对照样本（PBS）。
- 根据EV样本的起始体积，将样本置于15 mL或500 µL的浓缩管中。按照制造商的说明进行离心，直至获得几乎干燥的样本。
注意：需要设置对照样本以检测染料背景信号。尽管本方法对初始体积无特殊要求，但应考虑到在纯化步骤中约有10%的颗粒会损失。
- 根据EV样本的起始体积，将样本置于15 mL或500 µL的浓缩管中。按照制造商的说明进行离心，直至获得几乎干燥的样本。
- 用稀释液C重悬浓缩后的样本。将EV样本用200 µL重悬，对照组用100 µL重悬，并转移至新的1.5 mL离心管中。
- 将浓缩的EV样本分为两份，每份100 µL。其中一份标记染料，作为处理组（PKH-PL-EV）；另一份不标记，但与EV样本同样处理（NTA-PL-EV），用于通过NTA定量EV浓度。
- 配制2倍浓度的染料溶液，得到在稀释液C中浓度为8 µM的PKH26溶液。
- 在样本中，按每125 µL稀释液C加入1 µL的1 mM PKH26连接剂的比例混合。准备足够体积，以便以1:1比例加入样本中。
- 以1:1比例向PKH-PL-EV样本和对照样本中加入2倍浓度的染料溶液，使最终染料浓度为1倍，PKH26浓度为4 µM。向NTA-PL-EV样本中加入等体积的PBS。室温孵育5分钟。
- 以1:1比例向样本中加入5%牛血清白蛋白-PBS溶液，确保最终体积约为400 µL。
注意：此步骤可去除非特异性染料相互作用或未结合的游离染料。 - 继续通过层析柱分离标记的EV与未结合的染料及染料的非特异性结合物。
3. 标记EV的分离
- 取下层析柱的盖子，加入 400 µL 样品（PKH-PL-EV、NTA-PL-EV 或对照），弃去所有流出液体。
- 等待样品完全进入层析柱后，再进行下一步操作。加入 600 µL PBS，弃去所有流出液体。
- 等待 PBS 完全进入层析柱后，再进行下一步操作。加入 600 µL PBS，并在 1.5 mL 离心管中收集 600 µL 的洗脱组分（EVs 或对照）。
注意：这些步骤用于去除样品中过量的染料。需要再次进行柱分离以获得更纯的 EVs。因此，后续步骤应在新的平衡柱（步骤 4.1）或经过初步洗涤后的同一根柱子（步骤 4.2）中进行。 - 准备层析柱以进行新的 EV 分离步骤，以获得更纯的 EVs。若使用新柱子，请重复步骤 2.1 和 2.2；若使用同一根柱子，则先用 2.5 mL 20% 异丙醇洗涤柱子，然后重复步骤 2.1 和 2.2。
- 将步骤 2.5 中先前洗脱得到的 600 µL EVs 加入柱子中，并弃去流出体积。等待液体完全进入柱子后，再进行下一步操作。
- 加入 400 µL PBS，并弃去所有流出体积。等待液体完全进入柱子后，再进行下一步操作。
- 加入 600 µL PBS，并在 1.5 mL 离心管中收集 600 µL 的洗脱组分。将 EVs 和对照样品用于后续分析，或在 4 ᵒC 下保存过夜。
- 将使用过的层析柱保存以备将来使用。
- 用 25 mL 20% 异丙醇洗涤柱子，并弃去流出体积。再用 2.5 mL PBS 洗涤柱子 3 次。
- 加入步骤 1.1.1 中移除的保存缓冲液，等待缓冲液完全进入柱子。盖上柱子盖子，并在 4 ᵒC 下保存至下次使用。
4. 细胞外囊泡定量
- 按照以下两个步骤，用 PBS（经 0.2 µm 滤膜过滤）将 NTA-PL-EV 样品和初始 PL-EV 样品分别稀释至 1:1,000。
- 用经 0.2 µm 滤膜过滤的 PBS 制备 1 mL 的 1:10 稀释 NTA-PL-EV 样品和 1 mL 的 1:10 稀释初始 PL-EV 样品。
- 用经 0.2 µm 滤膜过滤的 PBS 将上述已稀释的样品进一步稀释 1:100，制备 1 mL 稀释液。
- 使用无菌注射器将 1:1,000 稀释的 NTA-PL-EV 样品或初始 PL-EV 样品注入 NTA 泵中。按照仪器制造商的说明和建议进行颗粒浓度和粒径分布的测定。
注意：由于 EV 浓度取决于起始样品体积，可能需要检测中间稀释度并进行调整，以获得准确的 NTA 测定结果。
5. 用于治疗炎症驱动型骨关节炎的EVs
- 用 PBS 清洗软骨两次，并在无菌条件下使用直径为 3 mm 的活检打孔器切除软骨。
注意：步骤5.1至5.6需在细胞培养超净台中进行。 - 将外植体置于含有添加了1%青霉素-链霉素的DMEM-F12培养基的96孔培养板中，在37 ᵒC、5% CO₂条件下培养2，以及80%的湿度。
- 为建立炎症驱动的骨关节炎模型，在细胞培养基中添加10 ng/mL的抑癌素M和2 ng/mL的肿瘤坏死因子-α（TNFα）。
- 用 1 × 10 处理外植体9 添加含有标记的细胞外囊泡（PKH-PL-EV）或对照物的细胞培养基，每孔颗粒数为指定数量，并补充oncostatin M和TNFα。
注意：测量含有 1 × 10 的样品体积9 每孔粒子数及对照组使用的体积保持相同。 - 从含有软骨外植体的96孔细胞培养板中移除培养基。向每孔加入200 µL步骤5.3中所述的细胞培养基。
注意：如果 96 孔板曾接触胎牛血清（FBS），需用 200 µL PBS 每孔洗涤三次，以去除 FBS 中的细胞外囊泡（EVs）。 - 停止 体外 在不同时间点进行检测：0、1、2、3、4 和 5 h。
- 用 200 µL PBS 将含有软骨外植体的细胞培养孔洗涤两次。
- 向组织中加入100 µL 4%多聚甲醛（PFA），于4 ᵒC固定3小时。
注意：涉及多聚甲醛（PFA）的操作步骤应在通风橱中进行，并遵循安全数据表（Safety Data Sheet）的建议。 - 去除PFA，加入100 µL PBS，将固定后的组织于4 °C保存，并在48 h内处理样品。
6. 显微镜样品制备与观察
注意：该组织学实验步骤包括脱水、石蜡包埋和复水过程。这些步骤可能会降低染料的整体荧光强度（PKH26 产品说明书提到的局限性之一）。因此，对于通过共聚焦显微镜观察细胞外囊泡（EV），其他实验方法（如冷冻切片）可能更为合适。
- 将固定组织包埋于石蜡块中，切成 6 µm 厚的切片。
- 脱去组织切片中的石蜡。
注意：所有使用二甲苯的步骤均应在通风橱中进行。- 将组织切片依次浸入二甲苯 30 分钟、100% 乙醇 2 分钟、96% 乙醇 2 分钟、75% 乙醇 1 分钟，最后浸入蒸馏水中 30 秒。
- 对组织切片进行通透处理。
- 配制 0.1% Triton-0.1% 柠檬酸钠溶液用于组织通透。每张组织切片上加 20 µL，室温孵育 10 分钟。每张切片用 20 µL PBS 洗涤两次。
- 在载玻片上滴加含 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的水性封片剂，覆盖来自步骤 6.3.1 的含 3 个组织切片的载玻片。
- 将载玻片于室温避光孵育过夜。
- 4 °C 避光保存，直至进行共聚焦显微镜观察。
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结果
EV标记及摄取监测的示意图见图1。表1中通过NTA检测到的颗粒浓度和EV大小显示，由于使用柱子标记后进行了两次纯化步骤，EV浓度在过程中有所下降。然而，所获得的量仍处于用于治疗时所需颗粒数的最佳范围内。该颗粒浓度用于计算用于处理骨关节炎软骨外植体的PKH-PL-EV及对照的体积。
在软骨外植体经EVs处理或对照组处理后，分别固定不同时间：0、1、2、3、4和5 h。随后对各组样本进行石蜡包埋、切片，并用含DAPI的封片剂进行封片，以备共聚焦显微镜观察。每个时间点各组的代表性图像见图2，显示EVs随时间推移进入组织并最终到达软骨细胞并进入其中的过程。
如图所示 图2，经标记的EVs在孵育1小时后已定位于软骨细胞（DAPI染色显示为蓝色）周围（PKH26染料显示为红色）。对照组中可见少量背景荧光，该组未添加EVs，但其余...
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讨论
细胞外囊泡（EV）成像有助于理解EV的特性，例如其释放和摄取机制。通过成像可监测EV在体内的生物分布，并表征其作为药物载体的药代动力学特性。然而，由于EV体积微小，对其进行成像和追踪可能具有挑战性，尽管目前已开发出多种成像设备和标记技术，以帮助研究人员在体外（in vitro）和体内（in vivo）条件下监测EV23,24,25。
通过光学显微镜追踪细胞外囊泡（EVs）存在两种可能的方法：生物发光成像和荧光成像。这两种方法均用于在可见光光谱范围（390–700 nm）内检测EVs。生物发光是一种化学发光，由荧光素酶催化其底物氧化后产生。尽管该信号的检测需要超灵敏的电荷耦合器件（CCD）相机，但由于无需外部光源激发，其信噪比较高26。
荧光成像利用蛋白质或有机...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由西班牙卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）资助，并由欧洲社会基金（ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助（项目编号：MS16/00124；CP16/00124）；由“人才提升”项目（TALENT PLUS）中的“青年计划”（PROGRAMA JUNIOR）资助（项目编号：JUNIOR01/18），该计划由巴利阿里群岛可持续旅游税提供资金；由巴利阿里政府研究厅（Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear）资助（项目编号：FPI/2046/2017）；由FUTURMed框架下的FOLIUM博士后项目（FOLIUM 17/01）资助，该项目50%资金来自巴利阿里群岛可持续旅游税，50%来自欧洲社会基金（ESF）；以及由巴利阿里群岛血液与组织库基金会教学与研究委员会（Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears）资助（项目编号：CDI21/03）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 1.5 mL 离心管 | SPL生命科学 | PLC60015 | |
| 1 mL 注射器 BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-丙醇（异丙醇） | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | 用超纯水配制至20% |
| 96孔培养板 | SPL生命科学 | PLC30096 | |
| 无水乙醇 Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | 用于使用 Milli-Q 水配制 96% 和 75% 乙醇 |
| 3 mm 带推杆活检穿刺针 | Scandidact | MTP-33-32 | |
| 牛血清 白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7030 | 用PBS配制为5% |
| 软骨外植体 | IdISBa 生物样本库 | ||
| 15 mL Nanosep 100 kD Omega 浓缩管 | 帕尔 | MCP100C41 | |
| 500 离心管浓缩法 µL Nanosep 100 kD Omega | 帕尔 | OD003C33 | |
| 盖玻片 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX 培养基 | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| 包埋的石蜡组织块 | IdISBa 生物样本库 | 按服务收费 | |
| Exo-Spin mini-HD 柱 | 细胞导向系统 | EX05 | |
| Feather S35 微切片刀片 | 羽毛 | 43037 | |
| Filtropur S 0.2 µm 注射器滤器 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| 含DAPI的Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F-6057 | |
| 人肿瘤素M | Sigma-Aldrich | O9635-10UG | 配制储备液，使其终浓度为 0.1 µ克/µL 用 PBS-0.1% BSA 稀释 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | 用 PBS 配制成 4% 溶液，4 ℃ 保存 °C |
| 青霉素-链霉素溶液 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒（用于常规细胞膜标记） | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 和 Dliuent C 包含在内 |
| 柠檬酸钠二水合物 | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | 赛默飞世尔科技 | J1800AMNZ | |
| TNFα | R&D系统 | 210-TA-005 | 配制储备液，使其终浓度为 0.01 µ克/µL 用 PBS-0.1% BSA 稀释 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 使用 Milli-Q 水配制 0.1% Triton-0.1% 柠檬酸钠溶液 |
| 二甲苯 | Scharlab | XI0050005P | |
| <强>仪器设备 | |||
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 转子 |
| NanoSight NS300 | 马尔文 | NS300 | 嵌入式激光装置 λ= 532 nm 和相机 sCMOS |
| Shandon Finesse 325 手动切片机 | 赛默飞世尔科技™ | A78100101 | |
| TCS-SPE 共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | 5200000271 |
参考文献
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
- Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), e27(2016).
- Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
- Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
- Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
- Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15(2011).
- D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867(2019).
- Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
- El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
- Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
- Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31 (Suppl 1), 289-292 (2007).
- Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212(2018).
- Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
- Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470(2019).
- Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050(2020).
- Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
- Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014(2019).
- de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
- Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
- Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
- Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91(2018).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432(2001).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029(2015).
- Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
- Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
- Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26(2016).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
- Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. , https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
- Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).
- Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).
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