血小板衍生的Ti植入物的细胞外囊泡功能化

摘要

在这里，我们提出了一种分离来自血小板裂解物（PL）的细胞外囊泡（EV）的方法及其用于包衣钛（Ti）植入物表面的方法。我们描述了滴铸涂层方法，电动汽车从表面的释放曲线，以及电动汽车涂层Ti表面的 体外 生物相容性。

摘要

细胞外囊泡（EV）是生物纳米囊泡，在细胞通讯中起关键作用。其含量包括蛋白质和核酸等活性生物分子，在再生医学中具有巨大的潜力。最近，来自血小板裂解物（PL）的EV显示出与PL相当的成骨能力。此外，生物材料经常用于骨科或牙齿修复。在这里，我们提供了一种用PL衍生的EV功能化Ti表面的方法，以改善其成骨性能。

通过尺寸排阻色谱法从PL中分离出EV，然后通过滴铸将Ti表面与PL-EV功能化。功能化通过EV释放和乳酸盐脱氢酶（LDH）释放测定的生物相容性得到证明。

引言

EV是由任何细胞分泌的膜囊泡（30-200nm），通过传递其货物在细胞间通信中起着关键作用。它们含有多种活性生物分子，其中可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质¹。由于这些原因，电动汽车已被评估其在治疗中的潜在用途。在骨科和骨再生方面，来自不同来源的EV已经过测试。其中，血小板衍生的EV已被证明可以诱导干细胞的分化作用，同时保持低细胞毒性^2，3。因此，需要进一步的研究来探索将EV与生物材料相结合的可能性，以便在日常临床实践中使用它们。

钛基生物材料由于其机械性能、高生物相容性和长期耐用性，被广泛用作骨愈合临床干预的支架⁴。然而，Ti植入物是一种生物惰性材料，因此与周围骨组织的结合能力较差⁵。因此，正在研究钛改性，以便通过在其表面实现功能更强大的微环境来提高其性能^4，6，7。从这个意义上说，电动汽车可以通过化学⁸ 或物理相互作用与钛锚定^9，10。来自干细胞或巨噬细胞的固定化EV通过促进细胞粘附和增殖来增强Ti的生物活性，从而诱导成骨作用^8，9，10。

本文将重点介绍使用PL衍生的EV涂覆Ti表面的液滴铸造策略。此外，我们将评估EV在一段时间内从包被表面的释放曲线，并在 体外确认其细胞生物相容性。

方案

血小板裂解物（PL）按照先前所述使用IdISBa生物库提供的新鲜白蛋白涂层作为起始材料获得，符合机构指南³ 。它们在当前项目中的使用得到了其道德委员会的批准（IB 1995/12 BIO）。

1. 电动汽车与PL隔离

1. 较大的身体移除
   1. 在室温下解冻PL。
   2. 在4°C下以1，500× g 离心PL15分钟。 丢弃含有细胞碎片的沉淀。
   3. 收集上清液并在4°C下以10，000× g 连续离心30分钟。
      注意:沉淀对应于较大的EV，例如微泡，在这种情况下，它被丢弃。
   4. 过滤上清液首先通过0.8μm多孔膜，然后通过0.2μm多孔膜。
      注意:这些步骤将删除所有不需要的电动汽车。
   5. 将过滤后的PL池化并储存在-20°C直至使用。
2. 尺寸排阻色谱
   1. 用过滤的PBS以所需的流速平衡耦合到色谱设备的色谱柱。
      注:使用的流速取决于色谱柱特性;在这种情况下，它被设置为0.5毫升/分钟。
   2. 用注射器将处理后的PL（5 mL）装载到设备上。
   3. 将PL注入色谱柱中，并开始在15 mL管中收集5 mL级分。
   4. 收集EV富集馏分并将其储存在-80°C直至使用。
      注意:首次进行实验时，通过蛋白质定量和免疫检测表征所有组分，以确定富含EVs的组分^3，11。在这个实验中，收集了^第 9个分数。
   5. 用30mL的0.2%NaOH溶液洗涤色谱柱，一旦达到平衡，将其储存在20%乙醇溶液中。

图1:血小板裂解物（PL）细胞外囊泡（EV）分离的示意图。 PL首先以1，500 x g 离心，然后以10，000 x g 离心以除去较大的主体。上清液通过0.8和0.2μm过滤器过滤。将处理后的PL加载到色谱柱上，并通过尺寸排阻色谱分离EV。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 电动汽车特性描述

注:EV表征是进行功能研究所必需的¹²。电子显微镜或蛋白质印迹表征以前已有报道¹³。本报告将重点介绍Ti表面功能化的基本表征技术。

1. 纳米颗粒跟踪分析
   1. 将EV（1:1000）稀释在0.2μm过滤的PBS中。
      注意:过于浓缩的样品或太稀释的样品将超出NTA测定的范围，并且需要进行调整。
   2. 用注射器将1 mL稀释的EV加载到NTA设备中，并将其注入NTA设备。
   3. 遵循制造商的颗粒浓度和尺寸分布测定协议。
2. 蛋白质浓度
   1. 使用1μLEV溶液测定浓度。使用分光光度计测量波长为280nm的吸光度。
      注意:与颗粒数量相比，电动汽车的蛋白质水平应该较低。
   2. 按照制造商的说明使用分光光度计获取吸光度读数。

3. 钛表面功能化

注:在这种方法中，使用机加工的钛圆盘，c.p.等级IV，直径6.2毫米，高度2毫米。这些光盘可以用Ti镊子操纵，但重要的是不要划伤表面。此外，在整个过程中，机加工侧必须朝上。

1. 钛盘清洗
   注:用于Ti洗涤的溶液体积应足以覆盖Ti盘。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液倒入其中。然后，通过倾析取溶液。
   1. 用去离子（DI）水清洗Ti植入物，然后丢弃水。
   2. 用乙醇洗涤Ti植入物70%，然后倾析以除去溶液。
   3. 将植入物置于DI水中，并在50°C下超声处理5分钟。丢弃水。
   4. 将Ti植入物在40%NaOH溶液中孵育50°C并搅拌10分钟。丢弃解决方案。
      注意:NaOH溶液在制备过程中会变暖。该溶液具有腐蚀性，应在通风橱内使用。
   5. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟，然后取出水。
   6. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   7. 在50°C的DI水中超声处理植入物5分钟，然后取出水。
   8. 将Ti植入物在50°C的50%_HNO3 溶液中孵育10分钟，搅拌。删除解决方案。
      注意:_HNO3 是一种腐蚀性和氧化性物质，应在通风橱内使用。
   9. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
   10. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到获得中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   11. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
       注意:此时，可以通过将Ti植入物储存在70%乙醇溶液中来停止实验。
2. 钛钝化
   注:Ti钝化步骤是通过按下面列出的顺序用不同的溶液完全覆盖Ti光盘来执行的。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液轻轻倒在上面。所有洗涤步骤中使用的体积必须完全覆盖植入物，并通过倾析去除。
   1. 将Ti植入物在30%_HNO3 溶液中孵育30分钟，在室温下温和搅拌。删除解决方案。
   2. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   3. 将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。
   4. 在40°C的真空条件下干燥植入物10分钟。
3. 电动汽车下降铸件
   注意:对于细胞功能研究，在细胞培养柜中工作很重要。
   1. 将Ti植入物置于96孔板中，加工面朝上。
      注意:如果植入物倒置，可以使用针头将其放回去。
   2. 解冻电动汽车溶液，并将其与搅拌混合。使用涡旋脉冲3秒。
   3. 将EV沉积在Ti表面上。在这项研究中，将滴剂40μL的EV溶液滴到Ti上，根据NTA确定的浓度，每个植入物最多固定4 x ¹⁰¹¹ 个EV。
   4. 将含有Ti的板置于37°C的真空条件下，直到滴完全干燥（〜2小时）。
      注意:根据植入物的数量和真空室中存在的水来调整时间。

图2:Ti钝化和EV通过液滴铸造功能化的原理图。 Ti植入物首先在室温下在30%_HNO3 溶液中孵育30分钟，钝化。用去离子水洗涤几次后，pH值达到中性。然后，将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。之后，植入物在40°C的真空条件下干燥。 对于EV固定化，将40μLEV溶液沉积到Ti植入物上。接下来，植入物在真空下孵育2小时，直到EV物理结合到表面。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. Ti 表面表征

1. 发布研究
   1. 在37°C下用200μL过滤的PBS孵育Ti表面。
      注:PBS经过滤波，以避免干扰NTA测量。
   2. 在不同的时间点更换PBS并储存在-80°C。
      注意:在这项研究中，分析了2天，6天，10天和14天的时间点。
   3. 根据制造商的说明，NTA分析存储的PBS以进行颗粒研究。
      注:PBS中不同时间的颗粒浓度是电动汽车随时间变化的释放曲线的表示。
2. 生物相容性研究
   注意:人脐带来源间充质干细胞（hUC-MSC）是根据机构指南从IdISBa生物库获得的。
   1. 在补充 20% FBS 的 DMEM 低血糖中维持 hUC-MSC，直至使用。每周更换两次培养基。
   2. 对于细胞接种，用5 mL PBS在烧瓶中洗涤细胞两次。
   3. 通过加入 1 mL 胰蛋白酶溶液对 hUC-MSC 进行胰蛋白酶消化。确保它完全覆盖细胞的单层。除去胰蛋白酶溶液并将细胞培养瓶置于37°C约2分钟。在显微镜下观察细胞脱离。分离的细胞将呈现圆形，并将处于悬浮状态。
   4. 将细胞重悬于 DMEM 低葡萄糖中，1% 的 EV 耗尽 FBS。
      

结果

本文中介绍的方法允许获得EV功能化的钛盘。电动汽车与表面物理粘合，这允许随着时间的推移持续释放。NTA可以在第2天，第6天，第10天和第14天测量释放的EV数量。第2天的第一次测量显示，大约有¹⁰⁹ 辆电动汽车被释放，然后在第6天持续释放（约¹⁰⁸ 辆电动汽车）;第10天（约¹⁰⁷ 辆电动汽车）和第14天（约¹⁰⁷ 辆电动汽车）。这证实了持续释放，尽管随着时间的推移，电动汽车的释放量有所下降。

图3:Ti功能化表面的累积EV释放。 颗粒在37°C下于第2天，第6天，第10天和第14天在PBS中释放。 数据表示 n = 3 时 SEM ±平均值。

讨论

该协议旨在为电动汽车在Ti表面上的功能化提供明确的说明。所提出的方法基于液滴铸造策略，这是一种物理吸附类型的功能化。关于Ti表面上的EV功能化，书目很差，尽管很少有研究表明在^Ti10上固定EV具有不同的优势。无论如何，探索的一些策略包括生化结合⁸，聚合物截留⁹ 或滴铸¹⁰。虽然通过共价键使用化学涂层可能会实现更均匀的涂层，并具有更高级别的功能化，但化学反应可能会损害EV的结构和功能¹⁵。与聚合物截留或生化结合相比，滴铸是一种简单且低成本的方法。

该协议中可以解决的一个重要点是EV源。在本研究中，EV是从PL获得的。然而，液滴铸造方法适用于任何类型的电动汽车，因为它基于物理相互作用。先前使用其他方法的研究在评估细胞培养的EV（如干细胞^8，10<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0,8 和微;m 针式过滤器	Sartorius	16592K
1.5 mL 离心管	SPL 生命科学	PLC60015
1mL 针式	BD	303174
96 孔培养板	SPL 生命科学	PLC30096
绝对乙醇	Scharlau	ET0006005P	用于制备 20 %  乙醇和 Milli-Q® 水
AKTA净化器系统	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R 离心机	Beckman Coutler		392934 SX4750A 摆动转子
离心机 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 转子
锥形管，锥形底，50ml	SPL 生命科学 PLC50050
细胞毒性检测试剂盒 （LDH）	罗氏	11644793001
一次性注射器 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM 低葡萄糖 Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS （1x）	Capricorn Scientific	PBS-1A
胎牛血清 （FBS） Embrionic 认证	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm 针式过滤器	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 粒丙烯 S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	预制柱
人脐带来源的间充质干细胞 （hUC-MSC）	IdISBa 生物样本库
Nanodrop 2000 分光光度计	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 纳米粒子跟踪分析	马尔文	NS300	设备，在 λ= 532 nm 处嵌入激光和相机 sCMOS
针头	Terumo	946077135
硝酸 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP 超速离心机	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti 转子
青霉素-链霉素溶液 100X	Biowest	L0022
pH 试纸 4.5-10.0	Sigma	P-4536
血小板裂解物 （PL）	IdISBa 生物样本库		从献血后丢弃的血沉棕黄层中获得
聚丙烯离心管	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
螺旋盖管，15 ml，（LxØ）：120 x 17 mm，PP，带打印	Sarstedt	62554502
Hidroxide 钠	Sharlau	SO04251000
钛植入物复制品	Implantmedia， SA	NA	钛 IV 级。直径：6.2 毫米。高度：1,95 mm
胰蛋白酶-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787