在此，我们介绍一种从血小板裂解物（PL）中分离细胞外囊泡（EVs）并将其用于钛（Ti）种植体表面涂层的方法。我们描述了液滴涂覆法、EVs从表面的释放曲线，以及 体外 EV包被钛表面的生物相容性
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是一类在细胞通讯中发挥关键作用的生物纳米囊泡。其内容物包含蛋白质和核酸等活性生物分子，在再生医学中具有巨大应用潜力。近期研究表明，来源于血小板裂解物（PL）的EVs具有与PL相当的成骨能力。此外，生物材料常用于骨科或牙科修复。本文提供了一种利用PL来源的EVs对钛（Ti）表面进行功能化修饰的方法，以增强其成骨性能。
通过尺寸排阻色谱法从血小板裂解物（PL）中分离出细胞外囊泡（EVs），随后通过滴涂法将PL-EVs固定于钛（Ti）表面以实现表面功能化。通过检测EVs的释放以及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估其生物相容性，从而验证功能化的有效性。
引言
细胞外囊泡（EVs）是由任何细胞分泌的膜性囊泡（30–200 nm），通过递送其所携带的分子货物在细胞间通讯中发挥关键作用。EVs含有多种活性生物分子，可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质1。基于这些特性，EVs已被评估用于治疗应用的潜力。在骨科与骨再生领域，已对来自不同来源的EVs进行了研究。其中，血小板来源的EVs已被证明可诱导干细胞发生分化，同时保持较低的细胞毒性2,3。因此，尚需进一步研究探索将EVs与生物材料结合使用的可能性，以推动其在日常临床实践中的应用。
由于具有优良的机械性能、高生物相容性和长期耐久性，钛基生物材料被广泛用作骨修复临床干预中的支架材料4。然而，钛植入物属于生物惰性材料，因此与周围骨组织的结合能力较差5。为此，研究人员正在探索对钛材料进行改性，以在其表面构建更具功能性的微环境，从而提升其性能4,6,7。在此背景下，细胞外囊泡（EVs）可通过化学8或物理相互作用9,10锚定于钛表面。来源于干细胞或巨噬细胞的固定化EVs可通过促进细胞黏附与增殖，增强钛材料的生物活性，进而诱导成骨效应8,9,10。
本文将重点详细介绍一种通过滴铸法在钛表面涂覆胎盘来源细胞外囊泡（PL-derived EVs）的策略。此外，我们将评估涂覆表面随时间的细胞外囊泡释放特性，并验证其细胞生物相容性。 体外.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
血小板裂解物（PL）按照先前所述方法制备，符合机构指南3，起始材料为 IdISBa 生物样本库提供的新鲜白膜层。其在本项目中的使用已获得该机构伦理委员会批准（IB 1995/12 BIO）。
1. 从胎盘液中分离细胞外囊泡
- 较大物体的移除
- 室温下解冻 PL。
- 以 1,500 x g 离心 PL g 15 分钟 4 °C弃去沉淀，因其含有细胞碎片。
- 收集上清液，并依次进行两次10,000 x g离心 g 30 min 4 °C.
注意：沉淀物对应较大的细胞外囊泡（EVs），如微囊泡，本实验中将其弃去。 - 先将上清液通过过滤 0.8 µm 多孔膜，然后通过 0.2 µm 多孔膜
注意：这些步骤可去除所有不需要的EVs。 - 将过滤后的PL合并，并于-80 °C保存20 °C 直至使用。
- 尺寸排阻色谱
- 使用过滤的 PBS 缓冲液，以目标流速平衡连接至层析设备的层析柱。
注意：所用流速取决于色谱柱特性；本实验中设定为0.5 mL/min。 - 用注射器将处理后的PL（5 mL）加载至仪器中。
- 将PL注入色谱柱，并开始用15 mL离心管收集5 mL的组分。
- 收集富含EV的组分，并于-80℃保存。80 °C 直至使用。
注意：首次进行实验时，应对所有组分进行蛋白质定量和免疫检测，以确定富含细胞外囊泡（EVs）的组分3,11在此实验中，9th 收集组分。 - 用30 mL 0.2% NaOH溶液清洗色谱柱，待其达到平衡后，置于20%乙醇溶液中保存。
- 使用过滤的 PBS 缓冲液，以目标流速平衡连接至层析设备的层析柱。
图1血小板裂解液（PL）外泌体（EVs）分离的示意图 PL 首先以 1,500 x g，然后在 10,000 x g 以去除较大的颗粒。上清液依次通过0.8和 0.2 µm 过滤器。将处理后的血小板裂解液上样至柱中，通过尺寸排阻色谱法分离细胞外囊泡。 请点击此处以查看此图的放大版本。
2. 细胞外囊泡（EVs）表征
注意：进行功能研究前必须对细胞外囊泡（EVs）进行表征12。已有文献报道采用电子显微镜或蛋白质印迹法进行EVs表征13。本报告将重点介绍用于钛（Ti）表面功能化的关键表征技术。
- 纳米颗粒追踪分析（NTA）
- 将EVs用0.2 µm滤过的PBS稀释1000倍。
注意：样品浓度过高或过低均会超出NTA测定范围，需进行调整。 - 用注射器将1 mL稀释后的EVs加入NTA设备，并注入仪器中。
- 按照制造商的说明书进行颗粒浓度和粒径分布的测定。
- 将EVs用0.2 µm滤过的PBS稀释1000倍。
- 蛋白质浓度
- 取1 µL EVs溶液测定浓度，在280 nm波长下用分光光度计测量吸光度。
注意：与颗粒数量相比，EVs中的蛋白质含量应较低。 - 按照分光光度计制造商的说明获取吸光度读数。
- 取1 µL EVs溶液测定浓度，在280 nm波长下用分光光度计测量吸光度。
3. 钛表面功能化
注意：本方法中使用机械加工的钛圆片，纯钛四级，直径 6.2 mm，高度 2 mm。可使用钛镊子操作这些圆片，但需注意避免划伤表面。此外，整个过程中机械加工面必须朝上。
- 钛片清洗
注意：用于清洗钛片的溶液体积应足以完全覆盖钛片。将钛片放入玻璃烧杯中，然后将溶液倒入。通过倾析法去除溶液。- 用去离子水（DI水）清洗钛植入物，然后弃去水。
- 用70%乙醇清洗钛植入物，然后倾析去除溶液。
- 将植入物放入去离子水中，在50 °C下超声处理5分钟，然后弃去水。
- 在50 °C下，将钛植入物置于40% NaOH溶液中孵育10分钟，并持续搅动，随后弃去溶液。
注意：NaOH溶液在配制过程中会放热。该溶液具有腐蚀性，应在通风橱内操作。 - 在50 °C下，用去离子水对植入物进行超声处理5分钟，然后去除溶液。
- 用去离子水反复清洗（至少5次），直至达到中性pH值。使用pH指示剂检测pH值。
- 在50 °C下，用去离子水对植入物超声处理5分钟，然后去除水。
- 在50 °C下，将钛植入物置于50% HNO3溶液中孵育10分钟，并持续搅动，随后去除溶液。
注意：HNO3为腐蚀性且具氧化性的物质，应在通风橱内操作。 - 在50 °C下，用去离子水对植入物超声处理5分钟，然后去除溶液。
- 用去离子水反复清洗（至少5次），直至pH值达到中性。使用pH指示剂检测pH值。
- 在50 °C下，用去离子水对植入物超声处理5分钟，然后去除溶液。
注意：此时可通过将钛植入物保存在70%乙醇溶液中暂停实验。
- 钛钝化
注意：钛钝化步骤需按以下顺序，用不同溶液完全覆盖钛片进行。将钛片置于玻璃烧杯中，轻轻倒入溶液。所有清洗步骤所用溶液体积必须完全覆盖植入物，并通过倾析法去除。- 在室温下，将钛植入物置于30% HNO3溶液中孵育30分钟，并轻柔搅动，随后去除溶液。
- 用去离子水反复清洗（至少5次），直至达到中性pH值。使用pH指示剂检测pH值。
- 在室温下，将钛植入物在去离子水中过夜孵育。
- 在40 °C下真空干燥10分钟，使植入物干燥。
- 外泌体（EVs）滴涂
注意：进行细胞功能研究时，应在细胞培养柜中操作。- 将钛植入物放入96孔板中，加工面朝上。
注意：若植入物倒置，可使用针头将其调整回位。 - 解冻外泌体（EVs）溶液，并轻轻搅动混匀。使用涡旋振荡器脉冲振荡3秒。
- 将外泌体（EVs）沉积于钛表面。本研究中，每枚钛植入物表面滴加40 µL EVs溶液，根据NTA测定的浓度，使每枚植入物固定最多4 × 1011个EVs。
- 将含有钛植入物的板置于37 °C真空条件下，直至液滴完全干燥（约2小时）。
注意：根据植入物数量及真空腔内水分含量调整干燥时间。
- 将钛植入物放入96孔板中，加工面朝上。
图2：通过滴铸法实现Ti钝化及细胞外囊泡（EVs）功能化的示意图。 首先将钛植入物在室温下置于30% HNO3溶液中孵育30分钟进行钝化处理。随后用去离子水多次洗涤，直至pH达到中性。接着将钛植入物在去离子水中于室温下过夜孵育。之后，在40 °C的真空条件下将植入物干燥。为固定EVs，将40 µL的EVs溶液滴加到钛植入物表面。随后将植入物置于真空环境中孵育2小时，使EVs通过物理吸附结合至表面。请点击此处查看该图的放大版本。
4. 钛表面表征
- 释放研究
- 将 Ti 表面与 200 µL 过滤后的 PBS 在 37 °C 下孵育。
注意：PBS 需经过过滤，以避免对纳米颗粒追踪分析（NTA）测量造成干扰。 - 在不同时间点更换 PBS，并储存于 -80 °C。
注意：本研究中分析了第 2、6、10 和 14 天的时间点。 - 根据制造商说明书，采用纳米颗粒追踪分析（NTA）对储存的 PBS 进行颗粒分析。
注意：不同时间点 PBS 中的颗粒浓度反映了细胞外囊泡（EVs）随时间的释放特征。
- 将 Ti 表面与 200 µL 过滤后的 PBS 在 37 °C 下孵育。
- 生物相容性研究
注意：人脐带来源的间充质干细胞（hUC-MSC）来自 IdISBa 生物样本库，符合机构伦理指南。- 使用含 20% 胎牛血清（FBS）的低糖 DMEM 培养基维持 hUC-MSC 培养至使用。每周更换培养基两次。
- 细胞接种时，用 5 mL PBS 对培养瓶中的细胞清洗两次。
- 加入 1 mL 胰蛋白酶溶液消化 hUC-MSC，确保完全覆盖细胞单层。吸除胰蛋白酶溶液后，将细胞培养瓶置于 37 °C 环境约 2 分钟。在显微镜下观察细胞脱落情况。脱落的细胞呈圆形并悬浮于溶液中。
- 将细胞重悬于含 1% 去除外泌体的胎牛血清（EVs-depleted FBS）的低糖 DMEM 培养基中。
注意：配制含 1% FBS 的培养基后，需在 120,000 × g 条件下超速离心 18 小时以去除 FBS 中的外泌体。去除外泌体至关重要，可避免其对血小板来源外泌体的检测造成干扰。 - 使用血球计数板计数细胞数量，确定细胞浓度14。
- 将 hUC-MSC 调整至浓度为 50,000 个细胞/mL。
- 将 200 µL 细胞悬液接种到 Ti 植入物表面。
- 48 小时后，收集 50 µL 培养上清液，按照制造商方案使用乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒进行细胞毒性测定。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本文介绍的方法能够获得经细胞外囊泡（EVs）功能化的钛片。EVs通过物理结合方式固定在材料表面，从而实现随时间的持续释放。可通过纳米颗粒追踪分析（NTA）在第2、6、10和14天测定释放的EVs数量。最早在第2天的检测结果显示，约有109个EVs被释放，随后在第6天持续释放约108个EVs，第10天约107个EVs，第14天亦约为107个EVs。这证实了EVs的持续释放特性，尽管随时间推移释放量有所下降。
图3：经钛功能化表面累积释放的细胞外囊泡（...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案旨在提供将细胞外囊泡（EVs）功能化至钛（Ti）表面的明确操作步骤。所介绍的方法基于滴涂策略，属于物理吸附类型的功能化。目前关于EVs在钛表面功能化的文献报道较少，尽管已有少数研究展示了将EVs固定在钛表面所带来的不同优势10。目前已探索的策略包括生化结合8、聚合物包埋9或滴涂法10。虽然通过共价键使用化学涂层可实现更均匀且功能化程度更高的涂层，但化学反应可能损害EVs的结构与功能活性15。相比聚合物包埋或生化结合，滴涂法是一种简便且低成本的方法。
本方案中一个值得注意的重要问题是EV的来源。在本研究中，EV来源于PL。然而，由于滴涂法基于物理相互作用，因此可适用于任何类型的EV。先前采用其他方法的研究在评估使用细胞培养来源的EV（如干细胞8,
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、经济与竞争力部（Ministerio de Economía y Competitividad）资助，并由欧洲社会基金（ESF）和欧洲区域发展基金（ERDF）共同资助（MS16/00124；CP16/00124；PI17/01605），巴利阿里群岛政府研究总局（Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear）（FPI/2046/2017）以及“人才提升”项目（TALENT PLUS）的青年计划（PROGRAMA JUNIOR）“构建健康，创造价值”（JUNIOR01/18）提供经费支持，上述项目由巴利阿里群岛可持续旅游税资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0,8 µm 注射器滤器 | Sartorius | 16592K | |
| 1.5 mL 离心管 | SPL life sciences | PLC60015 | |
| 1 mL 注射器 | BD | 303174 | |
| 96 孔培养板 | SPL life sciences | PLC30096 | |
| 无水乙醇 | Scharlau | ET0006005P | 用于与 Milli-Q® 水配制 20% 乙醇 |
| AKTA 纯化系统 | GE Healthcare | 8149-30-0014 | |
| Allegra X-15R 离心机 | Beckman Coulter | 392934 | SX4750A 摆动转子 |
| Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 转子 |
| 锥形管，锥底，50 mL | SPL life sciences | PLC50050 | |
| 细胞毒性检测试剂盒（LDH） | Roche | 11644793001 | |
| 一次性注射器，10 mL | Becton Dickinson | BDH307736 | |
| DMEM 低糖 GlutaMax | GIBCO | 21885025 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| 胎牛血清（FBS），胚胎认证 | GIBCO | 16000044 | |
| Filtropur S 0.2 µm 注射器滤器 | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR | GE Healthcare | 28-9356-04 | 预装柱 |
| 人脐带来源间充质干细胞（hUC-MSC） | IdISBa 生物样本库 | ||
| Nanodrop 2000 分光光度计 | ThermoFisher | ND-2000 | |
| NanoSight NS300 纳米颗粒追踪分析仪 | Malvern | NS300 | 配备波长 λ= 532 nm 的内置激光器和 sCMOS 相机的设备 |
| 针头 | Terumo | 946077135 | |
| 硝酸 69.5% | Scharlau | AC16071000 | |
| Optima L-100 XP 超速离心机 | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | SW-32Ti 转子 |
| 青霉素-链霉素溶液 100X | Biowest | L0022 | |
| pH 试纸 4.5-10.0 | Sigma | P-4536 | |
| 血小板裂解物（PL） | IdISBa 生物样本库 | 来源于献血后废弃的白膜层 | |
| 聚丙烯离心管 | Beckman Coulter | 326823 | |
| Power wave HT | BioTek | 10340763 | |
| 螺旋盖管，15 mL，（长×Ø）：120 × 17 mm，聚丙烯，带刻度 | Sarstedt | 62554502 | |
| 氢氧化钠 | Sharlau | SO04251000 | |
| 钛种植体复制品 | Implantmedia, SA | NA | 四级钛。直径：6.2 mm。高度：1.95 mm |
| 胰蛋白酶-EDTA 1 X | Biowest | L0930 | |
| 吐温 X100 | Sigma | T8787 |
参考文献
- Van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Torreggiani, E., et al. Exosomes: novel effectors of human platelet lysate activity. European Cells & Materials. 28, 137-151 (2014).
- Antich-Rosselló, M., et al. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone and Joint Research. 9 (10), 667-674 (2020).
- Li, Y., et al. New developments of Ti-based alloys for biomedical applications. Materials. 7 (3), Basel, Switzerland. 1709-1800 (2014).
- Lan, W. C., et al. The potential of a nanostructured titanium oxide layer with self-assembled monolayers for biomedical applications: Surface properties and biomechanical behaviors. Applied Sciences. 10 (2), 590(2020).
- Jemat, A., Ghazali, M. J., Razali, M., Otsuka, Y. Surface modifications and their effects on titanium dental implants. BioMed Research International. 2015, 791725(2015).
- Damiati, L., et al. Impact of surface topography and coating on osteogenesis and bacterial attachment on titanium implants. Journal of Tissue Engineering. 9, 2041731418790694(2017).
- Chen, L., et al. Self-assembled human adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicle-functionalized biotin-doped polypyrrole titanium with long-term stability and potential osteoinductive ability. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (49), 46183-46196 (2019).
- Wei, F., Li, M., Crawford, R., Zhou, Y., Xiao, Y. Exosome-integrated titanium oxide nanotubes for targeted bone regeneration. Acta Biomaterialia. 86, 480-492 (2019).
- Wang, X., et al. Exosomes influence the behavior of human mesenchymal stem cells on titanium surfaces. Biomaterials. 230, 119571(2020).
- Lozano-Ramos, I., et al. Size-exclusion chromatography-based enrichment of extracellular vesicles from urine samples. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27369(2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
- Liu, J., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57541(2018).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2021).
- Chouirfa, H., Bouloussa, H., Migonney, V., Falentin-Daudré, C. Review of titanium surface modification techniques and coatings for antibacterial applications. Acta Biomaterialia. 83, 37-54 (2019).
- Córdoba, A., Monjo, M., Hierro-Oliva, M., González-Martín, M. L., Ramis, J. M. Bioinspired quercitrin nanocoatings: A fluorescence-based method for their surface quantification, and their effect on stem cell adhesion and differentiation to the osteoblastic lineage. ACS Applied Materials and Interfaces. 7 (30), 16857-16864 (2015).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
