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方法文章

囊胚腔内分泌的转化生长因子β家族切割产物分析 非洲爪蟾 胚胎

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DOI：

10.3791/62782

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2021年7月21日

 , 
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

本文内容

摘要

当转化生长因子ß家族前体蛋白在非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中异位表达时，它们会形成二聚体，被切割并分泌到囊胚腔中，这一过程始于晚期囊胚至早期原肠胚阶段。本文介绍一种从囊胚腔中吸取切割产物用于免疫印迹分析的方法。

摘要

转化生长因子ß（Tgfß）超家族的两个分支，分别由Tgfß/Nodal或骨形态发生蛋白（Bmp）配体代表，在胚胎发育和成体稳态中发挥关键作用。Tgfß家族成员以无活性的前体形式合成，在内质网中形成二聚体并正确折叠。随后，该前体被切割为配体和前结构域（prodomain）两部分。尽管只有二聚体形式的配体能够结合Tgfß受体并激活下游信号通路，但越来越多的研究认识到前结构域部分也参与调控配体活性。本文介绍了一种可用于鉴定Tgfß前体蛋白激活过程中产生的切割产物的实验方案。首先将编码Tgfß前体的RNA微量注射到 X. laevis 胚胎。次日，从囊胚腔中收集卵裂产物 囊胚期胚胎并在蛋白质印迹上进行分析。该方案可相对快速地完成，无需昂贵的试剂，并可在生理条件下提供浓缩的Tgfß切割产物。

引言

转化生长因子ß（Tgfß）超家族成员被合成为无活性的二聚体前体蛋白。这些前体随后由前体蛋白转化酶（proprotein convertase, PC）家族成员在分泌途径内或细胞外进行切割，从而产生一个具有活性的、通过二硫键连接的配体二聚体和两个前结构域片段1。尽管已有超过30年的研究证实Tgfß家族前体的前结构域对于生成有活性的配体是必需的2，但前结构域如何促进配体功能的具体机制仍不完全清楚。

尽管对 Tgfß 家族成员蛋白水解激活过程的理解仍不完整，但人们日益关注哪些 PC 共识基序会被切割 体内，切割是否发生在特定的亚细胞或细胞外区域，以及前导结构域是否以共价或非共价方式与切割后的配体保持结合3多项研究表明，前结构域不仅在切割前引导配体的折叠4,5，但也可能影响生长因子的稳定性和作用范围6,7,8,9，驱动同源二聚体或异源二聚体的形成10将配体锚定在细胞外基质中以维持其潜伏状态11，且在某些情况下可作为配体直接激活异源信号通路12Tgfß 家族多个成员前结构域内的杂合点突变与人类眼部、骨骼、肾脏、骨骼系统或其他缺陷相关3这些发现凸显了前结构域在生成和维持活性配体中的关键作用，并强调了鉴定和解析Tgfß家族前体蛋白在蛋白水解成熟过程中产生的切割产物功能的重要性。

本文介绍了一种详细方案，用于从非洲爪蟾（X.）囊胚腔中抽吸转化生长因子β（Tgfß）家族前体在成熟过程中产生的裂解产物。 laevis 胚胎，随后通过免疫印迹进行分析。该方案可用于确定前体蛋白中的一个或多个PC保守基序是否被切割 体内10,13，鉴定出切割每种基序的内源性PC（前体蛋白转化酶）13,14，比较 体内 Tgfß家族同源二聚体与异源二聚体的形成10 或分析与人类疾病相关的点突变是否影响Tgfß前体形成功能性二聚体配体的能力。

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方案

所有所述操作程序均经犹他大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。青蛙饲养于经IACUC批准的设施中。雄性青蛙通过浸入三卡因（tricaine）实施安乐死，随后剪除心脏心室。雌性青蛙在激素诱导排卵后于实验室内饲养最多24小时，以收集卵子，之后即送回护理设施。

1. X. laevis 睾丸的采集

  1. 将性成熟的雄性个体麻醉于0.2% Tricaine中表130-40 分钟，直至动物对足爪夹捏无反应。
  2. 使用钝头镊子将皮肤从体壁拉开。用手术剪在下腹部横向剪开皮肤。在下方体壁做一平行切口，然后通过体壁向上经肋骨处做第三个垂直切口。
    1. 将形成的瓣膜折回，找到心脏的心室，夹闭基部以放血并确保动物死亡。
  3. 用钝头镊子将黄色的脂肪体从腹部拉出，找到位于脂肪体基部下方两侧的睾丸。使用手术剪将每个睾丸从脂肪体及任何附着的内脏组织上剪下并取出。
  4. 将睾丸转移至含有1x改良巴氏溶液（MBS）的培养皿中（表1）。冲洗并去除任何附着的血管或相连的内脏。
    1. 将一个睾丸转移至含有睾丸缓冲液的35 mm培养皿中（表1) 立即使用，另一份储存于装有睾丸缓冲液的10 mL锥形管中以备后续使用。未使用时，睾丸组织应保存在4 °C，至少可维持活性两周。
      ​注意：睾丸分离的实验照片可参见参考文献15。

2. X. laevis 卵的采集与受精

注意：应使用乙烯基手套接触青蛙，或在接触青蛙前后洗手。乳胶手套、护手霜以及人手上的洗涤剂残留会损伤青蛙脆弱的皮肤。

  1. 产卵前一晚，使用配备26 G针头的1 mL注射器，向两到三只成熟的X. laevis雌蛙背部淋巴囊内注射0.3 mL（1200 IU）人绒毛膜促性腺激素（表 1）。每次注射均应使用新针头。
  2. 注射后，将雌蛙置于密封但非完全密闭的容器中，并放入18 °C的生化培养箱内。通常在14–16小时后开始产卵。
    注意：使用带通气孔的塑料抽屉或塑料容器过夜存放雌蛙效果良好。务必确保盖子牢固，防止青蛙逃出并在培养箱中脱水。
  3. 将雌蛙置于含有1x MBS的100 mm培养皿上方，轻轻按压蛙腹部，促使卵子排入培养皿中。
  4. 用剃须刀片切取一小块睾丸组织（约1/5），转移至含有约500 µL 1x MBS的1.5 mL离心管中。使用 pellet pestle 或组织匀浆器研磨。将所得的精子悬液置于冰上或4 °C保存，并于当日用于后续受精操作。
  5. 倾斜100 mm培养皿，尽可能倒出1x MBS溶液，并用塑料移液管吸除残留液体。加入约100 µL精子悬液，再添加约1 mL 0.1x MBS，轻轻旋转混匀。
    1. 5分钟后，用去氯自来水或0.1x MBS充满培养皿，静置30分钟。
      注意：可通过滤器去除余氯，或在添加常规氯的地区，将市政自来水敞口静置至少24小时，使氯气自然挥发。在使用氯胺进行饮用水消毒的地区，则必须使用市售的可分解氯胺的水质调节剂处理水。
      注意：卵子在高盐溶液（1x MBS）中收集，以防止形成胶状包膜，该包膜会阻碍受精。受精后，低盐溶液（去氯水或0.1x MBS）允许胶状包膜形成，卵子将彼此粘附并附着于培养皿表面。已受精的卵子将在30分钟内发生旋转，使有色的动物极朝上。若未发生此现象，且在显微镜下观察卵子状态良好，则提示精子活力可能存在问题 ，可能需要重新获取新的睾丸组织。
  6. 倒去覆盖卵子的溶液，向培养皿中加入新配制的2%半胱氨酸溶液（表 1）。轻轻旋转培养皿3–5分钟，直至胶状包膜完全溶解，卵子不再相互粘连或附着于皿壁。
    1. 倾斜培养皿，小心倒出半胱氨酸溶液，或用塑料移液管吸除，随后加入1x DeBoer池水（表 1）。旋转冲洗后倾去液体。
    2. 依次用DeBoer溶液洗涤一次、0.1x MBS洗涤一次，最后用0.1x MBS重新充满培养皿。去除胶状包膜后，卵子变得更加脆弱，切勿使其暴露于气液界面。
  7. 将已受精的卵子转移至16 °C的生化培养箱中，或在室温下置于实验台静置。若在室温下培养，首次卵裂将在受精后1–1.5小时发生，后续卵裂约每30分钟一次。相比之下，若胚胎在15–16 °C条件下培养，卵裂周期约为每小时一次 ，从而可对同一批次产出的更多胚胎进行显微注射。

3. X. laevis 胚胎的显微注射

  1. 使用显微拉针仪将玻璃毛细管加热并拉制成尖细末端，设置参数如下：两步拉制；加热1：67.4 °C；加热2：62 °C。
    注意：这些设置仅针对本实验所用的微量移液器拉制仪和玻璃毛细管（材料表).
  2. 在解剖显微镜下，使用Dumont #5镊子将拉制好的针尖端附近剪断。针尖应锋利，但不可过细，以免接触胚胎时针尖弯曲。 图1 显示了一个适用于显微注射但尚未剪切的适当拉制针头（A），以及一个已经剪切过的针头 (B).
  3. 将针头插入连接至显微注射仪的持针器中，并将持针器固定于显微操作仪上。在解剖显微镜下，取2-4 µL含有待分析Tgfß前体蛋白编码序列的加帽合成RNA，滴加于一小片石蜡膜上。
    1. 使用显微操作仪将针头下降至液滴中，并利用显微注射仪的填充功能将RNA吸入针头。确保针头始终位于液滴表面以下，并在显微镜下观察吸入过程，避免将空气吸入针头。
      注意：如果缺乏可识别待分析Tgfß前体蛋白的前结构域和/或配体结构域的抗体，可将编码表位标签（如V5、myc、Flag）的序列以同框方式插入将用于RNA转录模板的cDNA中。 体内 应比较标记蛋白与未标记蛋白的生物活性，以确保表位标签不影响蛋白的正确折叠、切割或活性。
  4. 将RNA溶液推出一滴至空气中，使用安装在显微注射台或显微镜目镜上的微米尺测量液滴大小。通过显微注射仪的时间和压力控制调节液滴体积至约10 nL。
    注意：RNA 浓度在 5–20 ng/µL 范围内较为合适，可向每个胚胎递送 50–200 pg 的 RNA。此剂量的 RNA 通常足以在 10–20 个胚胎的吸出液中检测到切割产物。在免疫印迹中能检测到信号的前提下，应尽量采用最低的 RNA 剂量。过高的 RNA 用量可能导致原肠胚形成缺陷，从而干扰囊胚腔的扩张。
  5. 将胚胎转移至含有0.1x MBS中5% Ficoll的注射皿或注射盘中表1当胚胎发育至2-4细胞期时进行操作。可在35 mm培养皿底部放置一片尼龙网，制成廉价的注射用培养皿，以固定胚胎。将注射针插入动物极附近，向每个胚胎的一个细胞中注入10 nL RNA。
    注意：胚胎在1细胞期至16细胞期之间的任何时间点均可进行注射。在胚胎发生卵裂后再进行注射，可确保卵子已成功受精且胚胎处于健康状态。注射的具体位置并非关键。有关产卵、培养及向胚胎显微注射RNA的更详细描述见于 X. laevis 胚胎信息可参见参考文献15。
  6. 将已注射的胚胎转移至一个含有5% Ficoll的0.1x MBS溶液的35 mm培养皿中表1将小培养皿放入150 mm的培养皿中，并用盖子松松盖上，以防止培养基蒸发。在15–16 °C条件下培养胚胎过夜。
    ​注意：在Ficoll中培养胚胎有助于修复注射部位。若使用细针，2–3%的Ficoll即可满足要求；若观察到明显损伤，则建议使用5%的Ficoll。注射后将胚胎置于Ficoll溶液中培养1–2小时足以促进愈合，但只要在原肠胚形成开始前更换溶液，过夜孵育也不会对胚胎造成损害。

4. 囊胚腔液提取及Tgfß裂解产物分析

  1. 注射后的第二天早晨，移除Ficoll溶液，并去除任何死亡或濒死的胚胎。用0.1x MBS冲洗胚胎一至两次，然后将胚胎置于0.1x MBS中，在室温下于实验台培养。
    注意：也可将胚胎放回16 °C的生物培养箱中以减缓发育。
  2. 使用显微拉针仪将玻璃毛细管加热并拉制成尖细末端，设置参数如下：两步拉制；加热1：67.4 °C；加热2：62 °C。
    注意：这些设置仅针对此处使用的拉制仪和玻璃毛细管材料表).
  3. 在解剖显微镜下，使用镊子剪断拉制好的针尖末端。为防止堵塞，用于囊胚腔抽吸的针头开口应大于用于显微注射的针头开口。图中展示了一个适用于囊胚腔抽吸的优质拉制并剪裁后的针头示例。 图1C将吸液针插入连接至显微注射仪的针座中，并将针座固定到显微操作仪上。
    注意：最佳针头直径需通过反复试验经验性确定。直径较大的针头进液过快，容易导致细胞碎片进入针头；而直径过小的针头则容易发生堵塞。一旦确定合适的针头，建议制备多个在相同位置截断的针头以备使用。
  4. 将胚胎置于盛有0.1x MBS的注射培养皿中，当胚胎发育至原肠胚早期至中期（阶段10-11）时。
  5. 将针头插入靠近动物极的胚胎表面下方。在解剖显微镜下观察针头和胚胎的同时，按下显微注射仪的填充按钮。数秒内，针头中的透明液体液面将上升，胚胎会塌陷并变为凹陷状。
    1. 如果针头中出现浑浊的白色物质，松开填充按钮，并按压注射按钮一次或多次，以排出浑浊物质，该物质为细胞碎片，可能含有蛋白酶。
      注意：如果按压填充按钮后囊胚腔立即塌陷且细胞碎片进入针尖，表明针尖开口过大。如果囊胚腔未能塌陷，但白色物质立即进入针尖，说明针头插入过深，已接触囊胚腔底部。此时应排出白色物质，并转移至下一个胚胎。通过脉冲式按压填充按钮（而非持续按压），可更精确地控制吸液速度。当针尖开口大于最佳尺寸时，此操作尤为重要。
  6. 重复步骤4.5，直至从10–20枚胚胎的囊胚腔中吸出液体。
    注意：通常，从10至20枚胚胎中抽取的囊胚腔液足以在免疫印迹中检测到裂解产物。然而，具体所需数量可能因抗体质量而异，需通过实验经验确定。
  7. 将一块石蜡置于注射托盘上，用移液器吸取1 µL无核酸酶水并滴加到石蜡表面。将针头浸入水滴下方，按下注射按钮，将囊胚腔液注入水中。
    1. 或者，可将液体直接排到石蜡膜上，但此时应点按注射按钮而非持续按住。这样可在较低压力下排出液体，防止液体在石蜡膜上铺展变平，从而难以用移液器重新吸取。
  8. 将囊胚腔液转移至预冷的无菌微量离心管中。每个胚胎预计可收获约0.3–0.5 µL囊胚腔液。加入无核酸酶水，调整终体积至30 µL。
  9. 将囊胚腔液体耗尽的胚胎转移至冰上另一离心管中。吸除多余的0.1x MBS，加入200 µL预冷（4 °C）的胚胎裂解缓冲液（每胚胎10 µL）。表1用移液器将胚胎上下吹打10–20次，直至完全匀浆且无团块残留。
  10. 将匀浆后的胚胎在预冷的微量离心机中以10,000 x g离心 g 孵育10分钟。使用P200移液器小心吸取上清液160 µL，避免触及管子下半部分的白色卵黄蛋白及其他细胞碎片，将上清液转移至冰上放置的新离心管中。
    1. 重复微量离心一次，将128 µL澄清上清液转移至冰上新的离心管中。至此，澄清的胚胎裂解液和囊胚腔液可根据需要在-80 °C长期保存。
      注意：除少数例外情况外，Tgfß 前体蛋白不会被分泌到囊胚腔内，仅能在去除了囊胚腔液的胚胎裂解物中检测到。相反，Tgfß 家族的切割产物主要存在于囊胚腔液中。通常情况下，同时收集并分析胚胎裂解物和囊胚腔液是有帮助的。最低限度而言，这可提供一个阳性对照，以确保前体蛋白被充分翻译且稳定存在。此外，该方法还允许比较不同野生型或突变型蛋白之间切割产物与前体蛋白的相对比例，从而识别出某些突变：例如，位于PC保守基序内的突变可能使前体蛋白正确折叠并分泌至囊胚腔液中而不被切割（此时，完整的前体蛋白在胚胎裂解物和囊胚腔液中均可检测到）；或识别出导致蛋白错误折叠、无法被切割的突变（此时，前体蛋白仅存在于胚胎裂解物中，而囊胚腔液中检测不到切割产物）。
  11. 此时，按照制造商说明书，使用PNGase F对囊胚腔液中的蛋白质进行去糖基化处理。
    注意：无需对胚胎裂解液中存在的前体蛋白进行去糖基化处理，因为这些前体蛋白是内质网（ER）驻留形式，缺乏PNGase F可去除的复杂N-连接寡糖。相比之下，囊胚腔液中的切割产物已通过反式高尔基网络（TGN），在此过程中糖链被进一步修饰，因而现在可被PNGase F去除。去糖基化后，切割产物在SDS凝胶电泳中迁移为更紧密的条带，有助于可视化、定量和准确鉴定切割产物。此步骤并非必需，但在某些情况下可能有帮助，例如当需要根据迁移模式区分同源二聚体与异源二聚体，或当切割产物含有导致其迁移成宽而弥散条带的异质性糖链时。
  12. 加入5 µL还原性4x上样缓冲液（表1) 加入15 µL囊胚腔液和15 µL澄清的胚胎裂解液中，再加入5 µL非还原性4x上样缓冲液（表1)加入剩余的15 µL囊胚腔液中。100 °C加热5分钟，然后置于冰上。
    注意：在非还原条件下分析蛋白质对于研究裂解后的同源二聚体或异源二聚体配体的形成至关重要，但如果仅分析裂解位点或裂解蛋白的水平，则无需采用非还原条件。除少数例外情况外，前结构域片段以单体形式分泌。此外，胚胎裂解液中存在的前体蛋白主要为未折叠的、定位于内质网的单体。因此，无需在非还原条件下分析这些产物。
  13. 在15% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上通过电泳分离前体蛋白及其切割产物。
  14. 使用电泳转印法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。
  15. 将膜与可识别前结构域和配体结构域（或插入这些结构域中的表位标签）的适当一抗孵育，洗涤后，再与合适的二抗孵育。使用化学发光或荧光成像法检测蛋白质。

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结果

以下实验的目的是确定当Bmp4和Bmp7在X. laevis中共同表达时，是否会形成异源二聚体（由一个Bmp4配体和一个Bmp7配体组成）、同源二聚体（由两个Bmp4或两个Bmp7配体组成），或两者的混合物。图中所示数据摘自先前发表的研究10。图2。图2A为示意图，显示了Bmp4或Bmp7同源二聚体前体以及Bmp4/7异源二聚体前体经蛋白水解成熟后产生的切割产物。Bmp4在其前结构域内有两个切割位点，生成两个前结构域片段（深绿色和黄色）以及一个二聚体配体片段（浅绿色），该片段在SDS-PAGE凝胶上的迁移位置约为26 kDa。Bmp7在单一位点被切割，生成一个前结构域片段（栗色）和一个二聚体配体片段（粉红色），后者在凝胶上的迁移位置约为35 kDa。异源二聚体配体的迁移位置约为30 kDa。配体二聚体中的银色条带代表插入该结构域的一个myc表位标签。

在2-4细胞期向X. laevis

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讨论

本方案的主要优势在于操作相对快速，无需昂贵的试剂，并可在生理条件下获得浓缩的Tgfß切割产物。另一个优点是可分析表位标签蛋白，从而避免因 commercially available 抗体难以获得而无法识别大多数Tgfß家族前结构域的问题。尽管也可在转染的培养哺乳动物细胞中分析表位标签Tgfß前体蛋白的切割情况，但使用X. laevis具有多项优势。X. laevis早期胚胎表达PC家族全部四种可能作为内源性Tgfß转化酶的成员（Furin、Pcsk5、Pcsk6和Pcsk7）13,14,16。某些哺乳动物细胞系并不表达一种或多种PC蛋白，因此需异位共表达前体蛋白及其转化酶才能研究其切割过程17。更为重要的是，转化细胞经瞬时转染所产生的前体蛋白水平过高，可能导致实验假象，例如错误折叠的切割产物被分泌；当前体蛋白水平超出内质网质量控制能力时，便可能发生此类情况

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Mary Sanchez 在动物护理方面提供的出色支持。本研究作者的工作得到了美国国立卫生研究院下属的国立儿童健康与人类发展研究所（NIH/NICHD）资助 R01HD067473-08 和 R21 HD102668-01，以及国立糖尿病、消化与肾脏疾病研究所（NIDDK/NIH）资助 R01DK128068-01 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ß-巯基乙醇FisherAC125470100
溴酚蓝FisherB392-5
氯化钙FisherC79-500
硝酸钙FisherC109-500
一次性研磨杵/组织研磨器Fisher12-141-364
Dumont #5 镊子Fine Science Tools11251-10
胎牛血清Atlanta BiologicalsS11150H
Ficoll 400Sigma AldrichF9378-500G
玻璃毛细管，1 × 90 mmNarshigeG-1
甘油FisherG33-4
HEPESFisherBP310-500
人绒毛膜促性腺激素Sigma AldrichCG10-10VL
注射器，1 mLFisher8881501368
L-半胱氨酸Sigma AldrichC7352
硫酸镁FisherM63-500
针头，26 GFisher305111
青霉素/链霉素Gibco15140148
皮升级显微注射仪Warner InstrumentsPLI-100A
拉针仪NarashigePC-100
氯化钾FisherP217-500
PVDF 膜Sigma AldrichIPVH00010
碳酸氢钠FisherS233-500
氯化钠FisherS271-10
十二烷基硫酸钠FisherBP166-500
氢氧化钠FisherS318-500
Tricaine-SPentairTRS5
TrisFisherBP152-5

参考文献

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TGF-β切割囊胚腔液非洲爪蟾胚胎BMP异源二聚体蛋白质显微注射SDS-PAGE蛋白质印迹胚胎裂解液蛋白水解切割前结构域片段
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