方法文章

Echinococcus granulosus 棘球蚴小体的瞬时转导

DOI：

10.3791/62783

⸱

2022年9月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍了一种在不同发育阶段快速进行瞬时转导的技术 细粒棘球绦虫 使用第三代慢病毒载体。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

囊性包虫病，又称棘球蚴病，是由寄生于犬类肠道的小型绦虫Echinococcus granulosus引起的重要人畜共患寄生虫病之一。目前迫切需要开展应用性遗传学研究，以阐明其致病机制并实现疾病的控制与预防。然而，由于缺乏有效的基因评估系统，阻碍了对包括Echinococcus属在内的绦虫寄生虫功能遗传学的直接解读。本研究展示了慢病毒介导的瞬时转导技术在E. granulosus的中绦期和节片化虫体中的应用潜力。从棘球囊肿中分离原头节（PSCs），并转移至特定的双相培养基中，诱导发育为节片化成虫。将收获的第三代慢病毒颗粒用于感染这些虫体，同时以HEK293T细胞作为转导过程的对照。在感染后24小时和48小时，在节片化虫体中检测到明显的荧光信号，表明E. granulosus中实现了慢病毒介导的瞬时转导。本工作首次尝试在绦虫中应用基于慢病毒的瞬时转导技术，展示了具有前景的研究成果，有望为扁形动物生物学的实验研究提供新的技术路径。

引言

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囊性包虫病（CE）是由绦虫引起的重要蠕虫病之一 细粒棘球绦虫， 带科内的小型绦虫1,2. 针对免疫诊断和疫苗开发的广泛研究 E. granulosus 已开展相关研究。然而，由于对寄生虫生物学的分子基础了解不足，给包虫病的诊断、治疗和预防带来了重大局限3,4,5,6.

近年来，随着基因组测序和转录组学方法的发展，多个研究团队已对扁形动物开展了广泛的分子生物学研究7,8,9。然而，在寄生虫领域，与某些原生动物已建立的高效且可重复的瞬时转导方法相比，寄生性扁形动物的基因转移技术进展仍然有限10,11,12。

在过去的二十年中，病毒递送系统已成为外源基因递送以及基因/蛋白研究的重要工具13。慢病毒能够感染分裂期和非分裂期细胞，因此可以感染终末分化不再分裂的细胞14,15,16。最近的研究证据表明，在哺乳动物细胞中使用基于慢病毒的转导系统有望克服以往基因敲入/敲低技术的大多数局限性。已有研究描述了携带适当分子标记（如GFP表达）的慢病毒表达载体的设计与构建方法16。因此，我们评估了慢病毒介导的GFP报告基因在E. granulosus原头节和链节化虫体中的瞬时转导效果。

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方案

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本研究已获得国家医学研究发展研究所和研究伦理审查委员会的批准，批准编号为958680。慢病毒被归类为生物安全二级（BSL-2）生物体；因此，本方案中的所有实验室培养操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，采用无菌实验室操作并在层流罩内进行。图1展示了针对不同阶段E. granulosus的研究方案示意图。

1. 收集包虫囊肿

  1. 从屠宰场常规屠宰的自然感染绵羊体内采集肝包虫囊肿。
  2. 在吸取原头蚴（PSCs）之前，使用无菌纱布和70%酒精彻底消毒囊肿表面。
  3. 将20–50 mL囊液抽出至无菌的50 mL锥形管中。
  4. 排空液体后，用锋利刀片切开囊壁，将生发层转移至无菌50 mL锥形管中，并短暂振荡（约2分钟），以提高原头蚴的收集率。随后将生发层转移至新的1.5 mL离心管中，用于分子鉴定。
  5. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗原头蚴3–5次。
  6. 将原头蚴置于0.1%伊红溶液中染色5分钟，于光学显微镜下观察以评估其活力。培养时应使用活力不低于95%的原头蚴。
  7. 用2 mL胃蛋白酶溶液（2 mg/mL，pH 2）处理原头蚴沉淀物15–20分钟。
  8. 为分离单个原头蚴，将原头蚴沉淀重悬于PBS中，并通过两层无菌纱布过滤至新的无菌50 mL锥形管中。
    注意：使用光学显微镜对50 µL原头蚴沉淀进行三次计数，取平均值。后续实验可根据该估算值确定原头蚴浓度（个/µL）。每个包虫囊肿分离株均应通过分子方法（如PCR测序17或高分辨率熔解曲线分析18）基于核苷酸多态性进行鉴定。

2. 通过双相培养 E. granulosus 的 PSCs 以获得成虫

注意：分离的PSCs应在II级生物安全柜中的无菌条件下进行培养。在进行后续步骤之前，需分别制备双相培养基的固体相和液体相19。

  1. 准备双相培养基，使其包含两个相。
    1. 固体相部分：向一个25 mL的培养瓶中加入10 mL牛血清，并在76 °C下静置凝固20-30分钟。
    2. 液体相部分（改良CMRL培养基）：在260 mL CMRL-1066培养基中加入100 mL热灭活的胎牛血清（FCS）、36 mL 5%酵母提取物、5.6 mL 30%葡萄糖（溶于蒸馏水）、1.4 mL含5%犬胆汁的PBS溶液、20 mM HEPES缓冲液和10 mM NaHCO3。最后向混合液中加入青霉素（100 IU/mL）和链霉素（100 mg/mL）。
  2. 向每个25 cm2培养瓶中加入10 mL液体相培养基。
  3. 向培养瓶中接种约5,000个PSCs，并将培养瓶放入CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中培养。
  4. 培养24-48小时后，将PSCs转移至含有固体相（牛血清）的新培养瓶中，每瓶加入1 mL相同的新鲜液体相培养基。将培养瓶放回CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中继续培养。
  5. 每5-7天根据培养基颜色变化及估计的PSCs分化比例更换新鲜的液体相培养基。
    注意：原头节在体外培养后对环境变化反应迅速，大多数会在2-3周内发生分化。由于营养物质的消耗以及原头节的生长发育，培养基的pH值发生变化，颜色逐渐变为橙色或黄色。

3. 多能干细胞的单相培养 E. granulosus

  1. 确保在转导前 24–48 小时完成单相培养。
    1. 在 25 cm2 培养瓶中，使用 RPMI 培养基和 10% 胎牛血清（FBS）培养约 5,000 个 PSC。
    2. 将培养瓶置于 CO2 培养箱（37 °C，5% CO2）中，直至使用。

4. 病毒生产与制备的细胞培养

注意：用于载体生产的人胚胎肾293T（HEK293T）细胞购自伊朗克尔曼医科大学病理学与干细胞研究中心。

  1. 将 5 × 105 个 HEK293T 细胞转移至含有 5 mL DMEM 培养基（含 10% FBS、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 25 cm2 培养瓶中。
  2. 在 37 °C、5% CO2 条件下培养 HEK293T 细胞，每 48 小时用完全培养基传代一次。最终使用低代次的 HEK293T 细胞进行转导20。

5. 使用第三代慢病毒载体进行病毒的生产与制备

注意：使用慢病毒载体 pCDH513b（转移载体）以及 PLPII、PLPI 和 PMD2G（辅助载体）来表达 GFP 报告基因。参见材料表和补充图 S1。

  1. 第1天：
    1. 消化HEK293T细胞后21 在6孔培养板中接种7 × 104 每孔细胞数，加入新鲜的不含抗生素的DMEM培养基 10% FBS.
    2. 使用钙磷酸盐法进行转导时，选择细胞密度为50%-60%融合度的细胞。
  2. 第2天：
    1. 在实验前2-3小时，用新鲜的不含抗生素的DMEM更换细胞培养基 2% 胎牛血清.
    2. 在1.5 mL离心管中，混合第三代慢病毒质粒，包括7 µg/µL pCDH513b（转移载体）、4 µg/µL PLPII、4 µg/µL PLPI和2 µg/µL PMD2G（辅助载体）。
    3. 加入HEPES缓冲液（0.28 M NaCl，0.05 M HEPES，1.5 mM Na2HPO4；将pH值为7.00–7.28的缓冲液加入混合物中，定容至422 µL。
    4. 加入16 µL的1% Tris-EDTA（TE）缓冲液至混合物中。
    5. 向各管中加入 62 µL 的 2.5 mM 氯化钙，充分混匀。
    6. 加入500 µL的2倍HEPES缓冲盐溶液（HBS）至混合物中， 逐滴加入，1-2 分钟内完成 使用巴斯德移液管轻轻混匀，直至获得半透明溶液，并在室温下孵育20分钟。
    7. 将混合物缓慢加入每块培养板中，并以缓慢的环形动作使其均匀分布。
    8. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育培养板2 培养箱中孵育，并在4-6小时后更换为不含抗生素的DMEM培养基 10% FBS.
  3. 第3天：
    1. 使用倒置荧光显微镜确认瞬时转导的成功及细胞活力。
  4. 第4天：
    1. 从培养基中收获病毒，收集每个孔的上清液，并于 -70 °C 保存备用。
      注意：收获的慢病毒可进行浓缩和滴定，以实现精确转导22.

6. 用病毒对E. granulosus不同发育阶段进行瞬时转导

  1. 第1天：
    1. 使用12孔培养板进行基因转导。以完全DMEM培养基作为内参，每组三复孔，接种5 × 103–5 × 104个HEK293T细胞。
    2. 在RPMI加10% FBS培养基中，每组三复孔，接种150个新鲜PSCs。
    3. 在含10%热灭活FBS的DMEM培养基中，每组三复孔，接种30条节片化蠕虫。
      注意：所有转导培养基必须不含抗生素。在整个过程中，为HEK293T细胞、PSCs和节片化蠕虫各保留三个未经处理的对照孔。
    4. 将1 × 106个病毒与4 µg/mL转染试剂（参见材料表）混合，用于转导HEK293T细胞及不同发育阶段的蠕虫。
    5. 将混合液缓慢加入各孔中，并通过缓慢的环形运动使其均匀分布。将培养板置于CO2培养箱中孵育4–6小时（37 °C，5% CO2）。随后更换为相同的完全培养基，以尽量减少转染试剂的毒性作用。
  2. 第2天：
    1. 重复步骤6.1.4–6.1.5，以提高HEK293T细胞、PSCs和节片化蠕虫瞬时转导的效率。
    2. 根据细胞培养基类型，在CO2培养箱中相同培养条件下继续孵育所有培养板24–48小时。
  3. 第3天：
    1. 通过荧光显微镜检测转导是否成功。
      注意：建议在基因转导过程中采用PCR/qPCR20,23或Western blotting24等进一步的确证实验进行验证。

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结果

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在此，我们介绍一种快速高效的瞬时转导技术 E. granulosus 通过使用第三代慢病毒载体，我们将PSCs在双相培养基中培养以获得横裂体虫，具体方法如前所述。25,266周后，原头蚴发育为链节状虫体 体外不同阶段的 E. granulosus 在双相培养基中观察到内陷的PSCs（图2A），外翻的PSCs（图2B），以及具有第一和第三节片体节形成的节片虫图 2C-E）。分别从单相和双相培养物中获得的原头蚴和链节化虫体，用表达GFP的慢病毒进行转染（图3为避免自发荧光干扰，将显微观察结果与三组样本的背景荧光进行比较，所有荧光信号高于背景水平的样本均被视为转染成功。<...

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讨论

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了解线虫和扁形动物生物学的分子基础对于理解人畜共患寄生虫的致病性至关重要27。缺乏有效的基因评估系统是直接解读绦虫寄生虫（包括Echinococcus属物种）功能遗传学的主要障碍12,27。本研究展示了慢病毒在E. granulosus中实现瞬时转导的优异潜力。

慢病毒转导结合了瞬时转导操作简便、速度快的特点，以及稳定细胞系表达水平高的优势，可用于将外源基因递送至哺乳动物细胞28。本研究的主要目标是阐明慢病毒载体转导的操作流程，该技术将在未来的包虫病研究中发挥关键作用。
本实验方案中需特别注意若干关键步骤。由于培养基中未添加抗生素，必须严格遵守无菌操作流程，否则在24小时后可能出现细菌和真菌污染。微生物污染会降低寄生虫的运动能力和存活率，且在72小时后，转染组和对照组的样本均将失效。

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究工作获得了伊朗德黑兰医学研究与发展国家研究所（NIMAD）精英研究人员资助委员会的资助，项目编号为958680。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔培养板SPL Life Sciences30012
25 cm2 培养瓶SPL Life Sciences70325
6孔培养板SPL Life Sciences30006
氯化钙Sigma-AldrichC4901-500G工作浓度：2.5 mM
CMRL 1066 培养基赛默飞世尔科技11530037
CO2 培养箱memmertICO150
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
狗胆汁从安乐死的犬只中分离，并通过0.2 μm滤膜除菌 μm 注射器滤器
伊红YSigma-AldrichE4009-5G配制0.1%伊红用于工作排除试验
胎牛血清（FBS）DNAbiotechDB9723-100ml热灭活 的 FBS（40℃下30分钟） °C)
胎牛血清（FCS）DNAbiotechDB9724-100ml热灭活 的 FCS（40 中 30 分钟） °C)
HEK293T细胞BONbiotechBN_0012.1.14人胚胎肾293T细胞
HEPES 缓冲盐水 (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x 浓缩液
倒置荧光显微镜OLYMPUSIX51
青霉素Sigma-AldrichP3032-10MU工作浓度：100 IU/mL
胃蛋白酶罗氏10108057001工作浓度：2 mg/mL，pH 2
磷酸盐缓冲液（PBS）DNAbiotechDB0011该试剂在去离子水中不到1分钟内溶解。
Polybrene（转染试剂）Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI 培养基BioIdeaBI-1006-05
碳酸氢钠（NaHCO₃）3)Sigma-AldrichS5761-1KG
链霉素Sigma-AldrichS9137-25G工作浓度：100 μg/mL
第三代慢病毒质粒（pCDH513b）SBI System Biosciences（BioCat GmbH）CD513B-1-SBI转移载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）
第三代慢病毒质粒（pLPI 和 pLPII）Invitrogen（Life Technologies）K4975-00辅助载体（购自伊朗马什哈德市伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）
第三代慢病毒质粒（pMD2G）Addgene质粒 12259辅助载体（购自伊朗马什哈德伊朗学术研究与文化教育中心（ACECR）分子医学研究部）
Tris/EDTA缓冲液（TE）DNAbiotechDB9713-100ml
胰蛋白酶Sigma-AldrichT9935-50MG1x 工作液（pH 7.4）–7.6)

参考文献

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