粒状棘球绦虫的短暂转导

Summary

我们使用第三代慢病毒载体描述了粒状 棘球绦虫 不同发育阶段的快速瞬时转导技术。

Abstract

囊性棘球蚴病或包虫病是由 粒状棘球绦虫 引起的最重要的人畜共患寄生虫病之一，棘球绦虫是一种藏耙在犬科动物肠道中的小绦虫。迫切需要应用遗传学研究来了解发病机制和疾病控制和预防。然而，缺乏有效的基因评估系统阻碍了对囊寄生虫（包括 棘球绦虫 属）的功能遗传学的直接解释。本研究证明了慢病毒基因瞬时转导在 颗粒埃马氏菌的元切除和杂化形式中的潜力。从包虫囊肿中分离出原结肠（PSC）并转移到特定的双相培养基中以发育成蠕动的蠕虫。用收获的第三代慢病毒以及HEK293T细胞转染蠕虫作为转导过程对照。在24 h和48 h的蠕动蠕虫中检测到明显的荧光，表明 颗粒埃布氏菌的瞬时慢病毒转导。这项工作首次尝试了绦虫中基于慢病毒的瞬时转导，并展示了对扁虫生物学实验研究具有潜在意义的有希望的结果。

Introduction

囊性棘球蚴病（CE）是由 粒状棘球绦 虫引起的最重要的蠕虫疾病之一，颗粒棘球绦虫是绦虫科^1，2中的一种小型绦虫。已经对 颗粒埃布氏菌 的免疫诊断和疫苗开发进行了广泛的研究。然而，对寄生虫生物学分子基础的了解不足对包虫病的诊断、管理和预防造成了重大限制^{3，4，5，6}。

近年来，由于基因组测序和转录组学方法的发展，几个研究小组^7，8，⁹对扁虫进行了广泛的分子研究。然而，在寄生虫世界中，与为某些原生动物^10，11，12开发的高度可重复的瞬时转导方法相比，寄生扁虫的基因转移技术进展仍然有限。

Protocol

本研究由国家医学研究发展研究所和研究伦理审查委员会批准，编号:958680。慢病毒被归类为BSL-2生物;因此，该协议中的所有实验室培养程序均使用无菌实验室实践进行，并根据NIH指南在层流罩下进行。 图1 显示了不同 颗粒芽孢杆菌 阶段的研究方案的示意图。

1. 收集包虫囊肿

1. 从屠宰场经常屠宰的自然感染的绵羊中收集肝脏包虫囊肿。
2. 在吸出原结肠（PSC）之前，使用无菌纱布和70%酒精完全灭菌囊肿表面。
3. 将 20-50 mL 包蒂液吸出到无菌的 50 mL 锥形管中。
4. 排出后，用锋利的刀片吸出囊肿，将生发层转移到无菌的50 mL锥形管中，并短时间（约2分钟）摇动以增加PSC的收集。
5. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤PSC 3-5x。
6. 在0.1%曙红中观察PSC5分钟，以确定光学显微镜下的PSC活力。使用培养存活率至少为 95% 的 PSC。
7. 用2毫升胃蛋白酶（2毫克/毫升，pH 2）处理PSC沉淀15-20分钟。
8. 为了分离单个PSC，将PSC沉淀物重悬于PBS中，并将其通过两层无菌纱布进入新的无菌50 mL锥形管中。
   注意:使用光学显微镜计算50μL PSC沉积物上三次计数的平均值。对于后续试验，使用估计值确....

Results

在这里，我们通过使用第三代慢病毒载体描述了颗粒桔梗的快速有效的瞬时转导技术。我们在双相培养基中培养PSCs以获得蠕动的蠕虫，如前所述^25，26。原结肠在体外6周后发育成蠕动的蠕虫。在双相培养基中观察到颗粒杆菌的不同阶段，包括内陷的PSCs（图2A），蒸发的PSCs（图2B）和具有第一和第三个孕节形成的蠕动蠕虫（图2C-E）。分别从单相和双相培养物中获得的原结肠和曲柄蠕虫用表达GFP的慢病毒转染（图3）。为避免自发荧光效应，将显微镜观察结果与所有三组样品的背景荧光进行比较，并将所有高于该背景水平的样品视为转染。

.......

Discussion

了解线虫和梧桐生物学的分子基础对于理解人畜共患寄生虫的致病性至关重要²⁷.缺乏有效的基因评估系统是直接解释茴香寄生虫（包括 棘球绦虫 属^12，27）功能性遗传学的主要障碍。本研究证明了慢病毒在 细粒埃布氏菌 瞬时转导中的优异潜力。

慢病毒转导将瞬时转导的简单使用和速度与稳定细胞系的强表达相结合，将转基因递送到哺乳动物细胞²⁸。这项工作的主要目标是说明慢病毒载体转导的过程，这在未来的棘球蚴病研究中至关重要。
该协议中必须注意特定的关键点。由于培养基中遗漏了抗生素，应遵守严格的无菌工作流程条件，如果没有抗生素，24小时后可以预期细菌和真菌污染。微生物污染降低了寄生虫的运动性和活力，转染和对照样品将在72小时后丢失。

选择梧桐生命周期中的适当阶段和合适的培养条件是基因转导成功的关键.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 孔培养板	SPL Life Sciences	30012
25 cm2 培养瓶	SPL 生命科学	70325
6 孔培养板	SPL Life Sciences	30006
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901-500G	工作浓度：2.5 mM
CMRL 1066 培养基	Thermo Fisher Scientific	11530037
CO2 培养箱	memmert	ICO150
D-（+）-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
DMEM	Life Technology	12100046
狗胆汁			从安乐死的狗中分离并由 0.2 &mu 绝育;m 针式过滤器
曙红 Y	Sigma-Aldrich	E4009-5G	准备 0.1% 的曙红用于工作排斥试验
胎牛血清 （FBS）	DNAbiotech	DB9723-100ml	热灭活 的 胎牛血清 （30 分钟 40 °C;C）
胎牛血清 （FCS）	DNAbiotech	DB9724-100ml	热灭活 的 FCS（30 分钟 40 度;C）
HEK293T细胞	BONbiotech	BN_0012.1.14	人胚胎肾 293T
HEPES 缓冲盐水 （HBS）	Sigma-Aldrich	51558-50ML	2x 浓缩液
倒置荧光显微镜	奥林巴斯	IX51
青霉素	Sigma-Aldrich	P3032-10MU	工作浓度：100 IU/mL
胃蛋白酶	罗氏	10108057001	工作浓度：2 mg/mL，pH 2
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	DNAbiotech	DB0011	该试剂可在不到 1 分钟的时间内在 D.W
聚凝胺中溶解（转染试剂）	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
RPMI 培养基	BioIdea	BI-1006-05
碳酸氢钠 （NaHCO3）	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
链霉素	Sigma-Aldrich	S9137-25G	工作浓度：100 &μ;g/mL
第三代慢病毒质粒 （pCDH513b）	SBI 系统 Biosciences （BioCat GmbH）	CD513B-1-SBI	转移载体（从伊朗马什哈德伊朗教育、文化和研究学术中心 （ACECR） 分子医学研究部获得）
第三代慢病毒质粒（pLPI 和 pLPII）	Invitrogen （Life Technologies）	K4975-00	辅助载体（从伊朗教育、文化和研究学术中心 （ACECR） 分子医学研究部商业获得，伊朗马什哈德）
第三代慢病毒质粒 （pMD2G）	Addgene	质粒 12259	载体（从伊朗教育、文化和研究学术中心 （ACECR） 分子医学研究部商业获得，伊朗马什哈德）
Tris/EDTA 缓冲液 （TE）	DNAbiotech	DB9713-100ml
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T9935-50MG	1x 工作溶液（pH 7.4–7.6）