使用流式细胞术定量评估 mTORC1 多活性细胞中的巨胞饮作用

摘要

该方案提供了实验工具来评估 mTORC1 过度活跃的细胞对营养物质（碳水化合物和蛋白质）的大胞饮细胞摄取。描述了量化荧光标记的葡聚糖和牛血清白蛋白 （BSA） 摄取的详细步骤。

摘要

巨胞饮作用是一种高度保守的、肌动蛋白依赖性的内吞过程，允许摄取细胞外物质，包括蛋白质和脂质。在增殖细胞中，巨胞饮作用可以将细胞外营养物质输送到溶酶体，加工成关键的大分子构建单元。最近的研究强调了多种癌症对巨胞饮作用的依赖性，包括乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌。Ras 突变被认为是巨胞饮作用启动背后的驱动事件，导致通过 mTORC1 信号通路激活细胞合成代谢过程。有趣的是，mTORC1 也可以被独立于 Ras 的巨胞饮作用激活。因此，巨胞饮作用代表了一种代谢脆弱性，可以通过限制其治疗性营养物质来靶向巨噬细胞肿瘤。

在结节性硬化症复合体 （TSC） 和淋巴管平滑肌瘤病 （LAM） 中，mTORC1 过度激活导致巨胞饮作用和代谢重编程增强。在这里，我们描述了一种基于流式细胞术的方案，用于定量评估哺乳动物细胞中的巨胞饮作用。采用 TSC2 缺陷型 MEF，其表现出 mTORC1 的异常激活，并且与表达 TSC2 的细胞相比，已被证明具有增加的巨胞饮作用。用巨胞饮作用的药物抑制剂处理的细胞与荧光标记的、赖氨酸可固定的 70 kDa 葡聚糖或荧光标记的牛血清白蛋白 （BSA） 一起孵育，通过流式细胞术测定。迄今为止，已经开发了强大的基于图像的技术来定量评估 体外 和 体内肿瘤细胞中的巨胞饮作用。该分析提供了多种实验条件下巨胞饮作用的定量评估，并补充了现有的基于图像的技术。

引言

巨噬作用是一种内吞过程，专门用于大量摄取细胞外物质，然后形成巨噬菌体，巨噬菌体要么循环到质膜上，要么与溶酶体融合以降解内化的货物 ^1,2。虽然货物摄取是非选择性的，但巨胞饮作用是一个多步骤过程，受 Rab GTP 酶和膜磷脂的严格调控 ^3,4。值得注意的是，癌细胞利用巨胞饮作用来内化细胞外营养物质，包括蛋白质、多糖和脂质。癌细胞中的巨胞饮作用被 Ras 或 v-Src 下游的癌基因激活，作为支持其增殖的一种机制，尤其是在营养应激条件下 ^5,6。因此，巨胞饮作用代表了一种通过破坏营养摄取途径来靶向癌细胞的新治疗方法 ^7,8。

在结节性硬化症复合体 （TSC） 和淋巴管平滑肌瘤病 （LAM） 中，TSC1 或 TSC2 的功能突变丧失导致雷帕霉素复合体 1 （mTORC1） 的哺乳动物/机械靶标过度激活⁹。已知异常的 mTORC1 激....

方案

1. 细胞处理

第 1 天

1. 使用 DMEM，补充有 10% FBS 的 DMEM 在六孔组织培养板的每个孔中，一式三份接种 TSC2 缺陷和表达 TSC2 的小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF）。到第 3 天，细胞应达到 60-70% 的汇合度。
   1. 为不会用 FITC-Dextran 或 TMR-BSA 染色的每种药物条件接种额外的对照孔。

第 2 天

2. 小心吸出培养基，并在室温下用 PBS 冲洗细胞两次。
   1. 用载体 （DMSO）、100 μM 磷脂酸 （PA）、25 μM EIPA、10 μM 利坦色林或 PA 和利坦色林的组合处理细胞。使用补充有 1% FBS 的 DMEM。
      注:DMSO 体积应等于处理条件下使用的溶剂的最大体积。例如，如果使用 10 μL 的 EIPA，则车辆条件下的 DMSO 体积也应为 10 μL。

第 3 天

3. 处理后 16 小时，用含有上述药物和 0.5 mg/mL FITC-葡聚糖或 0.5 mg/....

结果

利坦色林抑制 TSC2 缺陷细胞中的巨胞饮作用
我们之前已经表明，与表达 TSC2 的细胞相比，TSC2 缺陷细胞对营养物质的巨噬细胞吸收增加了三倍¹⁶。在 TSC 和 LAM 中，巨胞饮作用是通过甘油二酯激酶 α （DGKA） 介导的。DGKA 的代谢产物是磷脂酸 （PA），它是细胞膜的关键成分。因此，我们假设利坦色林对 DGKA 的抑制可能会影响 TSC2 缺陷细胞中的巨噬细胞囊泡运输。为了确定利坦色林对大胞饮细胞对外源性营养物质摄取的作用，使用 FITC-葡聚糖 （0.5 mg/mL， 70 kDa） 或 TMR-BSA （0.5 mg/mL） 进行摄取测定。选择 70 kDa 葡聚糖是因为这种大小的碳水化合物分子仅被巨胞饮作用吸收，而不是被其他形式的内吞作用吸收¹⁷。利坦色林处理 （10 μM， 16 h） 在 TSC2 缺陷细胞中抑制右旋.......

讨论

在这里，我们描述了一种使用流式细胞术评估巨胞饮作用的定量方法。该方法可准确、快速地测量荧光标记的大胞饮货物葡聚糖和白蛋白。先前的研究已经使用共聚焦显微镜方法仔细表征了癌细胞的大胞细胞指数^15,20。尽管这些方法准确地量化了巨噬菌体的内化、大小和空间分布，但它们需要分析每种实验条件的多个图像。相比之下，此处描述的技术允许同时评估多个实验条件和时间点。此外，流式细胞术方法提供了内化葡聚糖的绝对定量，这有利于当前的显微技术。

由于巨胞饮作用是一个动态过程，因此应针对每种感兴趣的细胞系优化与荧光标记的葡聚糖或 BSA 孵育的持续时间。根据我们的经验和对先前研究的同意，葡聚糖和 BSA 的最大摄取需要 30-60 分钟的孵育，并保持稳定长达 180 分钟^15,21。为了准确评估巨胞饮作用，建议.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	11965-092	生长培养基
EIPA（阿米洛利）	Sigma Aldrich	A3085	巨胞饮作用抑制剂
FBS	R&D Systems	S11150	胎牛血清
FITC-葡聚糖	Invitrogen	D1822	荧光多糖 （70kDa）
副叶糖	Pierce	28906	固定剂
PBS	Gibco	10010-023	磷酸盐缓冲液
盐水 青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4458-100ML	细胞培养抗生素
磷脂酸	Avanti	840101P	脂来源于鸡蛋
Ritanserin	Tocris	1955	DGKA 抑制剂
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	荧光白蛋白
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	25300-054	解离剂