使用流式细胞术对mTORC1高活性细胞中巨胞饮作用的定量评估

摘要

本方案提供了用于评估mTORC1高活性细胞通过巨胞饮作用摄取营养物质（碳水化合物和蛋白质）的实验工具。文中详细描述了定量检测荧光标记葡聚糖和牛血清白蛋白（BSA）摄取的实验步骤。

摘要

巨胞饮作用是一种高度保守的、依赖肌动蛋白的内吞过程，能够摄取细胞外物质，包括蛋白质和脂质。在增殖细胞中，巨胞饮作用可将细胞外营养物质递送至溶酶体，并被分解为关键的大分子合成原料。近期研究表明，多种癌症对巨胞饮作用具有依赖性，包括乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌。Ras基因突变被认为是启动巨胞饮作用的驱动事件，通过mTORC1信号通路激活细胞的合成代谢过程。有趣的是，巨胞饮作用也可在不依赖Ras的情况下激活mTORC1。因此，巨胞饮作用代表了一种代谢弱点，可通过治疗手段限制肿瘤对营养物质的获取，从而靶向依赖巨胞饮作用的肿瘤。

在结节性硬化症（TSC）和淋巴管平滑肌瘤病（LAM）中，mTORC1的过度激活导致巨胞饮作用增强及代谢重编程。本文介绍一种基于流式细胞术的定量评估哺乳动物细胞巨胞饮作用的实验方案。 TSC2-缺陷型MEFs被采用，这些细胞表现出mTORC1的异常激活，并且与对照组相比，巨胞饮作用增强 TSC2表达相关蛋白的细胞。用巨胞饮作用药理学抑制剂处理的细胞与荧光标记、可被赖氨酸固定的70 kDa葡聚糖或荧光标记的牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，并通过流式细胞术进行检测。迄今为止，已开发出可靠的基于成像的技术，用于定量评估肿瘤细胞中的巨胞饮作用。 体外 和 体内该分析可在多种实验条件下对巨胞饮作用进行定量评估，并补充现有的基于图像的检测技术。

引言

巨胞饮作用是一种内吞过程，负责大量摄取细胞外物质，随后形成巨胞饮体，这些巨胞饮体可被循环回质膜，或与溶酶体融合以降解所摄入的货物^1,2。尽管货物摄取是非选择性的，但巨胞饮作用是一个多步骤过程，受到Rab GTP酶和膜磷脂的严格调控^3,4。值得注意的是，癌细胞利用巨胞饮作用摄取细胞外营养物质，包括蛋白质、多糖和脂类。在Ras或v-Src下游的癌基因激活下，癌细胞中的巨胞饮作用被启动，作为一种支持其增殖的机制，尤其在营养胁迫条件下更为显著^5,6。因此，通过干扰营养物质摄取通路，巨胞饮作用成为靶向癌细胞的一种新型治疗策略^7,8。

在结节性硬化症复合征（Tuberous Sclerosis Complex, TSC）和淋巴管平滑肌瘤病（Lymphangioleiomyomatosis, LAM）中，TSC1 或 TSC2 基因的功能缺失性突变会导致哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1, mTORC1）的过度激活⁹。已知异常的 mTORC1 激活会驱动广泛的代谢重编程，包括葡萄糖和谷氨酰胺的摄取与利用、核酸合成增强、脂质合成以及自噬过程^10,11。为了满足这些增强的合成代谢需求，mTORC1 高度活化的细胞通过巨胞饮作用增加外源性营养物质的摄取，并增强溶酶体对内化物质的降解能力¹²。在近期的研究中，我们发现ritanserin——一种二酰基甘油激酶α（diacylglycerol kinase alpha, DGKA）的抑制剂——能够选择性地抑制 TSC2 缺陷细胞的增殖¹³。DGKA 是一种脂质激酶，可将二酰基甘油代谢为磷脂酸（phosphatidic acid, PA）¹⁴。PA 是一种关键的第二信使分子，同时在维持细胞膜稳态中发挥重要作用。令人意外的是，ritanserin 通过重编程 TSC2 缺陷细胞中的磷脂代谢，强烈抑制巨胞饮作用。因此，靶向 TSC2 缺陷细胞中巨胞饮介导的营养摄取通路，可能为 TSC 和 LAM 提供新的治疗策略。

大胞饮作用摄取的定量分析 体外 和 体内 可为巨胞饮泡形成调控提供关键见解，加速分子机制的发现，同时有助于识别新的治疗策略^2,6迄今为止，已开发出多种方法，可充分量化荧光标记葡聚糖的大胞饮摄取量 体外 和 体内^2,15. 本文介绍一种基于流式细胞术的方法，用于直接评估mTORC1高活性细胞中内吞的葡聚糖和白蛋白的量（图1该方法可用于平行分析多种实验条件，并可补充现有的基于图像的分析方法。

图 1．哺乳动物细胞巨胞饮作用评估的工作流程。 将细胞接种于六孔板中，随后用目标化合物处理。加入荧光标记的葡聚糖或 BSA 孵育 60 分钟，然后用预冷的 PBS 洗涤以终止摄取。使用多聚甲醛固定细胞，通过流式细胞术定量荧光强度。对细胞进行设门处理，并使用适当的软件分析数据。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 细胞处理

第1天

1. 将 TSC2 缺陷型和 TSC2 表达型小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）以每孔相同的三份重复接种于六孔组织培养板中，使用添加10% FBS的DMEM培养基。至第3天时，细胞融合度应达到60-70%。
   1. 为每种药物处理条件额外接种对照孔，这些孔将不使用FITC-葡聚糖或TMR-BSA进行染色。

第2天

2. 小心吸除培养基，并在室温下用 PBS 洗涤细胞两次。
   1. 用溶剂（DMSO）、100 µM 磷脂酸（PA）、25 µM EIPA、10 µM 利坦色林（ritanserin）或 PA 与利坦色林的组合处理细胞。使用添加了 1% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基。
      注意：DMSO 的体积应等于处理条件下所用溶剂的最大体积。例如，若使用 10 µL EIPA，则对照组中的 DMSO 体积也应为 10 µL。

第3天

3. 处理后16小时，更换为含上述药物、0.5 mg/mL FITC-葡聚糖或0.5 mg/mL TMR-BSA的无血清DMEM培养基。将细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育60分钟。
   ​注意：为尽量减少荧光染料的光漂白，FITC-葡聚糖和TMR-BSA的管子应包裹铝箔，且实验应在关闭照明的细胞培养柜中进行。
4. 吸除培养基，并用预冷的PBS洗涤两次。
   1. 使用500 µL胰蛋白酶消化细胞，在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育2–3分钟。
      ​注意：应在明场显微镜下观察，确保所有细胞均已脱落。
   2. 每次使用新的无菌吸头，用含1% FBS的DMEM冰上收集细胞至1.5 mL离心管中。
   3. 在4 °C条件下，以425 × g离心2分钟，沉淀细胞。
   4. 吸除上清液。
5. 用50 µL 2%多聚甲醛重悬细胞沉淀。
   警告：多聚甲醛具有高毒性，必须在合适的通风橱中操作。含甲醛的废液应按照机构规定进行处理。
   1. 室温孵育10分钟。
   2. 向每管中加入1 mL预冷的PBS，轻轻重悬细胞沉淀，并将离心管置于冰上。
6. 在4 °C条件下，以425 × g离心2分钟。
7. 吸除上清液。
   1. 用300 µL预冷的PBS重悬细胞沉淀。
   2. 将细胞转移至相应的流式细胞术检测管中，并置于冰上。
   3. 立即进行流式细胞术分析。

2. 流式细胞术

1. 在将细胞插入FACS样品架之前，先短暂涡旋混匀细胞。
2. 使用低速流速，根据图2A所示的适当激光功率，从每个未染色样品（阴性对照）中圈选活细胞。此步骤因仪器而异，需针对每个实验进行优化。调整前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）的功率，使活细胞与碎片或细胞团簇明显区分开。
3. 利用自动圈门功能，为每个样品选择活细胞群体，避免包含细胞碎片和细胞团簇。
   注意：流式细胞仪最终会记录所有细胞事件（无论是否被圈选）。因此，此步骤中的圈门选择并不关键。
4. 使用适当的绿色或红色激光记录每个样品的荧光强度。

3. 流式细胞术分析

1. 使用前向散射和侧向散射参数对细胞进行设门。将相同的门应用于所有样本。
2. 为每个样本的荧光信号绘制直方图，如图2B所示。
3. 在每个细胞门内，计算所有样本的平均/中位荧光强度。
4. 导出数据以进行适当的统计分析。
   注意：在数据分析过程中，应通过减去未染色样本的数值，对每个样本的平均/中位荧光强度进行归一化处理。

结果

Ritanserin 抑制 TSC2 缺陷细胞中的巨胞饮作用
我们先前已证明，与表达 TSC2 的细胞相比，TSC2 缺陷细胞对营养物质的巨胞饮摄取增加了三倍¹⁶。在结节性硬化症（TSC）和肺淋巴管平滑肌瘤病（LAM）中，巨胞饮作用通过二酰甘油激酶α（DGKA）介导。DGKA 的代谢产物是磷脂酸（PA），这是细胞膜的重要组成成分。因此，我们假设，Ritanserin 对 DGKA 的抑制可能会影响 TSC2 缺陷细胞中的巨胞饮囊泡运输。为了确定 Ritanserin 对外源性营养物质巨胞饮摄取的作用，我们使用 FITC-葡聚糖（0.5 mg/mL，70 kDa）或 TMR-BSA（0.5 mg/mL）进行了摄取实验。选择 70 kDa 的葡聚糖是因为该尺寸的碳水化合物分子仅通过巨胞饮作用被摄取，而不通过其他形式的内吞作用¹⁷。Ritanserin 处理（10 µM...

讨论

本文介绍了一种利用流式细胞术定量评估巨胞饮作用的方法。该方法可准确、快速地检测荧光标记的巨胞饮底物——葡聚糖和白蛋白。以往的研究已采用共聚焦显微镜技术对癌细胞的巨胞饮指数进行了细致表征^15,20。尽管这些方法能够精确量化巨胞饮体的内化程度、大小及空间分布 ，但每种实验条件下均需分析多幅图像。相比之下，本文所述技术可同时评估多种实验条件和时间点。此外，流式细胞术可对内吞的葡聚糖进行绝对定量，相较于现有的显微镜技术具有明显优势。

由于巨胞饮作用是一个动态过程，使用荧光标记的葡聚糖或BSA孵育的时间应针对每种目标细胞系进行优化。根据我们的经验并结合先前的研究，葡聚糖和BSA的最大摄取量需要30–60分钟的孵育时间，并可在长达180分钟内保持稳定^15,21为了准确评估巨胞饮作用，建议初始实验应包含多个时间点。此外，每次实验均应设置适当的阳性和阴性对...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Gibco	11965-092	生长培养基
EIPA (amiloride)	Sigma Aldrich	A3085	巨胞饮抑制剂
FBS	R&D Systems	S11150	胎牛血清
FITC-葡聚糖	Invitrogen	D1822	荧光标记多糖（70 kDa）
多聚甲醛	Pierce	28906	固定剂
PBS	Gibco	10010-023	磷酸盐缓冲液
青霉素/链霉素	Sigma Aldrich	P4458-100ML	细胞培养抗生素
磷脂酸	Avanti	840101P	来源于鸡蛋的磷脂
利坦色林	Tocris	1955	DGKA 抑制剂
TMR-BSA	Invitrogen	A23016	荧光标记白蛋白
胰蛋白酶	Sigma Aldrich	25300-054	解离试剂