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体外人树突状细胞的分化及其在利什曼原虫感染中的标志物

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DOI：

10.3791/62794

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2022年4月6日

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1Laboratory of Host-Parasite Interaction and Epidemiology, Gonçalo Moniz Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

树突状细胞（DC）是抵抗利什曼原虫感染的天然免疫中的关键组分。目前对树突状细胞与Leishmania之间复杂相互作用的机制仍知之甚少。本文描述了评估Leishmania感染如何影响人树突状细胞免疫生物学功能的方法，例如与迁移相关分子及共刺激分子的表达。

摘要

利什曼病包含一组与专性胞内原虫——利什曼原虫（Leishmania）感染相关的临床表现。Leishmania 寄生虫的生活史包括两个交替的发育阶段（无鞭毛体和前鞭毛体），分别寄生于节肢动物传播媒介或脊椎动物宿主体内。值得注意的是，Leishmania 寄生虫与免疫系统多种细胞之间的复杂相互作用在很大程度上影响着感染的结局。尤为重要的是，尽管巨噬细胞被认为是 Leishmania 繁殖的主要宿主细胞，但其他天然免疫细胞（如中性粒细胞和树突状细胞（DCs））也会吞噬这些寄生虫。

树突状细胞（DC）在连接先天免疫与适应性免疫方面发挥重要作用，从而协调针对多种病原体的免疫应答。目前尚不清楚Leishmania与树突状细胞相互作用的具体机制，该过程涉及病原体的摄取、树突状细胞成熟与活化的动态变化、树突状细胞向引流淋巴结（dLNs）的迁移，以及向T细胞呈递抗原等环节。尽管大量研究支持树突状细胞在调节抗Leishmania免疫应答中具有双重作用的观点，但这些细胞在机体对Leishmania感染的易感性或抗性中的具体参与机制仍不明确。感染后，树突状细胞会经历一个成熟过程，伴随表面主要组织相容性复合体（MHC）II类分子以及共刺激分子（即CD40、CD80和CD86）的表达上调。

了解树突状细胞（DCs）在感染结局中的作用，对于开发调节免疫反应的治疗和预防策略至关重要 利什曼原虫. 本文描述了一种用于表征的方 利什曼原虫-DC 相互作用。本详细方案提供了树突状细胞（DC）分化、细胞表面分子表征及感染实验各步骤的指导，使科研人员能够研究 DC 对病原体的响应 利什曼原虫 感染，并深入了解这些细胞在感染过程中的作用。

引言

利什曼病是一组由利什曼原虫属（Leishmania）不同物种引起的被忽视热带病1。Leishmania 是锥虫科的一种胞内原虫，可感染人类及其他哺乳动物，导致从皮肤损伤到内脏型疾病等一系列临床表现2。该病的主要临床形式为皮肤利什曼病（TL）和内脏利什曼病（VL）。世界卫生组织（WHO）估计，每年新增病例在70万至100万例之间，导致约7万人死亡2。全球范围内，约有1200万至1500万人受此病影响，另有3.5亿人面临感染风险3。

利什曼原虫属（Leishmania）具有两种进化形态：前鞭毛体和无鞭毛体4。Leishmania 前鞭毛体的特征是具有鞭毛并具有高度运动性。这些形态存在于白蛉的消化道中，在其中分化为具有感染性的形式（前循环前鞭毛体）5。相比之下，无鞭毛体则存在于受感染的哺乳动物细胞的细胞内环境中。这种进化形态继而在吞噬细胞的吞噬溶酶体中进行复制6。

传播周期 利什曼原虫属（Leishmania spp.） 在白蛉将前鞭毛体注入宿主皮肤并吸血时开始1不久之后 利什曼原虫 接种后，先天免疫细胞（包括中性粒细胞和组织驻留型巨噬细胞）吞噬寄生虫。在寄生泡内， 利什曼原虫 分化为无鞭毛体并进行复制，最终导致宿主细胞膜破裂，从而感染邻近细胞并促进寄生虫扩散4当白蛉摄入含有无鞭毛体的吞噬细胞后，这些无鞭毛体在昆虫肠道内先分化为前循环型前鞭毛体，随后进一步发育为感染性前鞭毛体，从而完成生活史循环。7.

树突状细胞是存在于组织和淋巴结中的专业抗原呈递细胞，在免疫系统中发挥哨兵作用8。这些细胞在未成熟阶段主要分布于外周组织，主要参与抗原的捕获与加工处理。在接触病原体后，树突状细胞会经历成熟过程，最终迁移至淋巴结，并将抗原呈递给初始型CD4+ T细胞。这些细胞在协调先天性和适应性免疫反应中也至关重要，可诱导免疫耐受或炎症反应9。树突状细胞的成熟过程涉及多个方面，包括MHC分子和共刺激分子（如CD40和CD86）表达上调，以及细胞因子分泌能力增强。树突状细胞表达多种标志物，包括CD11b和CD11c；在人类中，由CD14+单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）表达CD1a10。CCR7在树突状细胞上高表达，反映了这些细胞复杂的迁移过程12。CD209和CD80也在树突状细胞与淋巴细胞的初始接触中发挥重要作用13。

在利什曼病中，研究表明，单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）可吞噬寄生虫并将其运送至引流淋巴结（dLNs），在其中向T细胞呈递抗原13寄生虫捕获机制与吞噬过程中肌动蛋白丝介导的细胞骨架重组相关，该过程促进寄生虫的内化14. 大多数关于树突状细胞在利什曼病中作用的研究主要集中在 L. major, L. amazonensis，以及 L. braziliensis15有趣的是， 体内 研究 利什曼原虫 感染研究表明，树突状细胞功能的受损以寄生虫菌株特异性的方式发生。

已有研究表明，在早期阶段 L. amazonensis 感染后，DCs 抑制寄生虫感染的能力下降。相反，在一种实验性模型中 L. braziliensis 感染后，DCs表现出适当的免疫应答，从而限制了利什曼原虫的存活16已知与不同反应特征相关的主要方面 利什曼原虫属（Leishmania spp.） 感染程度与DC的成熟和活化程度密切相关。本文描述了一种研究人DC在其中所起作用的方法 利什曼原虫 感染，以进一步理解这些细胞如何影响疾病结局。

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方案

注意：细胞来自健康捐献志愿者。本研究所述操作程序已获巴西巴伊亚州Fiocruz国家伦理委员会批准（编号2.751.345）。

1. 人树突状细胞的分化

  1. 用移液器将10 mL多蔗糖-三碘水合物混合液加入50 mL锥形管中。
  2. 分别为每位供体标记50 mL锥形管。
  3. 从健康供体采集30 mL血液，并在层流罩内进行所有后续操作。
  4. 小心地将血液转移至锥形管中，并在室温下以1:1比例用生理盐水（0.9%氯化钠溶液）稀释血液。
  5. 将缓慢稀释后的血液小心地铺加到管中的多蔗糖-三碘水合物混合液上（步骤1.1）。在25 °C下以400 × g离心30分钟。
    注意：离心前关闭刹车，以防止梯度层混合。第一次离心后，将离心机温度降至4 °C。
  6. 小心地将管子从离心机中取出。
  7. 观察样本中形成的外周血单个核细胞（PBMCs）环层（即血沉棕黄层）；用移液器小心吸除残留的血浆。
    注意：离心后会形成以下梯度层：红细胞层、密度梯度介质层、PBMC环层和血浆层。PBMC环位于密度梯度介质层与血浆层之间。
  8. 将浑浊的PBMC层转移至另一管中，并加入生理盐水至终体积为30 mL。
  9. 在4 °C下以250 × g离心含有细胞悬液的管子10分钟。弃去上清液，并加入1 mL生理盐水重悬沉淀。
  10. 取一部分细胞用于计数，并以1:1,000比例稀释。取10 µL稀释后的细胞，使用台盼蓝排斥法结合血球计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数，以确定细胞活力。
  11. 再次在4 °C下以200 × g离心细胞悬液10分钟。
  12. 用磁性激活细胞分选（MACS）缓冲液重悬沉淀。每1 × 107个细胞使用80 µL缓冲液。
    注意：MACS缓冲液的组成见表1 。保持缓冲液低温，并储存在2–8 °C。
  13. 向步骤1.9制备的细胞悬液中加入CD14微珠。每1 × 107个细胞使用20 µL CD14微珠。
    注意：CD14微珠用于从PBMC中正向筛选人单核细胞，因为含有人抗CD14抗体的微珠可结合大多数单核细胞表面表达的CD14+细胞。
  14. 上下吹打混匀沉淀和微珠，冰上孵育15分钟。
  15. 在4 °C下以300 × g离心悬液10分钟。
  16. 用MACS缓冲液重悬细胞。在细胞-微珠混合物中，每1 × 107 个细胞使用1–2 mL缓冲液。
  17. 在4 °C下以300 × g离心悬液10分钟。
  18. 弃去上清液，并将沉淀重悬于500 µL MACS缓冲液中。
    注意：此为单个分选柱可处理的细胞悬液最大体积。
  19. 组装磁性分选柱。
  20. 用500 µL MACS缓冲液冲洗分选柱一次，让缓冲液依靠重力自然流过柱子。
    注意：注意不要让柱子变干，因为空气可能堵塞柱子。
  21. 每根柱子加入500 µL细胞-微珠悬液（步骤1.19）。让细胞悬液依靠重力自然流过柱子。
  22. 用500 µL MACS缓冲液洗涤柱子两次。仅当柱子储液室排空后才加入新鲜缓冲液。切勿让柱子变干。
  23. 在柱子下方放置一个新管，用移液器将1 mL MACS缓冲液加到柱子上，然后迅速推动推杆，将磁性标记的细胞从柱子中洗脱出来。
  24. 在4 °C下以300 × g离心CD14富集的细胞10分钟。
  25. 使用血球计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。
  26. 将细胞重悬于1 mL含白细胞介素-4（IL-4）（100 µL/mL，即50 ng/mL）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（50 ng/mL）的完全RPMI培养基中。
  27. 将细胞以每孔2 × 105 个细胞的密度接种于24孔板中，每孔含500 µL上述含细胞因子的完全RPMI培养基，在37 °C孵育7天。

2. Leishmania 培养

注意：本实验使用了L. amazonensis（MHOM/BR88/Ba-125）寄生虫。

  1. 在25 cm²培养瓶中，使用5 mL Schneider完全培养基或最低必需培养基（MEM）维持前鞭毛体于Novy-Nicolle-MacNeal（NNN）血琼脂培养基上2 在24℃的生化需氧量（BOD）培养箱中培养细胞瓶 °C.
    注意：为了培养利什曼原虫的前鞭毛体形态 L. amazonensis 物种，5 mL 完全 Schneider 培养基（Schneider ́昆虫培养基中含10%灭活胎牛血清（FBS）和浓度为50的庆大霉素 µg/mL）被使用。
  2. 在24℃下孵育7天 °BOD 培养箱中 37°C 培养。
  3. 移液100 µL 原虫培养物转移至新的 25 cm² 培养瓶中2 细胞培养瓶
  4. 加入5 mL添加了补剂的MEM。
  5. 在24℃下孵育 °在BOD培养箱中培养，并通过将生理盐水稀释的寄生虫细胞悬液 aliquot 转移至Neubauer计数板（即血细胞计数板），定期计数前鞭毛体，直至达到稳定期。
    注意：请勿将NNN培养基初代传代后的培养液用于实验。
  6. 转移 1 × 105 的 利什曼原虫 静止生长期前鞭毛体转入新的25 cm²培养瓶2 细胞培养瓶中加入5 mL含补充物的MEM。
  7. 使用血细胞计数板定期监测培养物的生长情况，直至达到稳定期。
    注意：使用前鞭毛体培养物时，传代次数不超过7代 体外 以避免毒力丧失。

3. Leishmania 感染

  1. 确认培养的寄生虫已进入稳定生长期后，将培养瓶中的全部内容物转移至50 mL锥形管中，并加入冷的生理盐水，使终体积达到30 mL。
  2. 在4 °C条件下以1,600 × g离心10分钟，重复三次。每次离心后弃去上清液，并将沉淀重悬于冷的生理盐水中。
  3. 洗涤细胞以去除任何无活力的寄生虫，并将沉淀重悬于1 mL冷的生理盐水中。将悬液缓慢通过装有16 G针头的1 mL注射器5次，以分散寄生虫聚集体。
  4. 取少量样品，使用血细胞计数板并依据公式（1）计算寄生虫浓度。
    寄生虫浓度 = 4个象限内寄生虫数的平均值 × 稀释倍数 × 104 （1）
  5. 根据待铺板的宿主细胞数量，计算所需Leishmania sp.的用量，以维持10:1的寄生虫与宿主细胞比例（见步骤1.27）。
  6. 加入1 mL生理盐水洗涤树突状细胞（DCs），并在室温下以300 × g离心10分钟，重复洗涤三次。
  7. 将所需体积的Leishmania加入24孔细胞培养板的每一孔中（参见步骤3.5）。
  8. 将树突状细胞与寄生虫在37 °C、5% CO2的培养箱中共同孵育4小时。

4. 流式细胞术分析的免疫染色

  1. 感染后，用 1 mL 生理盐水洗涤细胞两次，以去除未被内化的寄生虫。
    注意：抗体克隆及荧光染料组合列于材料表中。
  2. 将抗体（1:50 稀释）加入荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含 1% BSA 的 1× PBS）中，每种实验条件下的终体积为 50 µL。
    注意：实验前应对抗体进行滴定，以确保染色浓度最优。本方案中经滴定实验后采用 1:50 的稀释比例。
  3. 配制母液（含 1% BSA 的 1× PBS + 抗体混合液）。涡旋混匀后，每孔加入 50 µL 混合液至含有细胞的孔中。
  4. 将树突状细胞与抗体混合液（抗人 CD1a、抗人 CCR7、抗人 CD83、抗 CD11c、抗人 CD209、抗人 HLA-DR）在冰上避光孵育 30 分钟。
  5. 用 1 mL 冷染色缓冲液（含 1% FBS 的 1× PBS）洗涤细胞两次，于 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
  6. 吸除上清液，将沉淀重悬于 200 µL 冷染色缓冲液中。
  7. 在流式细胞仪上进行数据采集。
    注意：为确保 FACS 分析的最佳条件，应在样本染色后 48 小时内完成数据采集。数据分析使用 FlowJo 软件进行。
    1. 打开 FlowJo 软件程序并创建一个新的工作区。通过将流式细胞术文件拖入工作区窗口来添加待分析文件。
    2. 点击管名称，选择侧向散射光（SSC）和前向散射光（FSC）参数。
      注意：树突状细胞成熟的流式细胞术分析基于 CD1a、CD11c、CD80、CCR7、CD209 和 HLA-DR 的表达水平。
    3. 使用多边形门控工具，在树突状细胞周围绘制门控。双击选中的门控细胞以显示新窗口。通过选择 FSC-A 和 FSC-H 参数进行双峰细胞清除。使用多边形工具，在单个细胞周围绘制新的图示。
    4. 双击门控后的细胞，选择 SSC 和 CD11c 参数，生成包含 CD11c+ 细胞的门控。
    5. 选中已清理的 CD11c+ 细胞门控并导出。右键点击该门控，选择选择等效节点选项。再次右键并选择将该门控及其所有补偿参数导出，保存至最近创建的文件夹中。
    6. 通过打开最近保存的文件创建一个新工作区。点击工作区，选择插件 | 下采样 | 30,000 至 50,000 个事件，然后点击确定。
      注意：由于 tSNE 分析既耗时又对计算资源要求较高，建议执行此步骤以减少待分析事件的总数。
    7. 右键点击一个下采样后的文件，选择等效节点。
    8. 右键点击一个下采样后的文件，选择导出/合并。
    9. 点击合并窗口，选择所有补偿参数。选中合并后的文件，点击工作区 | 插件 | tSNE。
    10. 选择目标参数（CD1a、HLA-DR、CCR7、CD80、CD209 和 CD11c）以生成聚类。点击确定。
    11. 点击合并后的文件，查看 tSNE1 和 tSNE2 参数。

5. 肌动蛋白免疫染色

  1. 将感染的DC接种于置于24孔板中的盖玻片上。在4 °C下以300 × g离心10分钟。感染后于室温用无菌生理盐水洗涤细胞3次，以去除任何细胞外寄生虫。
  2. 用500 µL的4%多聚甲醛在室温下孵育DC 15分钟。去除多聚甲醛后加入1 mL生理盐水（见表1）。

6. 免疫标记

注意：以下步骤需在振荡条件下进行。

  1. 用 1x PBS 清洗盖玻片，每次 5 分钟，重复 3 次。每孔加入 500 µL 氯化铵溶液，在室温下孵育 10 分钟。
  2. 用 1x PBS 清洗盖玻片，每次 5 分钟，重复 3 次。
  3. 用 0.15% 皂苷处理 15 分钟以通透细胞膜。
  4. 用含 1x PBS、3% BSA 和 0.15% 皂苷的封闭液封闭 1 小时。用含 0.15% 皂苷的 1x PBS 清洗盖玻片，每次 5 分钟，重复 3 次。
  5. 加入鬼笔环肽（按 1:1,200 稀释于含 1% BSA 和 0.15% 皂苷的 1x PBS 中），室温孵育 1 小时。用含 0.15% 皂苷的 1x PBS 清洗盖玻片，每次 5 分钟，重复 3 次。
  6. 将带有细胞的一面朝下置于含有 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂上。用铝箔包裹载玻片以避光。
  7. 使用配备 63x/1.4 物镜的共聚焦荧光显微镜采集图像。

7. 共聚焦显微镜图像采集与Fiji定量分析

  1. 使用共聚焦激光扫描显微镜（参见材料表）采集免疫荧光图像。
    注意：为获得最佳分辨率，请使用63倍油浸物镜。
  2. 将盖玻片避光保存，并在成像前于室温下放置至少30分钟。
  3. 用吸水纸清洁盖玻片。在物镜上滴加一滴镜油，将玻片置于显微镜载物台上。选择63倍油镜，升起载物台直至镜油接触玻片，然后调节显微镜焦距。
  4. 打开程序，激活488、552和405 nm的激光波长。
  5. 将图像分辨率设置为1024 × 1024像素。
  6. 点击live bottom，设置Z stack，然后按下Begin。重复此过程，随后按下End按钮。
  7. 等待图像采集完成，然后在tools中选择Maximum Projection选项。
  8. 保存实验，并将.lif格式的图像导出至计算机。
  9. 打开FIJI程序，在FIJI中打开实验，将view stack设置为Hyperstack。
  10. 选择open image files individually | stitch tiles。
  11. 在Fiji工具栏中选择free hand工具，手动仔细描记每个细胞。按下analyze | measure以查看荧光强度。对每组中的每种细胞类型重复此过程。
  12. 保存测量结果并导出至电子表格。使用统计分析软件（参见材料表）打开数据文件，进行统计分析。

8. 统计学分析

  1. 在软件中新建一个项目。
  2. 对于符合正态分布的数据，使用 Student's t-检验；对于非参数数据，使用 Mann-Whitney U 检验。
  3. 将实验结果获得的数值粘贴到表格中。
  4. 选择 描述性统计 ，并选择 列统计 [所有检验] 选项以分析数据分布。
    注意：如果数据符合高斯分布，选择 t 检验，通过比较两组样本进行分析；如果分布为非高斯分布，则使用 Mann-Whitney U 检验，并结合集中趋势指标（均值或中位数）和变异程度指标进行数据分析。
  5. 选择 最佳图表 选项以实现最优的数据呈现。

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结果

本报告研究了树突状细胞（DCs）的作用 利什曼原虫 使用流式细胞术和共聚焦显微镜检测感染。首先建立人单核细胞来源的树突状细胞的表型特征。值得注意的是，所获得的CD11c+ 树突状细胞群体对 CCR7、CD209、CD80、CD1a 和 HLA-DR 呈阳性。结果表明，这些标志物在树突状细胞群体中的表达受到显著影响 利什曼原虫 感染。感染的树突状细胞表现出CD80、CD209、CCR7和HLA-DR表达增强。然而，CD1a的下调也在其中被观察到 L. amazonensis-感染的DCs。此外，主成分分析显示这些分子的表达存在显著差异（图1B-D）。采用了t分布随机邻域嵌入（t-SNE）算法，这是一种降维技术，用于更清晰地展示数据的可视化聚类情况 利什曼原虫 感染影响成熟相关分子的表达。

值得注意的是，tSNE 密度图显示感染的树突状细胞在 HLA-DR 和 CD8...

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讨论

利什曼病是全球范围内严重的公共卫生问题。该疾病的发病机制相当复杂，有利于寄生虫在脊椎动物宿主内存活的机制仍不明确17。树突状细胞（DCs）是遍布全身的专业抗原呈递细胞，存在于包括滤过器官和淋巴器官在内的多种组织中。在捕获并处理抗原后，未成熟DC经历复杂的成熟过程，最终迁移至淋巴结，在此将抗原呈递给T淋巴细胞18。该成熟过程的特征是MHC II类分子表达增加，特别是CD11c、CD86、CD80和CD1a的表达上调19。在利什曼病中，单核细胞来源的DC吞噬寄生虫，并将抗原运送至引流淋巴结（dLNs），从而诱导T细胞的抗原呈递13。

本文描述了一项简明的实验方案，可用于研究特定因素的影响 利什曼原虫 树突状细胞免疫生物学功能的研究 体外 感染模型。本方案包含使用先进的免疫学技术，如从人单核细胞获取并分化为树突状细胞（DCs），以及通过流式细胞术和共聚焦显微镜对D...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢巴西巴伊亚州的贡萨洛·莫尼兹研究所（IGM-Fiocruz）及显微镜学部门提供的协助。作者们感谢 Andris K. Walter 在关键分析、英文语言修改以及稿件编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 CCR7Thermo
抗 CD209Isofarma
抗 CD83Leica SP8
抗 HLA-DRGibco
牛血清白蛋白ThermoA2153-100GSigma
环丙沙星Gibco
共聚焦显微镜Thermo Fisher Scientific
胎牛血清Gibco
Flow JoThermo Fisher Scientific
庆大霉素Thermo Fisher Scientific
谷氨酰胺Gibco
HEPESThermo Fisher Scientific
鬼笔环肽Thermo Fisher Scientific
磷酸缓冲液Peprotech
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片试剂盒BD pharmigen
RPMI 培养基BD pharmigen
皂苷BD pharmigen47036 – 50G – FSigma
Schneider's 昆虫培养基BD biosciences 软件

参考文献

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