小鼠全心介观光学成像

摘要

我们报告了一种通过结合组织转化和染色技术的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发，实现小鼠全心脏介观重建的方法。

摘要

遗传性和非遗传性心脏疾病均可导致心脏发生严重的重构过程。结构性重构，例如胶原沉积（纤维化）和细胞排列紊乱，可能影响电传导，引发电机械功能障碍，并最终导致心律失常。目前对这些功能改变的预测模型主要基于非整合性和低分辨率的结构信息。由于常规成像方法在大体积组织中难以实现高分辨率成像，将该框架提升至更高量级面临巨大挑战。在本研究中，我们描述了一种方法学框架，可实现对完整小鼠心脏的微米级分辨率成像。实现这一目标需要综合技术上的努力，结合组织转化与成像技术的最新进展。首先，我们介绍了一种优化的CLARITY方案，能够将完整的心脏转化为一种纳米多孔、水凝胶杂交且无脂质的形式，从而实现高透明度和深度染色。随后，我们描述了一种荧光光片显微镜，能够以微米级分辨率快速获取介观视野（毫米尺度）的图像。该显微镜基于mesoSPIM项目设计，可在单次断层扫描中完成对整个小鼠心脏的微米级分辨率三维重建。我们认为，这一方法学框架将有助于阐明细胞架构紊乱在电功能障碍中的作用，并为整合功能与结构数据的综合模型奠定基础，从而实现对组织重构后引发电和机械功能改变的结构性原因进行统一研究。

引言

与心脏疾病相关的心脏结构重塑可能影响电传导，并引发器官的电机械功能障碍^1,2。目前用于预测功能改变的方法通常采用磁共振成像（MRI）和弥散张量磁共振成像（DT-MRI），以整体重建心脏中的纤维化沉积、血管树及心肌纤维分布，并用于模拟动作电位在心脏组织中的优势传播路径（APP）^3,4。这些策略能够提供心脏结构组织的宏观概览。然而，其空间分辨率不足以在细胞水平上研究结构重塑对心脏功能的影响。

将该框架应用于不同数量级的尺度，使单个细胞在动作电位传播中发挥独立作用，具有挑战性。主要限制在于标准成像方法难以在大尺度（厘米级）组织中实现高分辨率成像（微米级分辨率）。事实上，由于生物组织具有不透明性，对其进行三维高分辨率成像非常复杂。目前对完整器官进行三维重建最常用的方法是制备薄切片。然而，精确的切片、拼接和成像需要耗费大量人力和时间。另一种无需切割样本的替代方法是制备透明化组织。近年来，已提出多种组织透明化技术^5,6,7,

方案

所有动物操作和实验程序均遵循欧洲议会关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU指南，并符合意大利卫生部的伦理原则与规定。实验方案已获得意大利卫生部批准（批准号：647/2015-PR）。所有实验动物均由意大利ENVIGO公司提供。本实验使用了5只6月龄的雄性C57BL/6J小鼠。

1. 溶液配制

1. 在通风橱中配制4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.6）。将4% PFA分装后于-20 °C保存数月。
2. 配制水凝胶溶液：在通风橱中将4%丙烯酰胺、0.05%双丙烯酰胺、0.25%引发剂AV-044溶于0.01 M PBS中。整个配制过程中保持试剂和溶液处于冰上。将水凝胶溶液分装后于-20 °C保存数月。
3. 配制透明化溶液：在通风橱中将200 mM硼酸和4%十二烷基硫酸钠（SDS）溶于去离子水中，调节pH至8.6。将溶液储存于21–37 °C之间，以避免SDS析出。
4. 实验当天新鲜配制台氏液：加入10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、113 mM NaCl、1.2 mM MgCl₂和4.7 mM KCl，用1 M NaOH调节pH至7.4。

2. 心脏分离

1. 在心脏分离手术前30分钟，皮下注射0.1 mL含500 I.U.肝素的溶液。
2. 用新鲜的T....

结果

所开发的被动透明化装置可在约3个月内获得透明化处理的成年小鼠心脏（尺寸约为10 mm × 6 mm × 6 mm）。该装置的所有组件安装方式如图1所示。每个透明化腔室之间极小的温度梯度（约3°C）可确保所有腔室内的温度维持在适宜范围内。

图1：被动透明化装置示意图。 透明化溶液（过滤后）在蠕动泵的辅助下依次流经样品室。将溶液容器置于设定为50 °C的水浴中，可使样品室内的溶液温度维持在37–45 °C之间。图片由Biorender.com制作。

讨论

本研究介绍了一种成功实现小鼠全心高分辨率透明化、染色及成像的有效方法。首先，对组织转化技术（CLARITY）进行了优化，并针对心脏组织的应用进行了轻微调整。事实上，为了实现全心组织的高效三维重建，防止光散射现象至关重要。CLARITY 方法可获得高度透明且结构完整的心脏组织，但若采用被动方式进行，所需孵育时间较长（约5个月）。与脑组织不同，心脏组织不适合使用电场驱动的主动透明化方法，因为即使在低电压下，电场也会导致组织损伤和破裂。本文优化了一种被动透明化方案，可在约3个月内获得完全透明的心脏样本。在通过近端主动脉分离并插管心脏后，按照方案第3节所述执行CLARITY操作。为加快处理速度，设计了一套自制的被动透明化装置（图1），使组织透明化时间缩短了约40%。该装置由透明化溶液容器、水浴槽、蠕动泵、多个含有不同样品架的腔室、每个腔室配备的胶囊过滤器以及用于溶液循环的管路系统组成。泵将溶液从容器中依次抽出并流经各个腔室，样品即在腔室内进行透明化处理。在进入腔室前，溶液会经过胶囊过滤器，以捕获透明过程中从组织中清除的脂质。通过将溶液容器置于50 °C水浴中，可在循环过程中维持腔室内透.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-2’ 硫代二乙醇	Sigma-Aldrich	166782
丙烯酰胺	伯乐（Bio-Rad）	61-0140
AV-044 引发剂	和光纯药工业株式会社	AVP5874
双丙烯酰胺	伯乐（Bio-Rad）	161-042
硼酸	Sigma-Aldrich	B7901
相机	滨松	Orca flash 4.0 v3
相机软件	滨松	HC 图像
准直透镜	Thorlabs	AC254-050-A-ML
检测臂	集成光学	0638L-15A-NI-PT-NF
激发透镜	尼康	91863
Exteraì石英比色皿	Portmann Instruments	UQ-753
折叠镜	Thorlabs	BBE1-E02
振镜	Thorlabs	GVS211/M
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	滨松	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
内置石英比色皿	波特曼仪器	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
激光光源	集成光学	0638L-15A-NI-PT-NF
长通滤光片	Thorlabs	FELH0650
磁力底座	Thorlabs	KB25/M
MgCl₂2	化学实验室	CI-1316-0250
电动平移台	物理仪器	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
目标	Thorlabs	TL2X-SAP
多聚甲醛	Agar Scientific	R1018
磷酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
中继透镜	Qioptiq	G063200000
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	L3771
管镜	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
可调谐透镜	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
真空泵	KNF Neuberger 公司	N86KT.18
水浴锅	Memmert	WTB