我们报告了一种通过结合组织转化和染色技术的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发，实现小鼠全心脏介观重建的方法。
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摘要
摘要
遗传性和非遗传性心脏疾病均可导致心脏发生严重的重构过程。结构性重构，例如胶原沉积（纤维化）和细胞排列紊乱，可能影响电传导，引发电机械功能障碍，并最终导致心律失常。目前对这些功能改变的预测模型主要基于非整合性和低分辨率的结构信息。由于常规成像方法在大体积组织中难以实现高分辨率成像，将该框架提升至更高量级面临巨大挑战。在本研究中，我们描述了一种方法学框架，可实现对完整小鼠心脏的微米级分辨率成像。实现这一目标需要综合技术上的努力，结合组织转化与成像技术的最新进展。首先，我们介绍了一种优化的CLARITY方案，能够将完整的心脏转化为一种纳米多孔、水凝胶杂交且无脂质的形式，从而实现高透明度和深度染色。随后，我们描述了一种荧光光片显微镜，能够以微米级分辨率快速获取介观视野（毫米尺度）的图像。该显微镜基于mesoSPIM项目设计，可在单次断层扫描中完成对整个小鼠心脏的微米级分辨率三维重建。我们认为，这一方法学框架将有助于阐明细胞架构紊乱在电功能障碍中的作用，并为整合功能与结构数据的综合模型奠定基础，从而实现对组织重构后引发电和机械功能改变的结构性原因进行统一研究。
引言
与心脏疾病相关的心脏结构重塑可能影响电传导，并引发器官的电机械功能障碍1,2。目前用于预测功能改变的方法通常采用磁共振成像（MRI）和弥散张量磁共振成像（DT-MRI），以整体重建心脏中的纤维化沉积、血管树及心肌纤维分布，并用于模拟动作电位在心脏组织中的优势传播路径（APP）3,4。这些策略能够提供心脏结构组织的宏观概览。然而，其空间分辨率不足以在细胞水平上研究结构重塑对心脏功能的影响。
将该框架应用于不同数量级的尺度，使单个细胞在动作电位传播中发挥独立作用，具有挑战性。主要限制在于标准成像方法难以在大尺度（厘米级）组织中实现高分辨率成像（微米级分辨率）。事实上，由于生物组织具有不透明性，对其进行三维高分辨率成像非常复杂。目前对完整器官进行三维重建最常用的方法是制备薄切片。然而，精确的切片、拼接和成像需要耗费大量人力和时间。另一种无需切割样本的替代方法是制备透明化组织。近年来，已提出多种组织透明化技术5,6,7,8。通过开发真正的组织转化方法（如CLARITY9、SHIELD10），目前已成功实现大体积、透明且荧光标记的组织制备。其中，CLARITY方法基于将完整组织转化为一种纳米多孔、水凝胶杂交、去脂质的形式，通过选择性去除膜脂双层来实现高透明度。值得注意的是，该方法在心脏组织制备中也已取得成功11,12,13,14。然而，由于心脏组织过于脆弱，不适合主动透明化处理，必须采用被动透明化方法，而该方法需要较长时间才能实现完全透明。
结合光片显微镜等先进成像技术，CLARITY 具备以微米级分辨率对三维大体积心脏组织进行成像的潜力。在光片显微镜中，样品通过一束局限于检测物镜焦平面内的薄层光进行照明，荧光发射信号则沿垂直于照明平面的轴向被收集15。其检测架构类似于宽场显微镜，使得图像采集速度远快于激光扫描显微镜。通过使样品移动穿过光片，可实现对大尺寸样本（最大可达厘米量级）的完整断层成像。然而，由于高斯光束的固有特性，极薄（仅数微米厚）的光片仅能在有限的空间范围内实现，从而显著限制了视场范围（FoV）。近期，一种新型激发方案被提出以克服这一限制，并已应用于脑组织成像，实现了具有各向同性分辨率的三维重建16。
本文介绍了一种被动透明化方法，可显著缩短CLARITY透明化方案所需的时间。此处描述的方法框架能够在数分钟的采集时间内，通过单次断层扫描以微米级分辨率重建完整的小鼠心脏。
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方案
所有动物操作和实验程序均遵循欧洲议会关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU指南，并符合意大利卫生部的伦理原则与规定。实验方案已获得意大利卫生部批准（批准号：647/2015-PR）。所有实验动物均由意大利ENVIGO公司提供。本实验使用了5只6月龄的雄性C57BL/6J小鼠。
1. 溶液配制
- 在通风橱中配制4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）（pH 7.6）。将4% PFA分装后于-20 °C保存数月。
- 配制水凝胶溶液：在通风橱中将4%丙烯酰胺、0.05%双丙烯酰胺、0.25%引发剂AV-044溶于0.01 M PBS中。整个配制过程中保持试剂和溶液处于冰上。将水凝胶溶液分装后于-20 °C保存数月。
- 配制透明化溶液：在通风橱中将200 mM硼酸和4%十二烷基硫酸钠（SDS）溶于去离子水中，调节pH至8.6。将溶液储存于21–37 °C之间，以避免SDS析出。
- 实验当天新鲜配制台氏液：加入10 mM葡萄糖、10 mM HEPES、113 mM NaCl、1.2 mM MgCl2和4.7 mM KCl，用1 M NaOH调节pH至7.4。
2. 心脏分离
- 在心脏分离手术前30分钟，皮下注射0.1 mL含500 I.U.肝素的溶液。
- 用新鲜的Tyrode溶液填充一个30 mL注射器和三个6 cm的培养皿。在其中一个培养皿边缘制造一个小切口（深度3-4 mm），并将其置于体视显微镜下。
- 将直径为1 mm的套管固定到注射器上，并插入培养皿的切口中。确保注射器内无气泡。
- 用20 mL注射器吸取4% PFA，并置于化学通风橱内。在通风橱下准备一个空的培养皿。
- 以1.0 L/min的流速使用3%异氟烷/氧气麻醉小鼠，并根据现行动物福利规定通过颈椎脱位处死小鼠。
- 处死后，去除胸部毛发并打开胸腔，充分暴露心脏。
- 取出心脏，将其浸入预先装有50 mL Tyrode溶液的培养皿中。使用手术剪在主动脉弓附近立即剪断主动脉，使心脏完全暴露。
- 将心脏转移至体视显微镜下，小心进行插管操作。切勿将套管插入主动脉过深（不超过2 mm），以免造成组织损伤。
- 使用小型夹具和5/0规格缝合线将心脏固定在套管上。
- 以10 mL/min的恒定压力用30 mL Tyrode溶液灌注心脏，以清除血管中的血液。
- 将套管从注射器上取下，并将心脏放入装有Tyrode溶液的培养皿中。注意避免套管中存在气泡；如有气泡，应妥善清除。
- 将装有冷的4% PFA的20 mL注射器连接至套管，并以相同的恒定压力灌注心脏。
- 将心脏在4 °C条件下，于10 mL 4% PFA中孵育过夜（O/N）。为避免组织降解，应尽可能在最短时间内完成步骤2.6–2.13。
3. 心脏灌注
- 次日，在 4 °C 条件下用 0.01 M PBS 洗涤心脏 3 次，每次 15 分钟。
注意：此步骤之后，心脏可保存在含 0.01% 叠氮化钠（NaN3）的 PBS 中，于 4 °C 保存数月。 - 将心脏置于 30 mL 水凝胶溶液中，在 4 °C 条件下以 15 rpm 振荡孵育 3 天。
- 在室温下使用干燥器、真空泵以及连接干燥器、真空泵和氮气管道的管路系统对样品进行脱气。
- 将样品放入干燥器中，并打开瓶盖，但保留瓶盖在瓶口上。
- 关闭干燥器，并通过打开氮气管道排出管路中的氧气。
- 启动真空 泵，对干燥器抽真空 10 分钟以去除氧气。
- 关闭真空泵，使用干燥器的旋钮打开氮气管道。当压力恢复至大气压后，小心打开干燥器并迅速盖紧瓶盖。
- 将心脏置于脱气后的水凝胶溶液中，在 37 °C 静置孵育 3 小时。
- 当水凝胶完全聚合并呈现均匀凝胶状时，小心将心脏从中取出，并放入样品架中。
- 将装有心脏的样品架放入透明化室之一，并妥善关闭，以防止透明化溶液泄漏。
- 启动装有透明化溶液容器的水浴以及蠕动泵，开始透明化溶液的循环。
- 每周更换一次容器中的透明化溶液，以加快透明化过程。
4. 细胞膜染色
- 当心脏完全透明后，将其从样品架上取下，并在50 mL预热的PBS中洗涤24小时。再用50 mL含1% Triton-X的PBS（PBS-T 1x）洗涤24小时。
- 将样品置于3 mL PBS-T 1x溶液中，加入终浓度为0.01 mg/mL的麦芽凝集素（Wheat Germ Agglutinin, WGA）- Alexa Fluor 633，在室温下振荡（50 rpm）孵育7天。
- 7天孵育结束后，在室温下用50 mL PBS-T 1x振荡洗涤24小时。
- 将样品在4% PFA中孵育15分钟，随后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：此步骤完成后，心脏可在含0.01% NaN3的PBS中于4 °C保存数月。 - 将心脏依次置于0.01 M PBS中含递增浓度的2,2′-硫代二乙醇（TDE）溶液（20% 和 47% TDE/PBS）中孵育，每步8小时，最终达到0.01 M PBS中含68% TDE的终浓度，以获得所需的折射率（RI = 1.46）。此即用于成像的折射率匹配介质（RI-medium）16。
5. 心脏固定与采集
注意：光学系统的所有组件均在材料表中详细列出。
- 将折射率介质（RI-medium）缓慢注入外层比色皿（石英，45 mm × 45 mm × 42.5 mm）中，填充至约80%满。
注：此处可使用不同种类的非挥发性溶液，只要能保证折射率为1.46即可。 - 用相同的折射率介质缓慢填充内层比色皿（石英，45 mm × 12.5 mm × 12.5 mm）。
- 将样品浸入内层比色皿中。上述孵育步骤可使样品在折射率介质中保持稳定，无需额外固定。
- 使用细镊子轻柔地将样品移至比色皿底部，并使心脏的长轴与比色皿的主轴平行，以在扫描过程中最小化激发光在组织中的传播路径。
- 用两颗螺丝将定制的塞子轻轻固定在内层比色皿上方。
- 利用磁铁将样品固定在显微镜载物台上。
- 手动调节垂直样品台，使内层比色皿浸入外层比色皿中。
- 打开激发光源（波长为638 nm），设置较低功率（约为3 mW）。
- 使用电动平移台移动样品，以照亮组织的某一内部切面。
- 启动成像软件（HCImageLive），并将相机触发模式设为外部 （light-sheet），以便由控制整个系统的定制软件驱动相机的采集触发信号。
- 在扫描设置面板中启用自动保存，并设置图像的保存路径文件夹。
- 使用线性平移台在XY平面内手动调整样品位置，将样品移至相机传感器视场（FoV）的中心。
- 使用线性电动平移台沿Z轴移动样品，以确定心脏边界，用于断层重建。
- 将激光功率提高至约20 mW，准备开始成像。
- 开始断层成像：在成像软件的序列面板 中点击开始按钮，同时使用电动平移台以6 µm/s的恒定速度沿Z轴移动样品。
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结果
所开发的被动透明化装置可在约3个月内获得透明化处理的成年小鼠心脏（尺寸约为10 mm × 6 mm × 6 mm）。该装置的所有组件安装方式如图1所示。每个透明化腔室之间极小的温度梯度（约3°C）可确保所有腔室内的温度维持在适宜范围内。
图1：被动透明化装置示意图。 透明化溶液（过滤后）在蠕动泵的辅助下依次流经样品室。将溶液容器置于设定为50 °C的水浴中，可使样品室内的溶液温度维持在37–45 °C之间。图片由Biorender.com制作。
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讨论
本研究介绍了一种成功实现小鼠全心高分辨率透明化、染色及成像的有效方法。首先，对组织转化技术（CLARITY）进行了优化，并针对心脏组织的应用进行了轻微调整。事实上，为了实现全心组织的高效三维重建，防止光散射现象至关重要。CLARITY 方法可获得高度透明且结构完整的心脏组织，但若采用被动方式进行，所需孵育时间较长（约5个月）。与脑组织不同，心脏组织不适合使用电场驱动的主动透明化方法，因为即使在低电压下，电场也会导致组织损伤和破裂。本文优化了一种被动透明化方案，可在约3个月内获得完全透明的心脏样本。在通过近端主动脉分离并插管心脏后，按照方案第3节所述执行CLARITY操作。为加快处理速度，设计了一套自制的被动透明化装置（图1），使组织透明化时间缩短了约40%。该装置由透明化溶液容器、水浴槽、蠕动泵、多个含有不同样品架的腔室、每个腔室配备的胶囊过滤器以及用于溶液循环的管路系统组成。泵将溶液从容器中依次抽出并流经各个腔室，样品即在腔室内进行透明化处理。在进入腔室前，溶液会经过胶囊过滤器，以捕获透明过程中从组织中清除的脂质。通过将溶液容器置于50 °C水浴中，可在循环过程中维持腔室内透...
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致谢
该项目已获得欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议编号952166，REPAIR）、意大利大学与研究部（MUR）FISR计划项目FISR2019_00320，以及托斯卡纳大区2018年健康研究招标PERCARE项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-2’ 硫代二乙醇 | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| 丙烯酰胺 | 伯乐（Bio-Rad） | 61-0140 | |
| AV-044 引发剂 | 和光纯药工业株式会社 | AVP5874 | |
| 双丙烯酰胺 | 伯乐（Bio-Rad） | 161-042 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| 相机 | 滨松 | Orca flash 4.0 v3 | |
| 相机软件 | 滨松 | HC 图像 | |
| 准直透镜 | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| 检测臂 | 集成光学 | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| 激发透镜 | 尼康 | 91863 | |
| Exteraì石英比色皿 | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| 折叠镜 | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| 振镜 | Thorlabs | GVS211/M | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | 滨松 | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 内置石英比色皿 | 波特曼仪器 | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| 激光光源 | 集成光学 | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| 长通滤光片 | Thorlabs | FELH0650 | |
| 磁力底座 | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl₂2 | 化学实验室 | CI-1316-0250 | |
| 电动平移台 | 物理仪器 | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| 目标 | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| 多聚甲醛 | Agar Scientific | R1018 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| 中继透镜 | Qioptiq | G063200000 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| 管镜 | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| 可调谐透镜 | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| 真空泵 | KNF Neuberger 公司 | N86KT.18 | |
| 水浴锅 | Memmert | WTB |
参考文献
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