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从斑马鱼胚胎中制备原始囊胚外植体

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DOI：

10.3791/62797

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2021年7月30日

 , 
1Center for Precision Environmental Health and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

斑马鱼囊胚外植体通过从早期胚胎的内源性信号中心分离胚胎细胞而获得，从而产生相对原始的细胞簇，可在体外轻松进行操作和培养。ex vivo。本文提供了制备此类外植体的操作指南，并通过探究Nodal信号在原肠胚形成期间的作用，展示了其应用价值。

摘要

由于斑马鱼胚胎具有良好的光学通透性和快速的发育特性，是研究细胞行为和发育过程的优良体系。然而，由于胚胎信号的复杂性和冗余性，在早期胚胎发生过程中明确单一信号的完整功能仍具挑战性。通过分离斑马鱼囊胚的动物极区域，可获得相对未分化的胚胎细胞簇，这些细胞簇易于体外培养和操作 离体通过在分离组织前通过RNA注射引入目的基因，可以在相对隔离的条件下评估该分子对基因表达、细胞行为及其他发育过程的影响。此外，可将不同基因型或不同处理条件下胚胎的细胞组合于同一个嵌合外植体中，以研究细胞/组织间的相互作用及组织特异性的基因功能。本文提供了制备斑马鱼胚盘外植体的操作指南，并证明单一信号分子——Nodal配体——足以在原本未分化的胚胎组织中诱导胚层形成及延伸形态发生。由于此类外植体能够在简化的体系中重现胚胎细胞行为、形态发生素浓度梯度及基因表达模式 离体 该系统预计对许多斑马鱼研究人员具有重要应用价值。

引言

发育生物学领域的一个长期目标是解析发育中胚胎的复杂性，以理解动物形态与功能的起源。即使是早期胚胎，也包含一系列复杂的信号分子、细胞与组织间的相互作用以及机械力，这些过程均受到严格的空间和时间调控。因此，要准确定位某一特定信号在感兴趣发育过程中的精确作用往往具有挑战性。通过将胚胎组织从其内源环境中分离出来，胚胎外植技术提供了一个简化的平台，可在相对独立的条件下解析特定组织和分子在发育中的作用。外植技术在Xenopus laevis（非洲爪蟾）中研究最为广泛，已被用于研究组织诱导、细胞信号传导、细胞黏附以及形态发生等多种过程1,2,3,4。其中一种被称为动物极帽（animal cap）外植的技术，是指在囊胚期Xenopus胚胎的动物极区域尚未发生诱导性相互作用之前将其 分离出来5,6,7，该技术已被广泛使用且功能强大。未经处理的动物极帽将发育为外胚层7,8，但其仍具有响应多种诱导因子的能力，因而可形成三个胚层来源的各种组织，并进行相应组织特异性的形态发生运动9,10,11。然而，由于遗传操作工具有限，且活体成像条件欠佳，许多发育生物学家难以将Xenopus动物极帽外植技术应用于研究。通过外植斑马鱼胚胎的胚盘细胞，研究人员可将动物极帽检测的优势与斑马鱼模型系统所具备的光学通透性、丰富的遗传工具及其他实验优势相结合。

迄今为止，研究人员已使用了两种类型的斑马鱼外植体：所谓的pescoid和胚盘外植体。在pescoid模型中，整个胚盘（包括边缘区）从卵黄中分离出来，并使其发育 离体 不含胚外卵黄合胞层（YSL）12,13因此，pescoids 与 Fundulus 几十年前由 Jane Oppenheimer 和 J.P. Trinkaus 生成的外植体14,15这些外植体重现了胚胎模式形成和形态发生过程中的诸多特征12,13然而，由于这些分离物含有内源性信号中心（胚胎边缘），因此在简化程度上并不具备优势 其分子环境。或者，研究人员可通过排除边缘区来获得相对初始的斑马鱼胚盘外植体16,17,18,19,20,21未处理的斑马鱼胚盘外植体表达高水平的骨形态发生蛋白（BMP）形态发生素19 并产生非神经外胚层和包被层（EVL） 离体18然而，它们在响应外源性信号梯度时，能够重现轴向模式形成和形态发生的诸多方面19,20,21，类似于 非洲爪蟾 动物帽。因此，胚盘外植体是研究特定形态发生素（或多种形态发生素）在胚层分化、形态发生细胞运动以及信号梯度中作用的理想模型，尤其适用于简化信号环境下的相关研究。此外，来自不同基因型或不同处理条件下胚胎的胚盘可组合形成单一的嵌合外植体。19,21 用于研究细胞/组织的自主性及诱导性相互作用。

斑马鱼囊胚外植体可用于研究胚胎信号（例如Nodal）在原肠胚形成过程中形态发生和组织特化中的作用。通过在单细胞阶段注射合成的ndr2 RNA（编码一种Nodal配体），可在整个胚胎囊胚中激活Nodal信号。来自这些胚胎的外植体能够形成Nodal信号梯度，生成所有三个胚层，并发生与完整胚胎中观察到的相似的汇聚延伸（C&E）原肠运动20。此外，嵌合外植体被用于展示中胚层组织诱导未注射（幼稚）囊胚形成神经外胚层的能力。本实验方案提供了制备斑马鱼囊胚外植体的操作步骤，并展示了其在阐明Nodal信号通路于组织诱导和形态发生中作用方面的应用价值。

方案

1 制备 试剂与耗材

  1. 试剂准备
    1. 配制 500 mL 的 3x Danieau 溶液（溶液 1，表 1）。
    2. 配制 1 L 的卵水（溶液 2，表 1）。
    3. 在卵水中配制 1.2% 的琼脂糖溶液。在微波炉中完全融化琼脂糖，然后在水浴中冷却至 55 °C。
    4. 每种实验条件配制 4 mL 外植体培养基（溶液 3，表 1，略作修改自19,21）。
      注意：计算所需体积时，请记得至少为未注射（或对照注射）胚胎的外植体预留一个孔位。
      1. 用 70% 乙醇对工作区域进行消毒。
      2. 从 4 °C 取出细胞培养基，并用 70% 乙醇喷洒或擦拭表面。
      3. 配制外植体培养基，并在胚胎注射期间将其置于 28.5 °C 培养箱中预热。
        注意：始终应包括年龄匹配的完整同胞胚胎，用于发育阶段判定。将这些胚胎去壳后，在涂有琼脂糖的培养板中用 0.3x Danieau 溶液（溶液 4，表 1）进行培养。
    5. 从 -20 °C 取出嗜热菌蛋白酶（pronase）分装样品（每份 1 mL，浓度为 20 mg/mL），置于冰上解冻。每三种实验条件准备一份 1 mL 的解冻样品。
  2. 制备琼脂糖平板
    1. 制备注射用平板。
      1. 在 100 mm × 15 mm 的塑料培养皿中，加入约半满的溶化琼脂糖卵水溶液 。
      2. 将注射模具以 45° 角轻轻放置在溶化的琼脂糖表面，并逐渐将其压入琼脂糖中，确保模具下方无气泡 trapped。待其完全冷却。
      3. 移除模具。可立即使用该平板，或加入 2 mL 卵水，包裹后于 4 °C 保存以备后续使用。使用前在 28.5 °C 培养箱中预热 15–30 分钟。
    2. 制备外植体切割平板。
      1. 在 60 mm × 15 mm 培养皿中加入 3 mL 溶化的 1.2% 琼脂糖卵水溶液，确保整个皿底均匀覆盖。待其完全冷却。
    3. 用琼脂糖包被培养板。
      1. 针对每种实验条件，在 6 孔板的一个孔中加入 1 mL 溶化的 1.2% 琼脂糖卵水溶液，确保孔底完全覆盖。待其完全冷却。
    4. 为制备嵌合外植体，可在 60 mm × 15 mm 培养皿的溶化琼脂糖中加入十二颗 1 mm 玻璃珠，形成带有小凹槽的外植体切割皿。待琼脂糖完全冷却后 ，用镊子移除玻璃珠。

2 向胚胎注射 RNA

  1. 佩戴手套，从 -80 °C 保存条件下取出一份合成的 ndr2 mRNA 样品，并立即置于冰上。
  2. 准备注射针。
    1. 用 RNA 填充拉制的玻璃毛细管注射针。将装好 RNA 的注射针放入显微操作仪中，用镊子折断针尖。
    2. 使用载物台测微尺和一滴矿物油校准注射体积，调节气动注射仪的注射时间和压力，以获得所需大小的注射剂量。直径为 120 µm 的液滴体积为 1 nL。
      注意：所需剂量体积取决于 RNA 浓度和每个胚胎所需的剂量。例如，若 RNA 储存浓度为 10 ng/µL，则注射 1 nL 可使每个胚胎获得 10 pg 的终量。
      1. 在准备注射前，始终保持 RNA 注射针针尖浸没在油滴中。
  3. 装载 胚胎并进行注射。
    1. 拉开繁殖缸中的隔板，让鱼产卵 10–15 分钟，然后用茶筛收集胚胎。
    2. 使用巴斯德移液管和移液泵将胚胎转移至注射板中，再用戴着手套的手指轻轻将卵压入凹槽内。
    3. 向单细胞期胚胎的卵黄中注射 10 pg ndr2 RNA，直至达到所需胚胎数量，或直至胚胎开始分裂。
      注意：为确保 RNA 在胚胎中均匀分布，不得在单细胞期之后进行注射。
    4. 用挤压瓶中的卵水轻柔冲洗，将胚胎从注射板中洗出，转移至标记好的 100 mm × 15 mm 培养皿中。
      注意：始终保留一组同龄、未注射的同胞胚胎作为对照。
    5. 将胚胎放入 28.5 °C 培养箱中培养，直至发育至 128 细胞期。及时清除未受精卵和死亡胚胎。

3 去除胚胎的卵膜

  1. 当胚胎发育至128细胞阶段时，将其转移至已标记的玻璃培养皿中，并尽可能倒出其中的卵水。
  2. 使用实验室胶带标记玻璃结晶皿（对应小培养皿的名称），并加入卵水至其容量的2/3处。将这些结晶皿放置在解剖显微镜旁，以便快速取用。
  3. 在50 mL锥形管中，向15 mL 3x Danieau's溶液中加入1 mL蛋白酶原储备液（20 mg/mL，冰上解冻）。
    注意：此体积适用于最多三个实验条件。若需增加外植体条件，应相应增加蛋白酶原和3x Danieau's溶液的体积。
    警告：蛋白酶原具有刺激性，操作时需佩戴手套。
  4. 向每个含有胚胎的玻璃培养皿中加入至少5 mL蛋白酶原溶液。
  5. 以环形动作轻轻摇动玻璃培养皿，并在解剖显微镜下持续观察去壳进程。
  6. 一旦卵膜开始起皱，且有1-2个胚胎脱离卵膜，立即将含有蛋白酶原和胚胎的玻璃培养皿小心浸入对应盛有卵水的玻璃结晶皿中。
  7. 清洗去壳后的胚胎。
    1. 通过轻柔加入卵水并倾倒的方式，用卵水清洗胚胎三次。
    2. 第三次也是最后一次清洗使用0.3x Danieau's溶液。
      ​注意：若清洗后胚胎仍残留卵膜，可轻柔吹打胚胎直至卵膜脱落，或让胚胎在清洗液（卵水或0.3x Danieau's溶液）中静置一至两分钟，并以环形动作轻柔震荡。
  8. 用培养皿盖盖住去壳后的胚胎，并将其放回培养箱（28.5 °C），直至胚胎发育至256细胞阶段。

4 切割外植体

  1. 用3倍浓度的Danieau溶液填充涂有琼脂糖的60 mm × 15 mm培养皿。
  2. 当胚胎发育至256细胞期时，将其转移至含有3倍浓度Danieau溶液的琼脂糖包被培养皿中，并沿培养皿中心排成一行。
  3. 使用镊子切割外植体（图1）。
    1. 用一对闭合的镊子固定胚胎，另一对镊子在囊胚层约一半高度处（从边缘至动物极方向）进行切割（图1A）。
    2. 切割时，先用一对镊子轻轻夹住囊胚层细胞，然后将用于固定的镊子沿另一对镊子滑动，从而在囊胚层上切开约一半的切口（图1B）。
    3. 旋转胚胎，将镊子插入已有切口，然后垂直于第一次切割的方向切断剩余的囊胚层（图1C）。
  4. 将外植体在3倍浓度Danieau溶液中至少维持5分钟以促进愈合，随后转移至预先用琼脂糖包被并加入4 mL外植体培养基的6孔板中。
    注：将未注射（或对照注射）的同胞胚胎作为阴性对照进行外植体操作。若操作正确，这些外植体既不会发生延伸，也不会表达内胚层、中胚层或神经外胚层的标志物。
  5. 将外植体培养板置于28.5 °C培养箱中，直至达到预期的时间点或发育阶段（根据完整同胞胚胎确定）。
    ​注：若需用化合物（如小分子抑制剂）处理外植体，可在预定时间点将所需浓度的化合物直接加入各孔中的外植体培养基内。计算浓度时请计入琼脂糖的体积。（示例：1 mL琼脂糖 + 4 mL外植体培养基 = 每孔总体积5 mL）。

5 制备嵌合体外植体

  1. 使用底部用1 mm玻璃珠将琼脂糖压制成十二个小型浅孔的培养皿，替代常规的琼脂糖包被培养板，在其中切割嵌合外植体。向该培养板中加入3倍浓度的Danieau溶液。
    ​注意：嵌合外植体由两个不同基因型或不同处理条件下胚胎的胚盘细胞生成。确保这些条件可通过转基因或注射的荧光标记的表达加以区分。
    1. 准备时，将十二个具有一种基因型/条件的胚胎置于培养皿左侧，将另外十二个具有另一种基因型/条件的胚胎置于培养皿右侧。
    2. 将每种条件下的一个胚胎移至培养皿中央，靠近12个浅孔中的其中一个。
    3. 使用镊子，按照单胚胎外植体的方法（步骤4.3）从每个胚胎中切取外植体。
    4. 用镊子迅速将两个外植体的切口边缘在浅孔内压合在一起，使两部分愈合为一个完整的外植体。
    5. 继续在培养皿的其余十一个 浅孔中重复上述操作。外植体愈合后，将其转移至已用琼脂糖包被并加入4 mL外植体培养基的6孔板中的一个孔内。重复此过程，直至获得所需数量的外植体。

6 培养和/或成像固定的外植体

  1. 将外植体在28.5 °C培养箱中培养，直至完整的同胞胚胎发育至所需阶段。
  2. 活体外植体可进行连续延时成像，或在培养期间定期成像，也可在实验终点时进行活体成像。
  3. 如需要，对组织外植体进行固定。当外植体达到预期终点时，记录完整胚胎同胞的发育阶段，并将外植体放入含1 mL 4%多聚甲醛PBS溶液的玻璃闪烁瓶中。于4 °C摇床上固定过夜。
    警告：多聚甲醛具有毒性。操作该化学品时应佩戴手套，并按照各机构批准的方法进行处置。
    1. 固定后，用 PBS + 0.1% Tween-20 将外植体漂洗六次，每次 15 分钟，并逐步脱水至甲醇。将外植体于 -20 °C 保存，用于后续整体染色分析 原位 杂交，免疫荧光染色等

结果

Nodal 配体驱动胚层形成和 C&斑马鱼囊胚外植体的E期
来自未注射的野生型（WT）胚胎或注射了编码绿色荧光蛋白（GFP）的50 pg mRNA的胚胎的对照外植体，在整个培养期间保持圆形。图2A-C）且未能表达中胚层、内胚层或神经外胚层的标志物（图 3C)20这些结果共同表明，缺乏脊椎动物原肠胚形成所特有的形态发生和胚层形成。然而，从注射了10 pg的胚胎中切取的外植体 ndr2 mRNA在培养8-9小时后变得高度伸长图2D）。通过微分干涉对比（DIC）显微镜对这些外植体进行活体延时成像，结果显示，延伸过程始于受精后约8小时（hpf）或前后。图 2F），与 C 相同的时间&E形态发生始于完整的斑马鱼胚胎22. 从 MZ 切取的外植体oep-/- 胚胎，缺乏必需的 tdgf1 Nodal共受体23，未能响应而延伸 ndr2 注射（图 2E)，表明Nodal活性对这一过程至关重要 离体 形态发生。此外，整体装片 原位 杂交实验进一步表明 ndr2-表达的外植体表达神经外胚层标志物（sox2）以及几种中胚层亚型（tbxta, noto, tbx16) (图 2G），以及内胚层和胚胎组织者20.

中胚层诱导神经外胚层形成不需要 Nodal 信号通路
Nodal信号通路活性对于内胚层和大部分中胚层的诱导至关重要，但在斑马鱼原肠胚中，外胚层神经命运的特化则无需该信号通路23,24. 而未注射的斑马鱼胚盘外植体则未分化为神经外胚层（图3C18），从注射了10 pg的胚胎中获取的外植体 ndr2 表现出神经外胚层标志物的强表达 sox2 沿外植体长轴呈明显的条带分布（图 2G），表明Nodal信号活性是神经外胚层形成所必需的 离体众所周知，中胚层组织能够诱导神经组织的形成25,26,27,28,29，包括斑马鱼胚盘外植体17然而，尚不清楚该外植体系统中神经外胚层的形成是否直接需要Nodal信号，还是外源性Nodal配体首先诱导中胚层，再由中胚层继发性地诱导神经组织。

通过生成包含来自两个不同胚胎的预定中胚层和神经外胚层组织的嵌合外植体，以检验Nodal信号通路在神经外胚层特化过程中是否以组织自主性方式发挥作用 离体. 每个外植体的中胚层部分取自表达中胚层特异性转基因GFP报告基因Tg[的野生型胚胎lhx1a:eGFP]30，注射高剂量（100 pg）的 ndr2 (图 3A）。每个外植体的假定神经外胚层部分取自对照组野生型（WT）胚胎或Nodal信号缺陷的MZ胚胎oep-/- 胚胎仅注射编码荧光核标记物 H2B-RFP 的 mRNA图 3A）。每个嵌合外植体均由上述两种条件下的一个胚盘组织组合而成，并通过整体免疫染色检测组织特异性标志物的表达情况 原位 12 hpf 时的杂交

注射了100 pg ndr2 的单胚胎外植体中，大多数几乎不表达或完全不表达 sox2，而表达中胚层标志物，包括 tbxta 以及在整个外植体中表达的 lhx1a:gfp 报告基因（图3B、G）。未注射的野生型囊胚层（构成嵌合外植体中前神经外胚层部分的类型）在作为单个外植体培养时，既不表达中胚层标志物，也不表达 sox2，表明缺乏神经外胚层和中胚层的特化（图3C、H）。来自MZoep-/-胚胎的单胚胎外植体同样缺乏神经外胚层和中胚层标志物的表达，即使注射了 ndr2 也是如此（图3D）。然而，当未注射的野生型囊胚层与由高剂量Nodal配体诱导产生的中胚层组合时，这些嵌合外植体 robustly 表达中胚层标志物和 sox2（图3E、I）。这些结果表明，正如先前所观察到的17、26、27、29，中胚层能够诱导原本将发育为非神经外胚层的细胞获得神经命运。为了检验Nodal信号通路是否需要直接在这些外植体的前神经外胚层部分内发挥作用以实现其神经诱导，研究人员构建了由注射了100 pg ndr2 的野生型囊胚层与MZoep-/-胚胎的囊胚层组成的嵌合外植体（图3J）。尽管这些外植体无法从前邻近的中胚层区域接收Nodal信号，它们仍以与野生型对照嵌合体相似的程度表达 sox2（图3F）。该结果表明，与完整胚胎中神经组织在无Nodal活性情况下仍能特化的现象一致，Nodal信号通路在体外（ex vivo）神经外胚层的诱导过程中并非以组织自主方式必需。

细胞内吞过程；囊泡形成和脱离阶段示意图。
图1：斑马鱼胚盘外植操作流程（步骤4.3）。（A）用非优势手（橙色）持镊子夹住卵黄以固定胚胎，同时用优势手（蓝色）持另一把镊子夹住胚盘约一半高度处。（B）将橙色镊子沿蓝色镊子边缘在胚胎周围滑动，切割胚盘，使第一道切口大约穿过胚盘的一半宽度。（C）将胚胎旋转90°，然后将蓝色镊子插入原切口内部（并与原切口呈垂直方向），夹紧以切断剩余的胚盘组织。（D）将外植的胚盘细胞置于3x Danieau溶液中恢复约5分钟，然后再转移至外植培养基中。请点击此处查看该图的放大版本。

斑马鱼胚胎发育示意图；ndr2 mRNA 表达过程；发育阶段与基因标记
图2 （修改自20)：Nodal 配体促进 C&斑马鱼胚盘外植体中的形态发生与胚层形成。 (A斑马鱼胚胎显微注射与移植示意图。B-E) 在相当于2-4体节阶段，所示条件/基因型的活体囊胚外植体的代表性明场图像。N = 来自2至4次独立实验的外植体数量。 (F代表性野生型胚胎外植体的延时微分干涉相差成像序列，该胚胎注射了10 pg ndr2 RNAG代表性整体样本图像 原位 野生型胚胎外植体中注射10 pg后，对所示转录本进行杂交检测 ndr2 RNA。比例尺为 200 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

嵌合体外植体示意图；中胚层-神经外胚层相互作用，ndr2效应，GFP/RFP标记
图3 （改编自31)嵌合体外植体揭示神经外胚层特化无需组织自主的 Nodal 信号 离体. (A) 生成嵌合体斑马鱼外植体的操作流程示意图。B-F整体装片 原位 中胚层标记物的杂交 tbxta （顶部）和神经外胚层标志物 sox2 （底部）来自注射了100 pg的野生型胚胎的外植体 ndr2 RNAB），未注射的野生型对照（C，MZoep-/- 注射 10 pg ndr2 (D），以及包含来自野生型（WT）神经外胚层部分的嵌合外植体（E或 MZoep-/- (F）相当于体节2-4对时期的胚胎。括号中的分数表示呈现所示表型的外植体数量占所观察外植体总数的比例。G-J) 转基因[lhx1a:gfp] 来自单个胚胎的外植体（G-H）或与表达 H2B 的囊胚层联合使用（I-J，品红色）表示相当于体节2-4阶段的处理条件。N代表三次独立实验的外植块数量。比例尺为 200 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

溶液 1溶液 2溶液 3溶液 4
溶液3x Danieau'sEgg WaterExplant Media0.3x Danieau's
成分174 mM NaCl60 µg/mL sea saltsDMEM/F12 + 2.5 mM L-Glutamine 和 15 mM HEPES17.4 mM NaCl
2.1 mM KCl1 L 蒸馏水新生小牛血清或胎牛血清，占总体积的 3%0.21 mM KCl
1.2 mM MgSO4.7H2O青霉素（50 单位/mL）-链霉素（50 µg/mL），1:200 稀释0.12 mM MgSO4•7H2O
1.8 mM Ca(NO3)2 •4H2O0.18 mM Ca(NO3)2 •4H2O
15 mM HEPES示例：1.5 mM HEPES
蒸馏水4 mL/条件 × 9 种条件 = 36 mL蒸馏水
1.08 mL 新生小牛血清（NCS，分装保存于 -20 °C，3%）
0.18 mL 200x 青霉素-链霉素溶液（PS，分装保存于 -20 °C）（1:200）
35 mL DMEM/F12

表1.

讨论

本文介绍了如何制备斑马鱼囊胚外植体，并讨论了这些外植体在研究Nodal形态发生素信号在原肠胚形成过程中作用的两种实际应用。这种切割和培养外植体的方法提供了一群初始状态的 naïve 细胞，可通过RNA注射以及小分子化合物处理来操控，以研究特定的分子通路。

关键步骤
本方案中有四个步骤对其成功尤为关键。第一步是向胚胎注射适量的Nodal。本方案推荐注射10 pg的ndr2 RNA；尽管一定剂量范围内的Nodal均能促进延伸，但Nodal过多或过少都会影响外植体的最佳延伸效果20。第二步是去除胚胎的绒毛膜。若胚胎在蛋白酶（pronase）中处理时间过长，卵黄将破裂，导致胚胎无法用于切割；若处理时间不足，则绒毛膜无法通过洗涤松解，将不得不进行耗时的手动去膜操作。第三步是切割外植体，建议在3x Danieau溶液中进行，因为盐浓度较低的0.3x Danieau溶液或卵水不利于外植体的愈合与存活。

此外，外植体必须在胚盘约一半高度的位置进行切割，以确保细胞的初始状态。如果切割位置过于靠近卵黄，外植体将含有来自边缘区（包括内源性 Nodal）的信号，这些信号会促进组织定型和形态发生。第四步也是最后的关键步骤是嵌合外植体的愈合。两个外植体除非在切割后立即将其切缘轻轻按压在一起，否则不会融合形成嵌合体。

修改与故障排除
上述关键步骤为问题排查提供了切入点。以下列出了一些常见问题及建议的解决方案。

如果在存在 Nodal 信号的情况下外植体仍未伸展，可尝试以下解决方案。（A）在单细胞阶段注射胚胎，以确保 RNA 在整个胚胎中均匀分布。（B）避免注射过量 结节 RNA的完整性 使用显微测微尺测量注射团注体积，以确保注射体积准确。（C）避免注射量过少 结节 通过测量RNA浓度来确保其未发生降解。（D）保留部分同龄的完整同胞胚胎，以推断外植体的相应发育阶段。当完整同胞胚胎达到2-5体节期时，外植体可实现最大程度的伸展。若外植体采集过早，则无法达到最佳伸展状态。

如果去壳后卵黄破裂，且胚胎无法进行切割，当卵膜开始起皱并有1-2个胚胎脱膜时，立即将胚胎从蛋白酶溶液中取出，随后立即用卵水冲洗。

如果外植体边缘出现气泡状现象，可采取以下解决方案。（A）仅在特定发育时间段内切割外植体。尽管从128细胞期至1000细胞期的任何阶段切割的外植体均能在培养中存活并延展，但256至512细胞期切割的外植体通常最为健壮。（B）确保在3x Danieau溶液中进行外植体切割，以促进正常愈合。（C）切割时应干净利落且动作轻柔。避免在切割过程中拉伸或牵拉细胞导致分离。

如果未注射的对照外植体出现延伸现象，可能是因为外植体切割位置过于靠近卵黄。为了确保外植体处于初始状态，切割时应位于卵黄与胚盘顶端之间的中点处。

如果嵌合外植体未能融合，可能是因为外植体在3x Danieau溶液中被切割后倾向于回缩，并在切缘处自行愈合。为了确保两个胚盘彼此愈合而非各自闭合，应在切割后立即将它们压在一起。使用镊子在琼脂糖孔内对 newly joined blastoderms 施加轻柔压力，以促进它们共同愈合。

局限性
尽管这些外植体是研究特定形态发生素（或其他感兴趣分子）在相对隔离条件下作用的有力工具，但对任何体外模型中观察到的现象必须谨慎解读。外植体表现出的细胞迁移与胚胎形成（C&E morphogenesis）过程与体内观察到的结果非常相似20，但并不能完全重现原肠胚形成的所有方面，例如表层扩展（epiboly）运动。此外，它们也缺乏完整胚胎中存在的许多其他调控因子和信号分子。虽然这一特性是外植体实验的重要优势，但也可能导致在体内不成立的结论。例如，由于未接受外源性Nodal配体的外植体无法表达神经外胚层标志物，仅基于外植体实验可能得出Nodal信号通路是神经外胚层特化所必需的结论。然而，在完全缺失Nodal信号的完整胚胎中仍可形成神经外胚层23,24，这表明其他信号分子在神经特化过程中具有关键作用32。外植体能够告诉我们某种形态发生素在隔离环境中所能发挥的作用 。然而，所有此类发现都应在完整胚胎中进行验证或比较，才能全面准确地解释结果。换句话说，外植体不能替代正在发育的胚胎，而是一种辅助工具，用于探究形态发生素与其周围环境之间的功能关系及相互作用。在充分认识这些局限性的前提下，斑马鱼囊胚外植体仍是解决众多科研问题的宝贵工具。

相对于现有方法的意义
随着合成胚胎学重新受到关注，目前已有多种ex vivo和in vitro方法被常规用于模拟胚胎发育的某些方面。例如，由小鼠或人类胚胎干细胞/诱导性多能干细胞构成的二维和三维类原肠胚，可通过添加外源信号分子，模拟原肠胚形成、体节形成和神经管形成过程中的部分图式形成 和/或形态发生事件33,34,35,36,37。尽管这些方法功能强大，但其需要繁琐且耗时的培养流程，既要持续维持多能干细胞的培养，又要长时间培养类原肠胚，通常需数天才能达到原肠胚形成阶段。相比之下，斑马鱼外植体无需维持干细胞培养，仅需按需收集胚胎即可。其制备相对简单，且可在数小时内达到原肠胚形成阶段，与斑马鱼胚胎的发育速度相同。这突显了斑马鱼外植体的另一优势——完整的发育时钟。由于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的发育年龄往往存在变异性且尚存争议，因此胚胎外植体可能更适用于研究发育的时间调控机制。最后，尽管含有胚胎边缘区的斑马鱼类胚胎外植体（pescoid）在培养中也能发生延伸12,13，但其延伸依赖于内源性信号中心的作用。而本文所述的外植体则可在较少受到胚胎自身信号干扰的情况下，使研究人员能够研究特定分子的功能。

潜在的未来应用
本研究利用外植体证明了Nodal信号通路对于原肠胚形成过程中的汇聚延伸（C&E）形态发生是必要且充分的。然而，预计这些外植体还可用于阐明多种不同分子在其他众多发育过程中的作用，例如基因表达的调控、信号梯度的建立以及其他形态发生程序。此外，由于这些外植体至少可存活至受精后24小时（hpf）19，因此可预期其应用范围将不仅限于原肠作用，还可延伸至体节形成和器官发生等后续发育阶段，即适用于任何需要发育初始状态模型的研究过程。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了美国国立儿童健康与人类发展研究所（NICHD）R00HD091386（授予 MLKW）以及美国国立环境卫生科学研究所（NIEHS）T32ES027801（授予 AAE）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 毫米玻璃珠Millipore-SigmaZ250473
4% 多聚甲醛VWRJ19943-K2
6 孔板FisherFB012927
琼脂糖Thermo-Fisher16500500
Ca(NO3)2 .4H2OThermo-Fisher12364-36
DMEM/F12 培养基Gibco11330032
Dumont #5 钟表匠镊子World Precision Instruments500341
胚胎注射模具Adaptive Science ToolsI-34
玻璃结晶皿Fisher08-741A
玻璃培养皿Fisher08-748A
HEPESVWRJT4018-1
Instant Ocean 海水盐Instant OceanSS15-10
KClVWRBDH9258-500G
低温培养箱Fisher15-015-2632
MgSO4.7H2OVWR97062-134
微量移液器加载尖端Eppendorf930001007
显微操作仪World Precision InstrumentsM3301R
千分尺SPI supplies02265-AB
矿物油VWRMK635704
NaClVWRBDH9286-500G
新生小牛血清Invitrogen26010-066
巴斯德移液管Fisher13-678-30
青霉素-链霉素溶液Thermo-Fisher15140122
Pico-pump 气动注射器World Precision InstrumentsSYS-PV820
移液泵Fisher13 683C
100 毫米塑料培养皿FisherFB0875712
60 毫米塑料培养皿FisherFB0875713A
塑料洗瓶Fisher03-409-10E
蛋白酶 KMillipore-Sigma10165921001
Tween-20VWR200002-836

参考文献

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RNA Nodal
从斑马鱼胚胎中制备原始囊胚外植体
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