本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据 离体这三种成像模式的整合实现了上述同步测量。
本文内容
摘要
摘要
在心肌细胞中，细胞内Ca2+ 瞬变激活收缩性肌丝，引起收缩、宏观缩短和几何形变 变形。由于无法直接观察肌肉内部，也无法精确追踪兴奋-收缩耦联动力学的时空特性，我们对这些事件之间内在关系的理解一直受到限制。为解决这些问题，我们构建了一种集成了多种成像模态的装置。具体而言，该装置整合了一台明场显微镜，用于测量肌节长度和组织应变的局部变化；一台荧光显微镜，用于可视化钙离子2+ 瞬态，以及光学相干断层扫描仪用于捕捉组织的几何结构 心脏周期内随时间变化的成像基础设施及相关数据采集框架。数据采集自称为肉柱的离体条状组织结构。在我们的仪器中，一对位置可控的铂金钩固定组织两端 离体 在持续用富含营养的生理盐水溶液灌流肌肉样本的同时，通过两个独立控制的钩子实现对肌肉长度和张力的实时调控。沿长度方向的平移运动可对样本进行分段扫描，从而克服显微镜成像窗口（540 µm × 540 µm）与典型小梁肌长度之间相对尺寸不匹配所带来的限制。>2000 µm）。肌肉腔两端的铂电极以用户设定的频率刺激心肌小梁。我们利用该刺激信号作为触发信号，用于同步各个成像窗口的数据，从而重建稳态条件下整个样本的收缩过程。对这些明场成像数据应用图像处理技术，可获得组织位移和肌节长度图谱。此类数据集合若整合至实验-建模流程中，将有助于深入理解生理与病理生理状态下肌肉收缩的均一性与非均一性。
引言
灌流离体心脏肌肉组织样本是研究心肌离子激活与力学特性的标准且广泛应用的实验方法1。特别是从心室壁分离出的条索状结构——小梁肌的制备，使得研究人员能够评估包括收缩的长度依赖性激活2、收缩的牵张依赖性反应3,4以及心肌组织舒张期黏弹性5在内的多种生理现象。该离体小梁肌灌流技术的开创者Ter Keurs最初结合使用荧光成像技术测量Ca2+浓度，以及激光衍射技术测定肌节长度2,5。自这些早期研究以来，利用基于二维快速傅里叶变换（FFT）的方法对明场显微图像进行分析，以更高空间分辨率提取肌节长度信息，已成为越来越普遍的做法6。这两种成像系统的结合应用，可部分揭示Ca2+释放与肌节长度依赖性张力产生之间的内在关系。
心肌具有横纹，其可见的条带结构与由粗肌丝和细肌丝组成的收缩单位的有序排列相关。构成肌节的这些肌丝之间的相互作用是力量生成的基础，该过程启动如下： a 去极化电信号，即动作电位，引起电压依赖性L型Ca2+ 细胞膜上的通道打开； 随之而来的细胞内Ca²⁺流入2+ 诱导 Ca 的释放2+ 来自肌质网（SR），一种细胞内钙2+ 储存，这一过程称为 Ca2+诱导的 Ca2+ 释放7；细胞内 Ca²⁺ 浓度的这种突然升高2+ 浓度在纳摩尔至微摩尔范围内即可启动力的产生； Ca2+ 泵持续挤出 Ca2+ 从胞质溶胶返回肌浆网和细胞外区室； 当细胞内 Ca2+ 当浓度恢复至纳摩尔范围时，肌肉停止产生力量并随之舒张。在力量产生过程中，粗细肌丝相互滑动。肌节长度决定了两者重叠的程度，从而宏观上决定了肌肉产生力量的潜力。
本文将这些荧光-明场成像技术进一步扩展，以结合光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）。OCT 利用光的干涉物理原理，能够获取组织的几何形变，从而研究肌肉收缩的异质性8。我们的设备（图1）采用的是谱域 OCT（spectral-domain OCT, SD-OCT）系统。在 SD-OCT 中，一个分束器将来自宽带短相干长度超辐射发光二极管的光分为参考臂和测量臂。参考臂包含一个固定镜面，测量臂则包含一个二维检流计用于引导光束。从样品返回的散射光被收集后，与参考臂中反射的光发生干涉，形成干涉图样。深度信息被编码在光谱条纹的频率中。为了提取这些信息，信号通过光谱仪，然后对结果进行逆快速傅里叶变换（inverse FFT）。相应的 1D 信号代表不同深度的结构，对应于折射率的变化9（A-scan）。通过沿单一轴线偏转激光，可以构建出感兴趣样品的横截面图像（B-scan）；类似地，通过在另一轴向上以步进方式重复该过程，可生成三维图像（C-scan）。进一步地，基于外部触发信号，可在同一切片位置连续采集一系列 B-scan，用于呈现具有时间变化特征的重复性样本，并重复该过程以生成三维扫描图像，从而表示一幅随时间变化的平面图像10。
在整合三种成像系统时，我们考虑了以下两个原则。第一，成像传感器不应检测到来自其他成像模式的光信号；第二，物理设计应至少为三个同时进行的成像平面预留自由空间。为满足第一个要求，明场显微镜采用波长为660 nm的LED光源，在倒置构型下对样品进行照明。荧光显微镜采用落射荧光构型，使用同一物镜进行激发光照射和发射光收集。激发光波长范围为340 nm至380 nm，而发射光由光电倍增管（PMT）在510 nm波长处检测。一对二向色镜使这两条光学路径能够在不干扰彼此测量的前提下共享相同的空间位置（图2）。最后，光学相干断层扫描（OCT）使用中心波长为840 nm、光谱宽度为100 nm的宽带光源，该波长与其他两种成像方式明显不同。由于OCT所用光源具有低相干性，来自明场-荧光光源的任何散射光均不会影响编码深度信息的干涉图样。为满足第二个要求，毛细管的外壳设计使得样品的前侧、下侧和上侧平面均具有可访问的光学通路。在实验过程中，两根铂金钩将一条小梁肌固定于充满含氧克雷布斯-亨塞尔莱特（KH）溶液的毛细管内。OCT的检流计扫描头被正交地安置于明场-荧光成像光路，以利用第三个正交的光学平面（图3）。
本文概述了构建一种能够同时成像钙离子、肌节长度和肌肉几何结构装置的设计考量。为展示这些测量能力，我们描述了心室小梁肌的分离过程、所需缓冲溶液的配制，以及组织处理和荧光染料加载过程中的关键步骤 离体 小梁。最后，本文概述了将数据集转化为更具实用性的可视化图像所需的过程。
方案
奥克兰大学动物伦理委员会已批准大鼠的处理及组织样本的制备。
1. 成像校准
- 明场显微镜像素校准
- 用蒸馏水填充测量室。
- 放置一个已知每毫米刻线数的衍射光栅 µ进入测量室。
- 按 F1 键以启用采集并进行调整 帧率 [Hz] 直到衍射光栅清晰可见（图4A）。确保衍射光栅与框架边缘平行。按压 F1 再次点击以停止采集。
- 设置 需要采集的总图像数？ 到一，按压 Ctrl + Shift + S 将数据流式传输至磁盘，并按下 F1 以捕获衍射光栅的图像。
- 打开 ImageJ 并导入衍射光栅图像（文件 > 开放 > 选择校准图像按住 shift 键，绘制一条包含衍射光栅中 20 个明暗条带的直线。
- 校准图像（分析 > 设定比例尺步骤1.1.5中线条的长度决定了 像素距离 值。设置 已知距离 将值设置为线数的20倍 µm 测量与 长度单位 至 µm. 尺度的倒数表示每个像素所代表的微米数。
- OCT 深度分辨率校准
- 使用游标卡尺测量玻璃显微镜载玻片的厚度。
- 打开OCT激光光源。
- 覆盖振镜头并单击 获取背景 用于测量背景干涉图样并从测量结果中将其扣除（图4B).
- 将已测量的玻璃载玻片（来自步骤1.2.1）夹紧在光学相干断层扫描仪（OCT）的测量臂中。
- 点击 实时直播 查看OCT图像。调整玻璃显微镜载玻片，直至其在B扫描中可见。
- 为了获取B扫描图像，设置 范围 Y（步数） 到其中一个，单击 B扫描数据流？，然后单击 采集.
- 将B-scan图像导入ImageJ（文件 > 开放 > 选择B扫描按住 shift 键，在玻璃载玻片的边界之间画一条线。
- 设置比例尺（分析 > 设置比例尺）。设置 已知距离 与步骤 1.2.1 中采集的测量数据进行比较。
- 为计算空气中的深度分辨率，需校正显微镜载玻片的折射率（n玻璃 = 1.5175)11 通过将每个像素的测量值乘以 n玻璃.
注意： n玻璃 引述的数值适用于硼硅酸盐玻璃。显微镜载玻片可由不同材料制成。应根据所用载玻片的实际材料选择相应的折射率。 - 为对心肌的深度分辨率进行标度，将步骤 1.2.9 中的数值除以 n心肌 = 1.38（先前报道的值）12).
2. 肌肉样本制备
- 准备解剖装置。
- 取适量解剖液（见表1）倒入小型金属容器中，并在心脏摘除前约一小时放入冰箱冷冻。
- 搭建解剖装置，确保解剖液充分氧合（100% 氧气），并已流经各段管路。用氧合的解剖液填充解剖腔，并在灌注导管上松散地绑上3/0缝合线。
- 摘除心脏。
- 使用气态异氟烷（氧气中浓度＜5%）对8-10周龄的Wistar大鼠进行麻醉。通过夹捏尾巴确认麻醉效果。
- 将麻醉后的大鼠仰卧位固定，并在腹部皮下注射肝素溶液（1000 IU/kg）。维持麻醉状态5分钟，使肝素充分循环。
- 从冰箱中取出盛有解剖液的金属容器，放置于安乐死操作台附近。
注：避免解剖液完全冻结，以确保摘除的心脏能够完全浸没。 - 将麻醉后的大鼠转移至安乐死操作台，通过颈椎脱位实施安乐死。
- 用剪刀打开大鼠胸腔，先沿肋骨下缘剪开体壁，再剪开膈肌，然后沿肋骨侧缘继续剪开，将胸廓抬起移开。
- 一手握住心脏，另一手使用弯头剪刀剪断连接的血管（主动脉、静脉等）。
- 迅速将心脏浸入冷的解剖液中。
- 分离一条乳头肌小梁。
- 当心脏置于金属容器中时，辨认主动脉，随后将心脏转移至解剖腔。使用两把弯头镊子将主动脉套入灌注插管上。
- 用一把镊子固定主动脉，同时打开管路，使解剖液流经灌注插管。
注：应在心脏摘除后一分钟内完成灌注。 - 当冠状血管系统中的血液被清除，且心脏完全被解剖液灌注后，停止灌注，用缝合线固定主动脉。重新开启灌注，对插管后的心脏继续灌注。
- 旋转插管，使左冠状动脉位于上方可见位置。将心脏心尖部用针固定于解剖腔底部（图5A），切除左右心房（图5B）。
- 使用弹簧剪刀沿室间隔右侧剪至心尖部（如图5B所示）。将打开的左心室固定于解剖腔底部。再沿室间隔左侧剪开，打开右心室，并同样将其固定于解剖腔底部（图5C）。
注：为使心室保持开放状态固定，需剪断部分乳头肌。在右心室内辨认一条游离的乳头肌小梁（图5D-E）。 - 使用弹簧剪刀和镊子，剪除小梁周围的壁组织，然后垂直于小梁走向将壁组织对半切开。修剪壁组织至适合所用安装构型的尺寸，本例中约为芝麻大小的一半（图5F）。
注：乳头肌小梁可从左右心室分离，但左心室来源的小梁通常更浑浊，不适用于肌节和几何测量。 - 将分离后的小梁保留在解剖腔中，持续用解剖液灌流。
3. 实验方案
注意：本实验所使用的设备13为实验室自主搭建，采用定制化控制代码。若要设计可重复上述数据的装置，需考虑以下要素：两个独立驱动的固定钩、一个具有三个光学通透轴的测量腔室（图3），以及一条外部触发信号线，用于将明场与光学相干断层成像（OCT）相机和刺激器同步。光电倍增管（PMT）电压和力信号通过模拟数据采集（DAQ）卡采集，OCT和明场显微镜的图像通过Camera Link图像采集卡采集，刺激信号则通过数字I/O卡采集。数据通过一组生产者-消费者循环结构离线存储，以保持时间同步性。
- 准备心肌测量仪。
- 依次用热水（约 60 °C）、蒸馏水（室温）和灌流液冲洗测量腔室。持续用碳合气（carbogen）对灌流液进行鼓泡。
- 打开明场显微镜照明光源，按下 F1 以启用图像采集（图 4A）。手动调节下游钩针，使其位于明场图像中央。点击 Zero Downstream Axis，然后点击 Downstream Disabled 以启用电机（图 4C）。移动 DS Setpoint [um] 滑块，使钩针末端与默认感兴趣区域的边缘对齐。
- 重新将下游轴归零，然后将 DS Setpoint [um] 滑块移至 1000。对上游钩针重复此过程，但不要移动 US Setpoint [um] 滑块。
- 点击 Move to Mounting（图 4C）。
- 通过切换 Lamp 开关启动荧光照明系统，然后迅速通过切换 Main 开关启动控制器子系统。
NOTE: 某些紫外光源会产生大量臭氧。若如此，请将臭氧抽吸装置连接至光源的排气口，并在开启荧光照明源之前确保其正常运行。 - 按前面板上的 Mode 按钮，随后按 2，再按 1，将操作模式切换至 Turbo-Blanking。按下 On-line 按钮，使控制代码能够通知运行状态。
- 安装小梁肌。
- 暂停测量腔室中的灌流液流动。用解剖液填充安装腔室。
- 使用 1 mL 注射器，将小梁肌从解剖腔室转移至安装腔室（图 5G）。
- 转移小梁肌时，将注射器垂直放置并接触安装腔室液面。让小梁肌在重力作用下自然沉入安装腔室（图 5H）。
- 降低安装腔室中的液面，使其与钩针中段齐平。
- 通过移动 DS Setpoint [um] 滑块，调节两钩针之间的距离，以匹配小梁肌的松弛长度。
- 借助显微镜辅助观察，用镊子轻轻夹住一端组织，将其固定在上游钩针上。将另一端组织固定在下游钩针上（图 5I）。
- 固定完成后，点击 Move to Chamber（图 4C），将小梁肌移回测量腔室（图 5J）。恢复灌流液流动和液体抽吸。
- 将 Stimulus frequency [Hz] 设为 1，Stimulus duration [ms] 设为 10，Stimulus Voltage 设为 10。按下 Stimulus On? 开始刺激。
- 准备小梁肌。
- 经过约 1 小时的适应后，逐步将刺激电压和刺激时长分别以 1 V 和 1 ms 为步长降低。典型设定值为 3 V 和 3 ms。
- 打开明场照明系统。按下 F1，在用户界面上选择一个包含条纹区域的感兴趣区域。点击 Compute SL?，计算高亮区域的平均肌节长度。通过增加 Separation Setpoint [um] 滑块，延长肌肉长度，直至平均肌节长度达到 2.32 µm。
NOTE: Compute SL? 使用第 4.3 步中所述的二维 FFT 方法。用于计算平均肌节长度的感兴趣区域通常为 100 µm 至 150 µm 的正方形。因此，当肌肉接近最佳肌节长度时，将使用 43 至 65 个肌节来计算平均值。 - 在“Centre and Separation Control ”选项卡中调节 Centre Setpoint [um] 滑块（图 4C），使下游钩针边缘刚好出现在明场图像中。采集十次收缩的荧光信息。
- 将 Centre Setpoint [um] 值增加 200，并再采集十次收缩的荧光信息。重复此过程，直至明场图像中包含上游钩针。采集最后一个窗口的荧光信息。
- 将 Centre Setpoint [um] 值设为 0，使小梁肌回到中心位置。
- 将刺激频率降至 0.2 Hz，并将灌流液从 KH 溶液切换至 Fura-2 负载溶液（详见 表 1）。
- 每 10 分钟点击一次“Stim and Data”选项卡中的 Enable Fluorescence Source，测量荧光信号。在“PMT Signal”选项卡中观察荧光信号。
- 当 360 nm 信号增强 10 倍或负载过程持续时间超过 2 小时后，将刺激频率恢复至 1 Hz，并切换回 KH 灌流液。
- 每 10 分钟检查一次比值测量结果，直至比值稳定，此时可开始数据采集。
- 采集明场与荧光成像数据。
- 将肌肉恢复至下游钩针边缘刚好出现在明场图像中的位置。在硬件控制用户界面的“Stim and Data”选项卡中，点击 Stream Data to Disk，开始流式记录硬件数据。点击 Enable Fluorescence Source 采集荧光信息。
- 在明场成像用户界面中，将采集模式设为外部触发，将帧率提高至 100 Hz，并将采集图像数量设为 100。按下 Ctrl + Shift + S，然后按 F1，记录该窗口的明场成像数据。
- 将 Centre Setpoint [um] 值增加 200，重复步骤 3.4.2。继续扫描流程，直至完成步骤 3.3.4 中最后一个窗口的数据采集。
- 将 Centre Setpoint [um] 值设为 0，使小梁肌回到中心位置。
- 采集 OCT 成像数据。
- 将主钥匙转至 | 符号，按下电源按钮，再按下 SLDs 按钮，开启 OCT 激光光源。
- 盖住检流计头部，点击 Get BG，测量背景干涉图样并从测量中扣除（图 4B）。
- 将图像采集模式设为实时预览。
- 调节 y-位置，使 B 扫描图像仅包含上游钩针。将控制前面板上显示的肌肉长度（图 4B）除以二，再减去当前 y-位置。将所得值输入“y-offset”输入框。调节“x-offset”值，使小梁肌的横截面在图像中居中。
- 小梁肌居中后，通过调节 y-位置沿 y-轴扫描，找到对应于上游和下游钩针的位置。记录这些位置。将 Set Range Y (steps) 设为这两个值之差的绝对值除以十。
- 将图像采集模式设为 Stimulus Triggered?，Range X (steps) 设为 100，点击 Set Active Parameters 按钮。
- 点击 Stream B-Scan Data?，然后点击 Acquire。
NOTE: 门控成像协议需要 200 次收缩，以采集长度为 2 mm 的样本的完整肌肉几何结构，对应采集时间约为 3 分 20 秒。
4. 处理明场图像数据集
- 准备图像以进行分析。
- 将图像导入 ImageJ文件 > 导入 > 图像序列 > 选择图像).
- 提高图像对比度（图像 > 调节 > 亮度/对比度 > 移动最小值和最大值滑块以使图像直方图居中).
- 锐化图像（流程 > 滤光片 > 反锐化掩膜 > 设置半径（Sigma） 至1.0像素 掩膜权重 (0.1–0.9) 至 0.6)
- 导出图像序列（另存为 > 图像序列 > 将格式设置为 PNG从0开始，数字（1-8）到4。
- 拼接图像，测量局部位移，并计算局部肌节长度。
- 开放 "TrabeculaProcessing.m" （应要求提供），并将 FolderPath 变量设置为包含所有数据的主文件夹，ImagePath 设置为保存步骤 4.1.4 图像序列的文件夹。将 sections 设置为成像窗口的数量，frames 设置为每个窗口采集的帧数。
- 运行代码。
注意：输出将位于用户指定的输出文件夹路径中。（默认路径为 FolderPath/Output）
- FFT 肌节长度技术
- 使用图像处理软件对肌节高度可见的图像区域进行傅里叶变换（FFT）。
- 将像素数相乘 µ步骤1.1.6的m校准结果乘以1.6 µ米和3.0 µ在计算逆变换以获取感兴趣空间频率范围之前。
- 对FFT结果拟合一个指数函数，忽略步骤4.3.2中计算的频率范围内的频率信息，并从变换结果中减去该指数拟合，以去除直流项。
- 对目标频带拟合高斯曲线。
- 计算高斯曲线峰值的倒数，即为该感兴趣区域的平均肌节长度。
注意：FFT 计算以及指数方程和高斯方程的拟合均通过定制的 LabVIEW 代码完成。
5. 处理荧光数据
- 从相应窗口中减去与窗口相关的自体荧光，并计算与340 nm和380 nm激发波长相关的信号的比值。
6. 处理OCT成像数据
- 为OCT图像集准备分割。
- 打开 ImageJ 并导入图像（文件 > 导入 > 图像序列）。在文件资源管理器窗口中，打开后找到图像，选择其中一张并单击 开放.
注意：如果光学相干断层扫描（OCT）的控制代码未将图像保存为 ImageJ 可读的格式，请将其转换为 PNG 格式。 - 为便于可视化，将图像序列组织为超堆栈（hyperstack）图像 > 超堆栈图像 > 堆栈转为超堆栈在打开的对话框中，将切片数设置为每切片的B扫描数，将X设置为沿小梁长度方向的切片数。
- 绘制一个矩形以框选肌小梁。通过使用超堆栈窗口中的滑块，确认该矩形在时间序列中始终包含肌小梁的完整体积。将图像裁剪至该窗口范围图像 > 裁剪).
- 移除包含安装钩图像的切片（图像序列 > 工具 > 切片保存器). 仅选择包含小梁组织信息的切片范围。
- 打开 ImageJ 并导入图像（文件 > 导入 > 图像序列）。在文件资源管理器窗口中，打开后找到图像，选择其中一张并单击 开放.
- 训练 WEKA 分割
- 打开 WEKA 分割（插件 > 分割 > 可训练的 Weka 分割).
- 将选择模式设置为手绘。
- 点击 设置 并调整分类器和训练设置。（本模型使用的训练特征如下：高斯模糊、Sobel滤波器、Hessian、高斯差分、膜投影、双边滤波和Lipschitz。膜厚度设为1，膜块大小设为8，最小sigma设为1，最大sigma设为32。分类器设为FastRandomForest，分类器选项设置为：batchSize 100，maxDepth 32，numFeatures 32，numThreads 0，numTrees 200。）
- 手动分割图像，直至训练结果达到满意的分割效果。
- 保存分类器。
- 分割处理后的B扫描图像
- 按照步骤 6.2.1 启动 WEKA 分割
- 加载第 6.2.5 步中的分类器。
- 点击 创建结果.
- 将图像转换为8位（图像 > 类型 > 8位).
- 将图像转换为二值图像（流程 > 二进制 > 生成二进制 > 默认方法和默认背景).
- 保存为图像序列（PNG）。
- 计算分割后的B扫描图像中的平均横截面积（CSA）。
- 统计二值化B扫描图像中白色像素的数量。
- 将像素面积乘以校准后的深度分辨率（来自步骤 1.2）再乘以 10 µm（相邻A扫描之间的距离）
- 在钩子之间的所有B扫描上重复此操作，并对测量结果进行平均。
- 将分割后的图像转换为网格。
- 开放 "OCTmain.m" （可根据需要提供），并将 imageDirectory 设置为包含第 6.3.6 步输出结果的文件夹。根据需要设置 outputPath。
- 将切片设置为以下值 "范围 Y（步）" （步骤 3.5.5）并将帧数设为指定值 "重复 X" （步骤 3.5.6），z_dim 为深度分辨率（步骤 1.2.10），x_dim & 将 y_dim 设置为 10。
- 点击 运行.
结果
为了获取此处所示心室小梁肌全长的区域性 Ca2+ 和明场信息，共需采集七个肌肉位置的图像。图6 表明，这种移动并未影响收缩力，说明主动收缩力的产生不存在位置依赖性。
使用光学相干断层扫描以100 Hz的速率采集的B扫描图像，通过ImageJ插件WEKA14进行分割（图7A）。由于横向分辨率（10 µm）与深度分辨率（心肌中为1.73 µm）不同，每个横截面均呈现扭曲。该扭曲通过将图像的深度轴按横向分辨率与深度分辨率的比值进行缩放而得以校正。图7B、C显示，在对小梁肌原始C扫描图像进行缩放后，其几何形状近似为圆柱形。测量室壁的反射信号有时会与肌肉数据重叠（图7A、B），但分割软件可经训练以校正此干扰（图7D、E）。完成分割后，可在整个收缩过程中计算肌肉长度方向上的横截面积（图7F）。需注意，该特定小梁肌上带有一个较小的分支突起，其运动在距小梁肌约0.75 mm处清晰可见。最后，分割后的图像可转换为网格，以辅助构建几何模型（图7G）。
以 100 fps 的速率在不同小梁不同位置采集的成像数据被拼接在一起，形成小梁的单个完整图像（图 8A）。这些图像的分辨率为 0.535 µm/像素。在相邻窗口的重叠区域使用线性加权函数有助于可视化，并最小化明场图像中存在的渐晕效应。为了测量荧光信号，以 600 Hz 的频率对小梁上一个 540 µm × 540 µm 的区域依次用波长为 340 nm、365 nm 和 380 nm 的光进行循环照射。由 340 nm 和 380 nm 激发光激发的发射荧光强度之比，反映了小梁经 Fura-2 负载后细胞内的钙离子浓度。由于该测量基于比值计算，有效测量速率为 200 Hz。每个窗口测得的平均（n = 10）细胞内 Ca2+ 瞬变信号与其成像区域对齐（图 8B）。尽管瞬变信号的峰值表现相对一致，但沿小梁 900 µm 至 1800 µm 区域内的舒张期 [Ca2+] 较低。类似地，位移追踪结果（图 8C）和肌节长度（图 8D）的计算结果也表明存在区域性差异。所使用的无标记追踪技术能够在具有足够对比度的情况下处理每个像素的位移。在映射肌节长度分布时，采用 128 像素 × 128 像素（约 67 µm × 67 µm）的互相关区域来计算局部肌节长度。当样本接近最佳肌节长度时，该区域大约包含 29 个肌节。在处理这些数据时，每个互相关窗口质心之间的步长（在 x- 和 y- 方向上）设定为 50 像素（约 26 µm）。肌节长度估计的可靠性根据对 FFT 信号进行高斯拟合的宽度和幅值进行检验。在小梁 0 µm 至 500 µm 的肌肉区域，这些条件未被满足，因此无法计算该区域的肌节长度信息。结合相关的位移数据推测，该区域的肌节在收缩期可能发生了拉长。与此推测一致的是，小梁右侧区域的平均肌节长度在该时期发生缩短。综合各图板提供的信息可见，横截面积最大的区域并未产生最强的收缩力。假设 Ca2+ 瞬变的区域性变化呈近似平滑梯度，则 图 8B 表明最大振幅的 Ca2+ 瞬变出现在沿小梁 1300 µm 至 1600 µm 之间的某处。位移图显示，运动幅度最小的区域与 Ca2+ 瞬变峰值区域高度吻合。然而，该区域的横截面积却是样本中最小的。基于这些数据，可以推断该区域产生了最大的应力。
图1：心肌细胞测量仪的标注图像。 各主要光学元件均已标出。插图为显微镜物镜的放大后视图 原位，位于测量室下方。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图2：明场与荧光显微镜同步成像的光路图。 荧光显微镜的照明光源为氙弧灯，其输出光在340 nm、365 nm和380 nm波长之间循环切换。弧光灯的输出光路中包含一个截止波长为409 nm的二向色镜，该镜将紫外光反射至一个镜面，再引导至荧光显微镜物镜。物镜将激发光聚焦到样品上，并收集波长更长（510 nm）的发射光。该发射光可透过第一个二向色镜，但无法透过第二个二向色镜（其截止波长为552 nm）。随后，场透镜将反射光聚焦至光电倍增管（PMT）的传感器上。与此同时，明场显微镜的照明光源（660 nm LED）位于样品上方。由聚光镜将透射光聚焦至样品，20×荧光物镜捕获相应的透射图像。明场照明所用波长超过每个二向色镜的截止波长，因此可同时透过两个二向色镜，最终成像于CMOS相机的传感器上。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3测量室支架设计 (A) 测量室支架的等距视图，叠加了光路。明场照明来自上方表面（z-轴）；荧光照明来自下方表面（z-轴），且光学相干断层成像测量臂的信号垂直于另一照明轴（y-轴）。实验过程中，两根铂金钩将一条小梁肌固定在玻璃毛细管内，该毛细管作为测量腔室。音圈电机控制每根钩子，其位置通过激光干涉测量法进行测定。系统将当前实际位置与用户设定的目标值进行比较，并利用现场可编程门阵列（FPGA）中编码的PID控制器，最小化偏差。B测量室 原位 在明场照明开启的情况下。后视图如下所示 图1 插图. (C) 灌流液流经测量室支架的示意图。灌流液从模块后部进入，并沿箭头所示方向流动。上游和下游电极建立电场刺激，以诱发测量室内固定的心室乳头肌收缩。蓝色阴影表示实验过程中灌流液流经的区域。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 4：图像采集与控制软件的前面板。（A）明场成像用户界面。（B）光学相干断层扫描（OCT）成像用户界面。（C）硬件控制用户界面。请点击此处查看该图的放大版本。
图5小梁解剖与安装操作流程 (A置于解剖腔中的离体灌流大鼠心脏。 (B) 同一心脏，已去除心房。虚线表示切开心室的切除路径。C) 打开心脏以暴露两个心室的内部结构。虚线框标示了小梁通常存在的区域。 (D) 切除的右心室壁区域（与 C 图中虚线框所示区域相同）。虚线标出了三条小梁。E从 D 中的三个小梁中选取的一个小梁。FE 面板中去除壁组织后的骨小梁。G) 1 mL 注射器末端分离出的肌小梁。H安装室中的小梁。I将小梁固定在两个铂金钩之间。J测量室中，位于挂钩之间的骨小梁图3B）。绿色斑点是第一块二向色镜滤光片产生的伪影。K测量室中安装的骨小梁的次级角度。骨小梁与显微镜物镜之间的距离约为 1 mm。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：力测量的位置依赖性。 来自各成像位置的肌肉产生的力（n = 7）叠加显示。平均主动产力为 0.527 mN ± 0.003 mN，达到50%收缩的时间为 77.1 ms ± 0.3 ms，达到50%舒张的时间为 328.1 ms ± 0.9 ms（所有数据均以均值 ± 标准误表示）。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：OCT成像分析。（A）WEKA分割示例。肌肉的分割横截面以红色突出显示，背景以绿色突出显示。（B）小梁原始C扫描数据的俯视图。图像顶部附近的亮斜线为测量室壁的反射。（C）小梁原始C扫描数据的侧视图。（D）分割后OCT数据的俯视图。（E）分割后OCT数据的侧视图。（F）沿小梁长度方向（x轴）随时间（y轴）变化的横截面积。沿肌肉长度的平均横截面积为0.0326 mm2 ± 0.0005 mm2（均值 ± 标准误）。（G）小梁的网格模型。该网格大致与F图中的横截面积图对齐。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：明场与荧光成像分析。（A）心室小梁的拼接图像（七个成像窗口）。（B）沿心室小梁长度方向的Ca2+瞬变。（C）每个成像窗口的平均x方向位移。正值位移表示向右运动，负值表示向左运动。（D）具有足够图像对比度的各成像窗口的平均肌节长度。请点击此处查看该图的放大版本。
表1：溶液表 请点击此处下载该表格。
讨论
在本研究中，我们提出一种配置方案，可集成包含明场、荧光和光学相干断层扫描（OCT）成像的三个光学系统，以采集正在主动收缩组织的多模态数据 离体 心室小梁（图1 和 图2）。这种协调一致的整合之所以能够实现，得益于测量室的设计（图3）以实现OCT与明场-荧光轴的正交排列。肌肉固定系统在同步量化表征心肌兴奋-收缩动态关键指标的成功中同样起着至关重要的作用。该系统的创新之处在于能够在对肌肉机械性能无明显干扰的情况下进行肌肉扫描操作。图6）。结合成像配置与用于力测量的电机钩系统，该系统可评估心肌细胞内钙信号的区域性异质性2+ 瞬时位移与肌节长度，以及在整个收缩时程中收缩小梁的宏观几何信息图7 和 图8).
鉴于明场-落射荧光成像系统在心脏研究实验室中的广泛应用，只需进行一些简单的硬件调整即可重现本研究结果。本文介绍了用于整合明场-落射荧光成像与光学相干断层扫描（OCT）的图像处理工具包，这对于分析潜在的收缩异质性至关重要。OCT 的集成需要一条无遮挡的光路，而门控成像则需要在刺激装置与 OCT 及明场成像相机之间连接外部触发信号线，同时还需要能够在整个测量腔室内移动样品的肌肉固定钩。所需的所有后期处理软件和方法均可免费获取。特别是所使用的分割软件 WEKA14 为开源软件。无标记材料点追踪技术8、肌节长度分析、门控三维成像10 以及网格生成代码同样可获取，并可根据要求向通讯作者申请获得。
肌肉活性、Fura-2 的最佳负载以及成像聚焦是成功实验的三大基础。使用含有 BDM 的解剖溶液以防止肌肉挛缩，通过注射器运输肌肉组织，持续对溶液进行氧合，以及在实验当天配制新鲜的实验溶液，这些措施均有助于实现较高的肌肉活性。在用 Fura-2AM 对小梁肌进行负载之前，必须针对所研究的每种条件采集自发荧光信号，因为自发荧光可能对测得的 Ca2+ 瞬变信号产生显著影响15。由于 Fura-2AM 负载溶液中需加入表面活性剂 Pluronic-F127 以促进染料负载，这使得溶液的氧合过程变得复杂。为应对该表面活性剂引起的过度起泡问题，在负载溶液中加入少量消泡剂可使操作者提高氧合速率，从而增加小梁肌在整个负载过程中维持功能活性的可能性。最后，成像聚焦必须沿肌肉全长保持均匀，以最大化明场和荧光信号的信噪比。
本研究所述方法存在两个局限性。首先是荧光显微镜的空间分辨率问题。尽管光学相干断层扫描（OCT）和明场成像的空间分辨率较高，但荧光显微镜的分辨率受限于在540 µm × 540 µm成像窗口内捕获的荧光信号体积的积分。可通过使用高增益电荷耦合器件（CCD）相机替代光电倍增管（PMT）来捕获荧光信号，从而提高荧光显微镜的空间分辨率，但代价是信噪比降低16。第二个局限性在于可研究的小梁直径，这关系到可测量的肌节长度和几何 深度。用于计算肌节长度的加窗快速傅里叶变换（windowed-FFT）方法虽具有提高空间分辨率的优势，但其鲁棒性有所降低（图8D）。当研究浑浊或大直径的小梁时，由于较大组织样本中肌节条带对比度降低，FFT的可分辨能力将显著下降。同样，在OCT成像中，成像深度超过300 µm时的背向反射信号在分割阶段将过于微弱而无法分辨。因此，本技术仅适用于直径小于300 µm的小梁。然而，不建议研究大直径样本，因为在高频刺激条件下，肌肉核心区域可能存在氧气扩散不足的问题17。
我们的方法能够评估健康和病变肌肉中与肌肉几何结构相关的离子力学功能，为深入理解心肌生理学、病理生理学和药理学提供了有力手段。本文所述的图像处理流程可提取关键数据，有助于更深入地理解收缩异质性。充分发挥此类丰富数据集潜力的一个途径是构建数学模型，以整合和解读这些数据，并利用我们的设备通过实验验证模型所做出的预测。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究获得了奥克兰大学博士奖学金（授予 JD 和 MC）、新西兰卫生研究理事会 Sir Charles Hercus 健康研究研究员项目（编号 20/011 和 21/116，分别授予 J-CH 和 KT）、新西兰国家心脏基金会博士奖学金（授予 AA）、新西兰皇家学会 Marsden Fast-Start 研究基金（编号 UOA1504 和 UOA1703，分别授予 J-CH 和 KT）以及新西兰皇家学会 James Cook 研究员项目（授予 AT）的资助。本仪器的最初开发由新西兰皇家学会 Marsden 基金（编号 11-UOA-199，授予 AT 和 PN）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,3-丁二酮单肟 | Acros Organics | 150375000 | |
| 20× 显微镜物镜 | Nikon | CFI Super Fluor 20× | NA 0.75 |
| 二维振镜 | Thorlabs | GVSM002/M | |
| 50-50 分束器 | Thorlabs | FC850-40-50-APC | |
| 90-10 分束器 | Thorlabs | TW850R2A2 | |
| 模拟输入模块 | National Instruments | NI-9205 | 以 200 kHz 采样 PMT 信号 |
| 明场成像光源 | CoolLED | PE-2 | 660 nm LAM |
| 宽带光源 | Superlum | Broadlighter-840 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cameralink 采集卡 | National Instruments | NI-1429 | 明场成像图像采集卡 |
| 碳酰气（5% CO₂ + 95% O₂） | BOC | 气体编号：181 | |
| 聚光镜 | Nikon | LWD 0.52 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Merck | 108337 | |
| 数据采集设备（DAQ） | National Instruments | NI-6259 | 触发振镜运动 |
| 二向色镜 1 | Semrock | FF409-Di03 | |
| 二向色镜 2 | Semrock | FF552-Di02 | |
| 衍射光栅 | Wasatch Photonics | 1200 线/mm @840 nm | |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Direct-Q 3 UV 系统 | Merck Millipore | ZRQSVR3WW | 纯水制备系统 |
| 干式恒温器 | Corning | 6875-SB | LSE 数字干浴器 |
| FIJI | ImageJ | 开源图像处理软件 | |
| Fura-2AM 五钾盐 | Thermofisher | F14186 | |
| 硬件 FPGA 卡 | National Instruments | NI-7813R | 同时控制明场图像采集的触发 |
| 肝素 | Pfizer | 61024 | |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| 倒置显微镜 | Nikon | TI-DH 照明支柱 | |
| 异氟烷 | MedSource | VAPDRUGISO250 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 线扫描相机 | Basler | spL2048-70km | 光谱仪相机 |
| 磁力搅拌器 | IKA | 3810000 | RCT basic |
| Matlab | Mathworks | 数据处理代码 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
| NaH2PO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 71505 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| OCT FPGA 卡 | National Instruments | NI-1483R | |
| 氧气瓶 | BOC | 气体编号：100D | |
| pH 计 | Mettler Toledo | MP220 | |
| 光电倍增管 | Hamamatsu | H7422-20 | |
| Powerload | Thermofisher | P10020 | |
| 超发光二极管 | Broadlighter | D-840 | |
| 跨阻放大器 | 定制 | ||
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Sigma-Aldrich | 252859 | |
| Wistar 大鼠 | Vernon Jansen Unit | 8 – 10 周龄 | |
| 氙弧灯 | Sutter Instrument | DG-4 | Lambda DG-4 |
参考文献
- Han, J. -C., et al. Energetics of stress production in isolated cardiac trabeculae from the rat. American Journal of Physiology. Heart and circulatory physiology. 299 (5), 1382-1394 (2010).
- Ter Keurs, H. E. D. J., Rijnsburger, W. H., Van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Shen, X., Cannell, M. B., Ward, M. L. Effect of SR load and pH regulatory mechanisms on stretch-dependent Ca2+ entry during the slow force response. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 63, 37-46 (2013).
- Dowrick, J. M., et al. The slow force response to stretch: Controversy and contradictions. Acta Physiologica. 226 (1), 13250(2019).
- Stuyvers, B. D. M. Y., Miura, M., Ter Keurs, H. E. D. J. Diastolic viscoelastic properties of rat cardiac muscle; involvement of Ca2+. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 13-28 (1997).
- Tang, E. J. L. P., Laven, R. C., Hajirassouliha, A., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Measurement of displacement in isolated heart muscle cells using markerless subpixel image registration. Conference Record - IEEE International Instrumentation and Measurement Technology Conference. , (2019).
- Bers, D. M. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
- Cheuk, M. L., et al. A method for markerless tracking of the strain distribution of actively contracting cardiac muscle preparations. Experimental Mechanics. 61 (1), 95-106 (2020).
- Lippok, N., Coen, S., Nielsen, P., Vanholsbeeck, F. Dispersion compensation in Fourier domain optical coherence tomography using the fractional Fourier transform. Optics Express. 20 (21), 23398(2012).
- Cheuk, M. L., et al. Four-Dimensional imaging of cardiac trabeculae contracting in vitro using gated OCT. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 64 (1), 218-224 (2017).
- Ritland, H. N. Relation between refractive index and density of a glass at constant temperature. Journal of the American Ceramic Society. 38 (2), 86-88 (1955).
- Tuchina, D. K., Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. Quantification of glucose and glycerol diffusion in myocardium. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 8 (3), (2015).
- Taberner, A., et al. A dynamometer for nature's engines. IEEE Instrumentation and Measurement Magazine. 22 (2), 10-16 (2019).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable Weka Segmentation: A machine learning tool for microscopy pixel classification. Bioinformatics. 33 (15), 2424-2426 (2017).
- Jiang, Y., Julian, F. J. Pacing rate, halothane, and BDM affect fura 2 reporting of [Ca2+](i) in intact rat trabeculae. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273 (6), 2046-2056 (1997).
- Miura, M., Boyden, P. A., Ter Keurs, H. E. D. J. Ca2+ waves during triggered propagated contractions in intact trabeculae. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 274 (1), (1998).
- Han, J. -C., et al. Radius-dependent decline of performance in isolated cardiac muscle does not reflect inadequacy of diffusive oxygen supply. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300 (4), 1222-1236 (2011).
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